孟小麗 李翠新

摘要 從蛹蟲草菌種的退化表現(xiàn)、早期的檢測方法、菌種退化的影響因素和退化菌種的復壯等方面對蛹蟲草菌種退化進行總結，以期為蛹蟲草菌種退化的研究提供新思路。

關鍵詞 蛹蟲草；菌種退化；檢測方法；影響因素；復壯

中圖分類號 S567.3+5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）13-0133-02

Detection Method and Influencing Factors of Strain Degradation of Cordyceps militaris

MENG Xiao-li，LI Cui-xin*

（College of Life Sciences， Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650051）

Abstract The strain degradation of Cordyceps militaris was summarized from the aspects of the degradation performance of strain， the early detection method， the influencing factors of the strain degradation and the strain rejuvenation of Cordyceps militaris，which provides a new idea for the study of the strain degradation of Cordyceps militaris.

Key words Cordyceps militaris；Strain degradation；Detection method；Influencing factors；Rejuvenation

蛹蟲草（Cordyceps militaris），即北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式菌，分類學上屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）肉座菌目（Hypocreales）蟲草菌科（Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）[1]。蛹蟲草是一種新資源食品，它富含許多種營養(yǎng)與活性成分，其中有蟲草素、蟲草酸、多種人體必需氨基酸、微量元素、維生素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等[2-3]，這些活性成分使得蛹蟲草具有抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤以及提高人體免疫力的功效[4-5]。蛹蟲草和冬蟲夏草是同屬異種的食藥用真菌，有研究表明，蛹蟲草的蟲草素、K、Ca、Se、維生素等對人體有益的活性成分含量高于野生冬蟲夏草[6-7]。

蛹蟲草是一種極好地研究真菌退化機理的材料。如今，人工培育蛹蟲草的技術相對成熟并且已經(jīng)走入工廠進行產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)，具有非常廣闊的市場前景，但在生產(chǎn)實踐中，蛹蟲草的菌種極易發(fā)生退化，一般只能使用半年不到，有的只是傳種幾代就會產(chǎn)生嚴重的退化現(xiàn)象，表現(xiàn)出來的特征大多為不長或是只能長出非常少量的子實體，而且子實體的質量極差，給實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)栽培帶來了極大的風險[8]。因此，如何解決蛹蟲草菌種容易退化的問題，是國內(nèi)外學者研究的熱點，而關于其退化的遺傳機理方面的研究很少[9]。筆者從蛹蟲草菌種的退化表現(xiàn)、早期的檢測方法、菌種退化的影響因素和退化菌種的復壯等方面對蛹蟲草菌種退化進行總結。

1 蛹蟲草退化的表現(xiàn)

在人工栽培中，退化的表現(xiàn)有白臉現(xiàn)象、產(chǎn)生絨狀菌絲、氣生菌絲旺盛、吐黃水現(xiàn)象、子實體分叉或畸形（圖1）。用顯微鏡對蛹蟲草的菌絲進行觀察，蛹蟲草正常的菌絲較為粗壯挺立、分生孢子為念珠狀，而退化的菌絲比較纖細彎曲，分生孢子為頭狀或山丘狀[10]。退化菌種的子實體頂端及上部子囊殼有很多，正常菌種的子實體頂端及上部只有少量或沒有子囊殼[11]。

2 早期檢測方法

2.1 脫色能力測定

利用溴百里酚藍（BTB）作為指示劑，通過比色的方法能較為簡單地檢測出金針菇的退化菌種，且其檢測效果比較顯著[12]。林清泉等[13]將該方法用于蛹蟲草菌種的測定中，發(fā)現(xiàn)退化菌種與正常菌種經(jīng)培養(yǎng)后顯示不同的顏色，退化菌株對合成染料BTB的脫色能力明顯低于正常菌株，在脫色率上也表現(xiàn)出差異，且菌液顏色、脫色率與pH密切相關，在pH調(diào)節(jié)能力方面正常菌株強于退化菌株，呈現(xiàn)出較淺的顏色和較高的脫色率，表明該方法可以作為快速鑒定蛹蟲草退化菌株與正常菌株的檢測手段。

2.2 脫氫酶活性測定

由于脫氫酶的活性可以顯示出細胞活性的強弱，林清泉等[13]測定了不同蛹蟲草菌種的脫氫酶活性，結果發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下蛹蟲草菌種的酶活性高于退化菌種的活性，且在所測定的蛹蟲草菌種中，正常菌種能形成正常的蛹蟲草子實體而退化菌種不能形成正常的子實體，這與脫氫酶活性的測定結果一致。黃春花等[14]對蛹蟲草TTC-脫氫酶測定的條件進行了改良，使用培養(yǎng)6 d之后的蛹蟲草菌液經(jīng)4次生理鹽水洗滌后，配制成0.15 g/mL的待用菌液；反應緩沖液是Tris-HCl，最適宜pH是8.4；最適反應溫度是37 ℃、最適反應時間是3 h；酶促反應完成后及時把樣品放置冰上，在4 ℃溫度下離心后再用無菌水洗2次，用無水乙醇萃取后便可測定其吸光度，得到脫氫酶活性。因此，脫氫酶活性可以提早檢測出退化的菌種，避免大規(guī)模培養(yǎng)過程中退化菌種的誤用導致產(chǎn)生損失。

3 遺傳背景因素

3.1 核相

有研究表明，蛹蟲草核相發(fā)生了改變（異核體變成了同核體）會導致其菌種的退化，不能正常形成子實體[10，15]。正常的蛹蟲草菌種是含有兩類交配型基因的異核體，而退化的菌種是只含有其中一類交配型基因的同核體，只有當可親和的初生同核菌絲體之間發(fā)生質配后，形成含有兩類交配型基因的異核體，才能具備產(chǎn)生子實體的能力[10，15]。

3.2 基因突變

菌種的退化許多是由于基因突變引起的。使用PCR-RFLP與RAPD的方法，李美娜等[10，16]對野生蛹蟲草及其退化菌種的基因進行了分析，結果顯示，在5.8S+ITS區(qū)段，正常蛹蟲草菌種和退化菌種最少有2個位點有差異，且退化菌種在第279和第360個堿基處發(fā)生了T到C的堿基點突變，所產(chǎn)生的這些突變很有可能與蛹蟲草菌種退化的基因相關。

3.3 活性氧

蛹蟲草菌種的退化也可能是受到活性氧與其引導的氧化應激的影響，活性氧是引起細胞凋亡的信使因子與效應因子，當蛹蟲草機體處在氧化應激狀態(tài)時，其細胞中的活性氧含量就會提高，蛹蟲草機體就會處在易損狀態(tài)，同時能使致病因素的毒性作用增強，可引起基因突變[17]。熊承慧等[18]克隆了來自構巢曲霉的谷胱甘肽過氧化物酶基因，通過真菌轉化方法分別轉化到已經(jīng)退化菌種ZYF和能夠正常結實的菌種CM01中進行過量表達，能夠使已經(jīng)退化的蛹蟲草菌種恢復產(chǎn)生子實體的能力，而正常的蛹蟲草菌種可以在繼代培養(yǎng)過程中保持其性狀的相對穩(wěn)定，表明清除真菌細胞內(nèi)的活性氧能夠減緩其氧化脅迫水平，從而改善蛹蟲草菌種退化的現(xiàn)象。

4 外界培養(yǎng)因素

4.1 蛹蟲草菌種的保藏

在人工栽培的過程中，對蛹蟲草菌種的保藏一般用低溫試管菌種進行保藏，但通常半年后菌種就發(fā)生了退化，不產(chǎn)子實體或產(chǎn)生少量畸形子實體。有研究表明，保藏時間的長短與蛹蟲草菌種的退化有一定的關系，保藏時間在30 d內(nèi)的蛹蟲草菌種的性狀較為穩(wěn)定，基本沒有退化；保藏60 d后的菌種在栽培后，其性狀表現(xiàn)出明顯的差異，隨著保藏時間的延長其退化的程度逐漸加劇[19]。蛹蟲草菌種的保藏溫度也會影響其退化的速度，溫度高其退化的速度就快，反之，溫度低蛹蟲草菌種退化慢，其保藏的時間也可相應延長。采用4 ℃恒溫保藏的時間沒有進行溫差保藏（白天10 ℃與晚上5 ℃）的時間長，有少量散射光的保藏條件比黑暗保藏條件更有利于蛹蟲草菌種的保藏。

4.2 無性繁殖的轉管次數(shù)

在大規(guī)模生產(chǎn)中，為了降低生產(chǎn)成本，最常用的做法就是采用轉管傳代的方法來生產(chǎn)蛹蟲草蟲草菌種，實際證明蛹蟲草菌種轉管傳代超過3次以上，菌絲生長速度會下降，見光轉色能力會變差，子實體的產(chǎn)量明顯下降直至不產(chǎn)子實體[20]。因此，在生產(chǎn)和試驗中必須注明菌種的繁殖代數(shù)，以免生產(chǎn)上出現(xiàn)不必要的損失[21]。

5 退化菌種的復壯

由于蛹蟲草在人工栽培過程中使用的菌種很容易就退化了，故很難對已經(jīng)退化的菌種進行直接復壯。西南林業(yè)大學生命科學學院實驗室嘗試了改善其營養(yǎng)方式的方法進行復壯，雖然適當含量的氮源和亞硒酸鈉對蛹蟲草子實體的產(chǎn)生有很好的促進作用，但并不能改善退化菌種的退化性狀。因此，蛹蟲草的復壯通常是可通過野外重新采集、生產(chǎn)選育來解決的[22]，其方法主要有組織分離法、孢子分離法、蟲體回接法[8，23]。

6 展望

蛹蟲草的人工栽培進入了產(chǎn)業(yè)化，市場對蛹蟲草子實體的需求也極大地增加了，但生產(chǎn)中蛹蟲草菌種退化極快，子實體質量不穩(wěn)定；蛹蟲草有很高的食藥用價值，不少研究在篩選優(yōu)良菌種，利用其菌絲生產(chǎn)其藥性成分，但優(yōu)良菌種極易退化。因此，有效地解決蛹蟲草菌種的退化問題迫在眉睫。建立完善不易退化的蛹蟲草菌種選育體系，有利于蛹蟲草的生產(chǎn)實踐。要從根本上解決退化問題，還是要研究蛹蟲草的退化機理，可以結合其生長和代謝的相關基因進行研究，也可以對蛹蟲草退化的代謝組和轉錄組進行研究。

參考文獻

[1] 黃年來，林志彬，陳國良，等.中國食藥用菌學[M].上海：上?？茖W技術文獻出版社，2010：1761-1772.

[2] 宋江峰，劉春泉，李大婧，等.北冬蟲夏草多糖活性研究進展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2006（4）：145-147，148.

[3] 劉春泉，李大婧，劉榮.蒽酮-硫酸法測定北冬夏草多糖含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2006（2）：122-124.

[4] 孟兆麗，朱凱，馮云，等.蛹蟲草多糖抑菌及抗氧化作用研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（9）：31-33.

[5] 姜泓，劉珂，孟舒.人工蛹蟲草子實體化學成分研究[J].藥學學報，2000，35（9）：663-668.

[6] 韋會平，肖波，胡開治.蛹蟲草藥用價值考[J].中藥材，2004，27（3）：215-217.

[7] 鄭波，翁硯，翁麗麗.蛹蟲草與冬蟲夏草的含量測定研究[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2011，27（2）：290-291.

[8] 李亞潔，王鶴，孟楠，等.蛹蟲草菌種復壯技術的研究[J].食用菌，2006，28（2）：18-19.

[9] 李光榮，文庭池，康冀川，等.蛹蟲草表型多態(tài)性對子實體產(chǎn)生及蟲草菌素的影響[J].微生物學通報，2011，38（3）：370-382.

[10] 李美娜，吳謝軍，李春燕，等.人工栽培蛹蟲草退化現(xiàn)象的分子分析[J].菌物系統(tǒng)，2003，22（2）：277-282.

[11] 李學軍，都興范，王林美，等.蛹蟲草中蟲草素的提取及純化工藝研究[J].生物技術，2012，22（5）：75-78.

[12] MAGAE Y，AKAHANE K，NAKAMURA K，et al.Simple colorimetric method for detecting degenerate strains of the cultivated basidiomycete Flammulina velutipes（Enokitake）[J].Applied and environmental microbiology，2005，71（10）：6388-6389.

[13] 林清泉，丘雪紅，鄭壯麗，等.蛹蟲草退化菌株的特征研究[J].菌物學報，2010，29（5）：670-677.

[14] 黃春花，鄭壯麗，梅彩英，等.蛹蟲草TTC-脫氫酶測定方法的優(yōu)化[J].環(huán)境昆蟲學報，2011，33（3）：321-328.

[15] LI L，PISCHETSRIEDER M，ST LEGER R J，et al.Associated links among mtDNA glycation，oxidative stress and colony sectorization in Metarhizium anisopliae[J].Fungal genetics and biology，2008，45（9）：1300-1306.

[16] 李美娜.人工栽培蛹蟲草（Cordyceps militaris）性狀變異的遺傳學分析[D].大連：遼寧師范大學，2003.

[17] OZAKI M，DESHPANDE S S，ANGKEOW P，et al.Inhibition of the Rac 1 GTPase protects against nonlethal ischemia/reperfusion-induced necrosis and apoptosis in vivo[J].FASEB Journal，2000，14（2）：418-429.

[18] 熊承慧，夏永亮，李琳，等.基因工程方法改善蛹蟲草菌株繼代培養(yǎng)穩(wěn)定性[C]//中國菌物學會第五屆會員代表大會暨2011年學術年會論文摘要集.廣州：中國菌物學會，2011.

[19] 方華舟，董海波，肖習明，等.保藏溫度、時間及代次對蛹蟲草菌種質量的影響[J].荊楚理工學院學報，2011，26（2）：5-10.

[20] 胡中娥，鐘國祥，沈愛喜，等.北冬蟲夏草組織分離及復壯菌種的試驗研究[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2013，25（10）：124-125，134.

[21] 沈愛喜，胡中娥，李小云，等.北冬蟲夏草菌種退化原因及防控方法[J].食用菌，2013，35（4）：28-29.

[22] 李翠新，張國慶，何永珍，等.野生蛹蟲草的分離與高產(chǎn)菌株的篩選[J].中國食用菌，2007，26（2）：20-21.

[23] 薛建娥，冉翠香.蛹蟲草人工栽培種的分離與復壯[J].食用菌，2002，24（2）：17-18.