何昀潞++羅彥波++陳歡++侯宏衛(wèi)++胡清源+

摘要穩(wěn)定同位素標記衍生化 （Isotope coded derivatization，ICD）是通過化學衍生化反應對目標物的特定官能團進行同位素標記的技術，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LCMS/MS），可對具有相同標記反應特性的生物分子進行系統(tǒng)分析。該技術可以有效解決復雜生物基質(zhì)分析中靈敏度不足與定量分析中同位素內(nèi)標化合物有限的問題，近年來在代謝組學研究領域得到了廣泛的應用。本文介紹了ICD方法及試劑的設計，對近年來針對羧基、氨基、羰基、巰基和羥基的ICD試劑以及結(jié)合LCMS/MS在生物樣本中小分子代謝物分析的研究進展進行了評述。

關鍵詞同位素標記； 衍生化； 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 代謝物； 生物樣本； 評述

1引 言

小分子代謝物作為人體內(nèi)生物過程的中間體和終產(chǎn)物，是正常生理過程、病理過程以及對治療干預的藥理學反應的重要指標＼[1＼]。研究體液和組織中小分子代謝物水平的變化，可深入了解代謝通路和疾病機制并有助于疾病的診療與預后。但復雜生物樣本中的代謝物，一般含量較低，基質(zhì)對分析和測定的干擾較大，直接對其進行分析往往難以達到理想的檢測要求。而衍生化可以通過化學反應改變目標化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，將難于分析檢測的目標物定量地轉(zhuǎn)化為更適合特定分析的化合物＼[2＼]。隨著對生命科學領域研究的不斷深入，代謝組學研究中對小分子代謝物的定量分析日益重要?；谕凰貥擞泝?nèi)標化合物的同位素稀釋法可獲得精準可靠的絕對定量分析結(jié)果，但同位素內(nèi)標物合成困難且昂貴，商品化的種類有限，難以獲取所有目標分析物的同位素內(nèi)標是不現(xiàn)實的，從而限制了該定量方法的廣泛應用＼[3＼]。

近年來，為了克服對同位素標記內(nèi)標化合物的依賴，一些課題組采用穩(wěn)定同位素標記衍生化（Isotope coded derivatization，ICD）技術＼[4～7＼]，通過衍生化反應分別向生物樣本及其對照組引入化學結(jié)構(gòu)相同，但質(zhì)量不同的穩(wěn)定同位素標簽，再利用LCMS/MS對兩組樣本進行比較，確定目標物的含量變化。這種標記方法使具有相同官能團的一類分析物同時獲得相應的同位素衍生物，將同位素標記的分析物作為內(nèi)標可以提高定量分析的精確度和準確度，并解決同位素內(nèi)標物獲取困難的問題。此外，ICD借助衍生化反應引入的同位素標簽，能夠增加分析物的電離效率，改善其在LCMS/MS中的色譜質(zhì)譜行為，提高方法的靈敏度與選擇性＼[8～10＼]?；贗CD的LCMS/MS方法能夠?qū)碗s生物基質(zhì)中具有相同標記反應特性的生物分子進行定量分析、差異分析及譜圖分析，具有廣泛的應用前景?，F(xiàn)已有數(shù)篇關于小分子代謝物＼[3， 11～15＼]和定量蛋白組學＼[15～17＼]等方面的ICD綜述，而本文是以ICD試劑靶向的目標物官能團進行分類，以ICD試劑為導向，總結(jié)了近幾年報道的ICD試劑及其結(jié)合LCMS/MS在動物樣本中小分子代謝物的最新進展。

2穩(wěn)定同位素標記衍生化技術

ICD最早出現(xiàn)在蛋白組學相對定量研究中，主要用于鑒定和定量分析不同時期生物樣本中蛋白質(zhì)表達的差異。隨著新型ICD試劑的不斷出現(xiàn)，該技術已擴展到代謝組學和轉(zhuǎn)化醫(yī)學等領域。這種標記策略將化學反應與生物分析有機結(jié)合在一起，產(chǎn)生了更大的實際應用價值。

ICD技術是以待分析物的目標基團為反應活性部位，通過特定的化學反應使其與ICD試劑相連，從而將不同同位素標記形式的質(zhì)量差異標簽引入到目標物中。應用ICD進行相對定量分析的基本原理是：輕質(zhì)和重質(zhì)同位素標記試劑分別與兩份樣本中的目標物進行衍生化反應，按比例混合后進入LCMS/MS分析，最后根據(jù)“輕”“重”衍生物產(chǎn)生的離子對的峰面積比值即可對含相同功能基團的系列組分進行相對定量分析，其工作流程見圖1＼[3＼]。當其中一組樣本是濃度已知的標準品時，將其衍生物作為內(nèi)標物，可以實現(xiàn)樣本中目標組分的絕對定量分析。如ICD試劑采用多種同位素編碼的標簽，可對目標物進行多重定量分析標記，適用于多組樣本間的同時比較及生物學過程的動態(tài)監(jiān)測，提高了分析效率和實驗的重復性。其中利用同位素標記相對和絕對定量分析（iTRAQ）和串聯(lián)質(zhì)量標簽（TMT）可對多肽的氨基分別實現(xiàn)八重＼[18＼]和十重＼[19＼]標記。Dephoure等＼[20＼]將三重代謝標記與六重TMT結(jié)合，實現(xiàn)了18組樣本的同時分析，大大提高了蛋白質(zhì)組相對定量分析的通量。

由于“輕”“重”衍生物只相差幾個確定的質(zhì)量數(shù)，具有相同的結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)相似，洗脫時間和質(zhì)譜離子化能力幾近相同，通過比較衍生物的質(zhì)譜響應信號，可實現(xiàn)兩個比較樣本中代謝物的差異分析，隨后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)庫搜索，有助于潛在生物標志物的發(fā)現(xiàn)。ICD還可以有效解決次級代謝物分析時感興趣的目標物與背景峰區(qū)分困難的問題。所有衍生的分析物在質(zhì)譜圖中呈現(xiàn)特定質(zhì)量差值（等于同位素標簽的質(zhì)量差×標記位點數(shù)量，如：H4/D4標記試劑的質(zhì)量差為4 Da×官能團數(shù)量）且保留時間相同的一對峰，而背景峰和未衍生的分析物呈現(xiàn)單峰，從而有利于目標物的鑒定＼[21＼]。

ICD試劑的設計和選擇是ICD技術的關鍵步驟。ICD試劑一般由三部分組成：與目標物官能團反應的反應基團；為目標物的衍生物提供不同質(zhì)量的同位素標簽；用于提高目標分析物分離性和可檢測性的性能修飾基團，包括質(zhì)子親和、易離子化、帶電荷和疏水基團。當目標物的疏水性提高時，反相色譜（RPLC）可以采用有機溶劑比例更高的流動相，這種流動相適合電噴霧電離（ESI）中帶電液滴的產(chǎn)生，因而ESIMS響應更高＼[8＼]。理想的ICD試劑需滿足如下要求＼[3， 22＼]：（1）“輕”“重”同位素試劑易合成，且成本較低；（2）衍生化反應足夠穩(wěn)健以抵抗各種復雜的基質(zhì)成分，并在溫和的條件下獲得高產(chǎn)量；（3）特異性地與目標物官能團反應，過量的衍生化試劑或副產(chǎn)物不干擾樣本的分離和檢測；（4）“輕”“重”同位素試劑衍生化的反應時間、過程及產(chǎn)率均相同；（5）“輕”“重”衍生物在色譜分離中同位素效應不明顯，色譜行為一致，可以有效地校正保留時間漂移產(chǎn)生的基質(zhì)效應；（6）衍生物通過低能碰撞誘導裂解（CID）產(chǎn)生相同的特征子離子或中性碎片（來源于ICD試劑），與母離子結(jié)構(gòu)無關等。endprint

ICD與 LCMS/MS相結(jié)合具有以下優(yōu)勢，可以在大氣壓化學電離（APCI）模式下向分析物引入高親電或親核的結(jié)構(gòu)，在ESI模式下引入永久性帶電荷或易離子化的結(jié)構(gòu)，提高檢測靈敏度＼[8＼]；增加高極性和高親水性化合物的疏水能力，使其在RPLC上得以保留并分離；增加分析物的穩(wěn)定性以及低分子量化合物的分子量；標記對象廣泛，同時獲得具有相同標記反應特性的某類分析物的同位素內(nèi)標物；校正基質(zhì)效應和每次運行間的電離差異，提高定量分析的精確度和準確度＼[23＼]；易于未知代謝物的鑒定等。

3穩(wěn)定同位素標記衍生化的應用

ICD 結(jié)合LCMS/MS的方法適用于生物樣本中代謝物的定量分析、差異分析及次級代謝物的譜圖分析。本文以ICD試劑靶向的目標物官能團進行分類，重點介紹了針對不同基團的ICD試劑并對該方法在動物樣本中羧酸類、胺類、含羰基、含巰基和含羥基代謝物研究中的應用進行評述。

3.1羧酸類化合物羧酸類化合物在生物分子中占有極大的比例，已被證明與2型糖尿病、肥胖和代謝綜合征等疾病和生理病理學紊亂有著極為重要的關系。羧酸類化合物可在MS負離子模式下檢測，但靈敏度通常較低，同時用于分離羧酸類化合物的流動相并不總與ESIMS相容＼[12＼]。因此，常在分析前將其衍生為易離子化、更疏水或堿性的衍生物，使其在ESI或APCI正離子模式下具有更高的靈敏度。常用于靶向羧基的ICD試劑及其應用分別示于圖2與表1中。

Guo等＼[31＼]設計并合成了一對羧基ICD試劑12C2/13C2對二甲氨基苯甲酰甲基溴（DMPABr，圖2A）。DMPABr衍生物主要包含三個部分：提高檢測靈敏度的叔胺基團，增加疏水性進而改善RPLC保留的芳環(huán)以及利于代謝物鑒定和準確量化的同位素標簽。DMPABr衍生物的信號增強了2～4個數(shù)量級，但胺類可與DMPABr反應抑制羧酸類化合物的信號。Peng等＼[24＼]對該方法加以改進，在DMPABr標記前使用液液萃取富集羧酸化合物。液液萃取在酸性條件下（pH約為1）可有效地分離胺類與羧酸類化合物，并將樣本中降低標記效率的水移除＼[24＼]。

2，4二甲氧基6哌嗪基嘧啶（DMPP，圖2B）是一種高專一性的羧基標記試劑，在基于碳二亞胺縮合的標記條件下，15 s即可實現(xiàn)快速標記且不需要諸如高溫等苛刻的反應條件。DMPP具有高質(zhì)子親合能（嘧啶環(huán)）和適中的疏水性，可提高多種含羧基化合物，如小分子有機酸、脂肪酸、多肽、蛋白質(zhì)等底物的質(zhì)譜響應＼[5＼]。H6/D6DMPP試劑已應用于尿液＼[5＼]和甲狀腺組織＼[25， 26＼]中脂肪酸的定量分析及差異分析。

二甲基乙二胺（DMED，圖2C）中的叔胺基團能夠提高羧酸類化合物的質(zhì)子親和力，使其在ESI源中更易電離。Zhu等＼[27＼]借助H4/D4DMED將血清中19種類花生酸的靈敏度增加了5～138倍，實現(xiàn)了類花生酸同分異構(gòu)體的色譜分離。該課題組將H4/D4DMED試劑與雙中性丟失掃描（QNLS）相結(jié)合實現(xiàn)了脂溶性羧酸類代謝物的全面分析，在ESI源中，輕重標記的DMED衍生物分別特異性地丟失質(zhì)量為45和49 Da的中性碎片二甲胺，產(chǎn)生含有特定質(zhì)量差（4 Da×羧基數(shù)）且保留時間相同的離子對，與全掃描模式相比，QNLS能顯著提高檢測準確度和選擇性，有益于目標物的鑒定（圖3）＼[21＼]。

Ogawa等＼[28＼]合成了H4/D41＼[（4二甲基氨基苯基）羰基＼]哌嗪（DAPPZ，圖2D），用于二十碳五烯酸（EPA）和花生四烯酸（AA）的定量分析，衍生物的酰胺鍵斷裂產(chǎn)生特征性產(chǎn)物離子m/z 148。EPA和AA的羧基經(jīng)衍生化后，MS檢測靈敏度分別提高了100和300倍。

Han等＼[29＼]利用12C6/13C63硝基苯肼（3NPH，圖2E）對10種腸道微生物來源的2～6個碳的短鏈脂肪酸（SCFA）進行定量分析，獲得了良好的精密度（≤8.8%）和準確度（93.1%～108.4%）。但該方法缺乏衍生化后的淬滅步驟，可能導致NPH與殘留乙酸（LCMS系統(tǒng)常見的共溶劑）發(fā)生非預期反應。而Chan等＼[30＼]利用12C6/13C6苯胺（圖2F）對15種SCFAs建立的定量分析方法，優(yōu)化了苯胺衍生化反應的淬滅條件，幾乎消除了乙酸的在線衍生。

上述ICD試劑衍生化反應簡單易行，標記效率高，不僅憑借同位素標簽實現(xiàn)了羧酸類化合物的準確定量分析，還通過引入質(zhì)子親合能高和疏水性強的基團（哌嗪基、嘧啶基和苯環(huán)等），大大提高了質(zhì)譜儀從復雜生物樣本中檢測羧酸類化合物的能力。與上述LCMS/MS方法相比，ICD較少應用于氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GCMS/MS）對羧酸類代謝物的分析中。Bruheim等＼[11＼]綜述了3種ICD結(jié)合GCMS的分析策略，其中H3/D3氯甲酸甲酯（MCF，圖2G）＼[32＼]和H6/D6N（特丁基二甲基硅）N甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA，圖2H）＼[33＼]可用于分析羧酸代謝物。由于氯甲酸烷基酯在水相介質(zhì)中與氨基和/或羧基衍生化快速，衍生物穩(wěn)定，并且可以對氨基和羧基分別進行標記，最近，Tumanov等＼[34＼]將H3/D3MCF應用于大鼠肝臟、血漿和尿液中氨基酸和非氨基有機酸的定量分析。

3.2胺類化合物

胺類代謝物，如氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)和生物胺等在生物功能中起著重要作用。研究表明，體液中胺類代謝物的失調(diào)與帕金森、阿爾茨海默癥和腎癌等疾病相關＼[1＼]。胺類物質(zhì)在酸性條件下通常容易質(zhì)子化，在ESIMS正離子模式下能達到合適的靈敏度，但其堿性、強極性及高水溶性等特點，使其難以在RPLC中保留，離子抑制效應嚴重＼[35＼]。而通過衍生化將胺轉(zhuǎn)化為疏水性更高的化合物，可以使得衍生物在RPLC上更易與干擾物分離且提高檢測靈敏度。圖4與表2分別顯示了靶向氨基的ICD試劑及其應用。

丹磺酰試劑在堿性介質(zhì)中可以對一級胺、二級胺和酚羥基實現(xiàn)快速標記，而不包括叔胺和醇羥基類化合物。丹磺?；軌蚋纳品治鑫锏膸щ娦院褪杷?，引入的堿性叔胺基在酸性LC流動相中易離子化，萘基能增加衍生物的疏水性及其在RPLC上的保留＼[36＼]。丹磺酰氯（DNSCl，圖4A）可將胺、氨基酸和苯酚ESI正離子響應信號增強1～3個數(shù)量級＼[4＼]， 該試劑現(xiàn)已應用于尿液＼[4， 38～40＼]、 汗液＼[36＼]、 腦脊液＼[37＼]和糞便＼[39＼]等樣本的次級代謝物分析及生物標志物的發(fā)現(xiàn)。5二乙基氨基萘1磺酰氯（DENSCl，圖4B）在結(jié)構(gòu)上與DNSCl類似，其中連接到萘基胺的兩個甲基被乙基替代，乙基可以增加疏水性并提供更強的給電子傾向，使得DENSCl衍生物在離子化時有更強的表面活性而易生成更多的氣相離子，并具有更高的質(zhì)子親和力＼[41＼]。此外，DENSCl可形成3種同位素質(zhì)量差異標簽（12C4/12C213C2/13C4），能同時對3個樣本進行分析，比DNSCl雙重同位素試劑（12C2/13C2）具備更高的靈敏度和分析速度＼[41＼]。endprint

N羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯為羧酸活性酯， 是一級胺和二級胺的高反應性親電試劑， 且具有副產(chǎn)物及過量試劑不干擾分離和檢測的優(yōu)點，除了已實現(xiàn)商品化的iTRAQ試劑（圖4C）外，近年也開發(fā)了焦谷氨酸NHS酯（PGAOSu，圖4D）＼[7＼]、苯甲酸NHS酯（BZOSu，圖4E）＼[45＼]、4二甲基氨基苯甲酰氨基乙酸NHS酯（DBAANHS，圖4F）＼[44＼]、4甲氧基苯甲酰氨基乙酸NHS酯（MBAANHS，圖4G）＼[44＼]、甲基哌嗪基丁酸NHS酯（MPBS，圖4H）＼[43＼]和二甲基氨基丁酸NHS酯（DMABS，圖4I）＼[43＼]等ICD試劑。Wagner 等＼[45＼]利用12C6/13C6BZOSu相對定量分析含氨基代謝物，未衍生的胺類代謝物大多在1.5 min內(nèi)洗脫，而BZOSu衍生物因苯基的引入，色譜保留增加，分離度改善且具有更高的信號響應（圖5）。Toyo′oka課題組開發(fā)了一系列用于手性氨基酸和羧酸次級代謝組學的衍生化試劑＼[7， 4649＼]。借助手性試劑H5/D5LPGAOSu， 9種疏水性D/L氨基酸在1.7 μm的十八烷基甲硅烷基（ODS）柱上實現(xiàn)對映體分離＼[7＼]。Zhou等＼[44＼]設計并合成了兩種氨基ICD試劑DBAANHS和MBAANHS，由于二甲基氨基在ESI源中更易質(zhì)子化，DBAANHS比MBAANHS提高代謝物靈敏度的能力更顯著。但MBAANHS衍生物在MS3（源內(nèi)CID加MS/MS）中可以產(chǎn)生更多有價值的碎片離子以提供目標物的結(jié)構(gòu)信息，從而有助于代謝物的鑒定＼[44＼]。

上述氨基標記試劑的衍生條件簡單，衍生物穩(wěn)定且可以顯著增強胺類化合物的離子化效率。但由于丹磺?；蚇HS酯較高的反應活性，這些氨基ICD試劑還能與酚羥基類和巰基類化合物發(fā)生反應，不能實現(xiàn)對氨基專一性的標記。因此，進一步開發(fā)新型氨基特異性ICD試劑是很有必要的。

3.3含羰基化合物

內(nèi)源性含活性羰基的醛和酮，通常與糖代謝和氧化應激相關，其參與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病及并發(fā)癥和動脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)展＼[50＼]。在使用大氣壓離子化技術時，醛和酮的中性羰基會降低離子化效率。通過衍生化反應引入帶電荷的結(jié)構(gòu)，可以提高羰基化合物的電離效率，消除脂肪醛和脂肪酮的揮發(fā)性和反應性，使其更適于LCMS分析。常用于標記含羰基化合物的ICD試劑及其應用分別示于圖6與表3中。

羰基ICD試劑吉拉德試劑P（GP，圖6A）主要由能夠改善分析物色譜質(zhì)譜行為的季銨和與羰基反應的肼兩部分組成，H5/D5GP已應用于血清中含3酮和3β羥基的固醇＼[51＼]及人卵泡液中7種類固醇＼[52＼]的分析。

2肼基1甲基吡啶（HMP，圖6B）可用于含羰基化合物的標記，HMP衍生物的電離效率相當高且在CID下產(chǎn)生特征性的子離子m/z 108。但由于會形成多個帶電離子（＼[M-H＼]

Symbolm@@ 和＼[M＼]2+）及其它碎片離子，HMP并不適用于多羰基化合物的衍生化＼[56＼]。Higashi等＼[53＼]利用H3/D3HMP對大鼠腦內(nèi)別孕烯醇酮（AP）及其前體孕烯醇酮（PREG）進行量化和差異分析，AP和PREG的靈敏度分別提高了500和3000倍，方法的精密度和準確度也得以顯著提高。

Tie等＼[54＼]建立了利用美拉肼（T3，圖6C）對內(nèi)源性脂肪醛進行全面表征的策略，衍生化在37℃反應15 min，衍生化效率>98%，檢測限低至0.1～1.0 pg/mL。T3能增加脂肪醛的疏水性及色譜保留，改善分離度，并通過引入的堿性基團大幅增強了離子化效率。

4（2（三甲基銨基）乙氧基）苯胺鹵化物（APC，圖6D）是一種醛基標記試劑，其中的苯胺能選擇性地與含醛基化合物快速反應，季銨基團可以改善MS靈敏度。Yu等＼[55＼]在QNLS下通過特異性地監(jiān)測H4/D4APC衍生物碰撞產(chǎn)生的中性碎片（87和91 Da），實現(xiàn)了對尿液中含醛基代謝物的非靶向分析。

（A）H5/D5吉拉德試劑P；（B）H3/D32肼基1甲基吡啶；（C）H20/D20美拉肼；（D）H4/D44（2（三甲基銨基）乙氧基）苯胺鹵化物；（E）12C2/12C113C1/13C2N甲氧基N（2氨氧基乙基）丙酸酯；（F）12C2/12C113C1/13C22氨氧基乙基丙酸酯

（A）H5/D5Girard′s reagent P（GP）；（B）H3/D32Hydrazino1methylpyridine（HMP）；（C）H20/D202，4Bis（diethylamino）6hydrazino1，3，5triazine（T3）；（D）H4/D44（2（Trimethylammonio）ethoxy）benzenaminium halide（APC）； （E）12C2/12C113C1/13C2 NMethoxyN（2aminooxyethyl）propionate（MAP）；（F）12C2/12C113C1/13C22Aminooxyethyl propionate（AEP）

GP、HMP和T3這類含有肼基的ICD試劑，衍生化條件相對苛刻（如高溫或酸性介質(zhì)），同時由于肼還能與小分子羧酸發(fā)生反應，標記反應缺乏特異性＼[57＼]。而APC衍生化反應條件溫和（pH 5.7，10℃），無需額外的樣本預處理步驟，對醛的特異性較高。此外，氨氧基試劑，如N甲氧基N（2氨氧基乙基）丙酸酯（MAP，圖6E）＼[58＼]和2氨氧基乙基丙酸酯（AEP，圖6F）＼[59＼]可用于羰基化合物的GCMS/MS分析中，利用AEP或MAP與羰基發(fā)生肟化反應生成的肟醚在電子轟擊源中碎裂生成同位素標記的乙基碳鎓離子（m/z 32～34），可實現(xiàn)多重分析中羰基化合物的鑒定與相對定量分析。

3.4含巰基和羥基化合物

硫醇分析的主要問題在于不穩(wěn)定性，因為游離的巰基反應活性高，可通過自氧化和硫醇二硫化物的交換反應轉(zhuǎn)化為氧化硫醇＼[60＼]。而ω溴丙酮基喹啉鎓溴化物（BQB，圖7A）可與巰基烷基化反應生成硫醇喹啉鎓加合物，穩(wěn)定巰基的同時引入永久帶電的結(jié)構(gòu)，增加MS檢測靈敏度。Liu等＼[6＼]利用H7/D7BQB在母離子掃描模式下監(jiān)測衍生物CS鍵斷裂產(chǎn)生的離子（m/z 218和225），實現(xiàn)了含巰基代謝物的非靶向分析。該課題組也將H7/D7BQB應用于健康人和5種癌癥患者尿液中含巰基代謝物的差異分析＼[61＼]。endprint

含羥基化合物在LC流動相的酸度范圍內(nèi)通常是中性的，缺乏可電離的基團，MS響應低，且一些羥基化合物較強的親水性使其難以在RPLC中很好地保留。靶向羥基的ICD試劑能夠增加含羥基化合物的色譜保留和電離效率，從而提高分析方法的靈敏度和重現(xiàn)性（應用列于表4）。DNSCl除了用于標記胺外，還可用于含羥基化合物的分析，通過液液萃取將羥基代謝物富集到乙酸乙酯層，干燥后復溶于乙腈中，接著將代謝物提取物用經(jīng)堿激活的12C2/13C2DNSCl標記＼[62＼]。丙酮（圖7C）可選擇性地與含順式二醇化合物反應，通過引入更疏水的異丙亞基阻斷順式鄰二羥基以降低極性，從而改善其在反相色譜柱上的分離。Li等＼[63＼]利用H6/D6丙酮在QNLS下監(jiān)測目標衍生物產(chǎn)生的中性碎片172 Da（H標核苷）和178 Da（D標核苷），對核糖核苷進行鑒定。Chu等＼[64＼]采用二氧化鈰分散固相萃取法富集尿液中的

修飾核苷，同時選擇性地捕獲修飾核苷中的順式鄰二羥基，再用H6/D6丙酮對其進行同位素標記和分析，該方法可以顯著降低基質(zhì)效應，提高檢測靈敏度并將非核糖結(jié)合物等假陽性結(jié)果最小化。

4總結(jié)與展望

隨著ICD的不斷發(fā)展，該項技術已經(jīng)在簡化樣品復雜性、提高方法的靈敏度和準確度等方面逐漸顯示出了強大的功能，為結(jié)構(gòu)多樣、樣本來源復雜的代謝物的定量分析、差異分析以及譜圖分析提供了很好的思路。但該技術仍存在諸多限制，如ICD試劑高昂的成本、衍生化苛刻的反應條件及時間的耗費、標記效率的有限性、部分ICD試劑與待分析物的專一性不強、后續(xù)分離檢測過程引入的定量分析誤差等。此外，H/D同位素標記試劑的衍生物存在同位素效應，其色譜行為差異會影響定量分析結(jié)果的準確性。但該問題可以通過減少D的個數(shù)，并將標記位點選擇在親水基團附近，或者選用12C/13C或14N/15N同位素標記試劑而得以緩解。 ICD試劑在廉價易得、對靶標分析物具有更高的反應性及特異性、更加準確靈敏、適合高通量及大規(guī)模定量分析等方面仍具有很大的發(fā)展空間。相信隨著新型ICD試劑與標記策略的不斷發(fā)展和改進，ICD技術將為生物體內(nèi)重要分子的代謝途徑、疾病作用機制的闡述，生物標志物的發(fā)現(xiàn)以及疾病的診療和預后提供更可靠的信息，必將得到更廣泛的應用。

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