付宇++李曉東++李鑄衡++陳宏達(dá)++王振新++張惠茅++王海峰

摘要利用硫金鍵將末端修飾甲氧基、氨基或羧基的巰基化聚乙二醇（Thiolated polyethylene glycol，HSPEG）分子分別組裝到金納米粒子表面， 合成了3種帶有不同表面電荷的聚乙二醇修飾金納米粒子（PEGylated gold nanoparticles，PEGAu NP）。細(xì)胞共培養(yǎng)和小鼠尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表面電荷能夠顯著影響PEGAu NP的生物行為。細(xì)胞對(duì)PEGAu NP的吞噬量遵循正電荷

Symbol～@@ 電中性

Symbol～@@ 負(fù)電荷的規(guī)律。尾靜脈注射的PEGAu NP能夠隨小鼠的血液循環(huán)由全器官分布逐漸向肝脾轉(zhuǎn)移。表面帶負(fù)電荷的PEGAu NP較難被小鼠肝脾清除，帶但正電荷的PEGAu NP能夠引起小鼠免疫系統(tǒng)較強(qiáng)的響應(yīng)。

關(guān)鍵詞聚乙二醇； 金納米粒子； 活細(xì)胞； 活體分布； 生物相容性

1引 言

金納米粒子（Gold nanoparticles，Au NPs）因具有光學(xué)性質(zhì)可調(diào)、易通過(guò)SAu配位實(shí)現(xiàn)功能化等優(yōu)點(diǎn)而被認(rèn)為是構(gòu)建診療一體化納米探針及納米藥物的理想材料＼[1～6＼]。盡管基于Au NPs的納米藥物具有療效高和副作用低的優(yōu)點(diǎn)，但其生物安全性仍存在很多爭(zhēng)議＼[7～9＼]。一些研究表明，Au NPs具有毒性效應(yīng)，且與納米粒子的大小、表面電荷及功能團(tuán)高度相關(guān)＼[9～13＼]。如粒徑（Dcore）< 2 nm的Au NPs具有顯著細(xì)胞毒性；Dcore>10 nm的Au NPs細(xì)胞毒性則較弱，并隨Dcore增大稍有增加。由于Dcore在10～100 nm 范圍內(nèi)的Au NPs能夠自由進(jìn)出細(xì)胞，并選擇性進(jìn)入特定細(xì)胞器，因此Au NPs有可能干擾細(xì)胞器的正常生理功能，具有潛在的細(xì)胞毒性＼[11～13＼]。Dcore相同的Au NPs，正電荷的Au NPs的細(xì)胞毒性高于電中性或負(fù)電荷的Au NPs。此外，通過(guò)配體交換或進(jìn)一步功能化，同樣能夠改變Au NPs的細(xì)胞毒性。Deol等＼[14＼]將樹(shù)枝狀分子接枝到谷胱甘肽修飾的Au NPs表面改善其細(xì)胞毒性。

隨著Au NPs在生物醫(yī)學(xué)和生物分析中的應(yīng)用日益廣泛，其相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)不斷豐富；但是大量、離散的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)， 導(dǎo)致相互矛盾的Au NPs毒性數(shù)據(jù)＼[7～13＼]。Goodman等＼[15＼]證明正電荷的2 nm Au NPs的細(xì)胞毒性大于電中性及負(fù)電荷的Au NPs。但Schaeublin等＼[16＼]發(fā)現(xiàn)無(wú)論是正電荷或負(fù)電荷的2 nm Au NPs均具有細(xì)胞毒性，并且負(fù)電荷的Au NPs的毒性更高。與大多數(shù)研究結(jié)果相反，Vetten等＼[17＼]發(fā)現(xiàn)20 nm Au NPs能夠顯著降低中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的活率。Yang等＼[18＼]認(rèn)為不同Dcore 的Au NPs對(duì)小鼠均無(wú)生物毒性，然而Fraga等＼[19＼]發(fā)現(xiàn)20 nm Au NPs能夠?qū)е滦∈筝p度貧血。另外，Au NPs的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)其在活體器官中分布、遷移影響的研究相對(duì)較少＼[20，21＼]。為了充分揭示Au NPs的毒理學(xué)特征，需要系統(tǒng)評(píng)估Au NPs的理化性質(zhì)與生物毒性的關(guān)系。本研究以生物相容性好的聚乙二醇（PEG）為基本配體單元，僅通過(guò)改變PEG末端的功能團(tuán)獲得3種帶有不同表面電荷的PEG修飾的13 nm Au NPs， 系統(tǒng)考察了表面電荷對(duì)Au NPs與細(xì)胞相互作用及其在小鼠體內(nèi)分布的影響。研究結(jié)果表明，表面電荷在細(xì)胞對(duì)Au NPs的吞噬和器官對(duì)Au NPs的富集過(guò)程中起重要作用。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與材料

UVmini1240紫外可見(jiàn)吸收光譜儀（日本島津公司）； ELAN 9000/DRC電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS，美國(guó)熱電公司）； HITACHI H600型透射電子顯微鏡（TEM，日本Hitachi公司），5415R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）； NanoZS粒度儀（英國(guó)Malvern公司）； LEICA EM UC7型超薄切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）； Power Wave XS2 型微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)BioTek儀器有限公司）。

氯金酸（HAuCl4·3H2O，美國(guó)SigmaAldrich公司）； 檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O，北京化工廠）； HSPEGNH2、HSPEGOCH3、HSPEGCOOH（其中PEG部分MW2000，美國(guó)Nanocs公司）； 3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、青霉素和鏈霉素（上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）； DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco公司）； HeLa（人宮頸癌細(xì)胞），THP1（人單核細(xì)胞），HepG2（人肝癌細(xì)胞），A549（人肺癌細(xì)胞）和293（人胚腎細(xì)胞）細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）； 其它試劑均為分析純，購(gòu)于北京國(guó)藥集團(tuán)； 實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。BalB/C小鼠（雌性，4～5周齡，約20 g體重，北京華阜康生物科技股份有限公司）。

2.2PEG修飾的金納米粒子的合成與表征

參考TurkevichFrens＼[22，23＼]方法制備檸檬酸根保護(hù)的13 nm Au NPs。將3種PEG化合物按照Au NPs與PEG 摩爾比1∶5000分別加入10 mL Au NPs溶液中，室溫下反應(yīng)12 h后，將溶液離心（9000 r/min離心15 min）清洗3次，以除去未反應(yīng)的PEG。將純化后的PEG修飾Au NPs（PEGAu NP）分散于1 mL H2O中儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆?。根?jù)PEGAu NP所帶電荷的不同將其命名為G13X，其中G代表Au NPs，13代表Au NPs的粒徑，字母X=C、N、A，分別代表帶正電（Cationic）、中性（Neutral）和帶負(fù)電（Anionic）的PEGAu NP。

2.3細(xì)胞毒性和吞噬實(shí)驗(yàn)

在37℃下，5% CO2培養(yǎng)箱中， 使用包含10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基以1 × 104 cell/mL 的密度將5種細(xì)胞（THP1、HeLa、MCF7、Hep G2和A549）接種于96孔板中。過(guò)夜孵育細(xì)胞后，更換含有不同濃度G13X（0，25，50和100 μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。后去除含G13X的培養(yǎng)基，在200

SymbolmA@ L新鮮培養(yǎng)基中添加10 μL MTT （5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，形成的甲瓚結(jié)晶用100 μL DMSO 溶解。用微型孔板分光光度計(jì)測(cè)量490 nm 處的吸光度值， 以未與G13X共培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組， 相對(duì)細(xì)胞活率=（＼[A＼]test/＼[A＼]control）×100%。

為了檢測(cè)細(xì)胞對(duì)不同G13X的吞噬量，將不同細(xì)胞種入6孔板，并用不含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。去除培養(yǎng)基后，將100

SymbolmA@ L含有100 μg/mL G13X的新鮮培養(yǎng)基分別加入到孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)基，并用100

SymbolmA@ L PBS清洗細(xì)胞3次，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移至離心管計(jì)數(shù)后離心（1000 r/min），得到細(xì)胞沉淀，凍干后用濃HNO3溶解，使用ICPMS測(cè)定金元素含量。

2.4金納米粒子活體內(nèi)分布和毒性實(shí)驗(yàn)

所有動(dòng)物使用小鼠專用飼料和無(wú)菌水于清潔級(jí)環(huán)境（吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）中飼養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)規(guī)定。

金納米粒子活體體內(nèi)分布：將實(shí)驗(yàn)用小鼠分為3組，對(duì)應(yīng)3種Au NPs，每組9只小鼠。首先用10%（V/V）水合氯醛麻醉小鼠，尾靜脈注射200 μL含有4 mg/kg G13X的生理鹽水。在特定時(shí)間點(diǎn)（注射后1、7和30天）選取3只小鼠，稱重后處死，取出心、肝、脾、肺、腎、腦和骨髓等器官。稱量器官重量后，用王水消化2 h得到液體，使用ICPMS測(cè)定器官中金元素的含量。使用未經(jīng)Au NPs處理的3只小鼠作為對(duì)照組。

采用TEM觀察肝、脾組織：通過(guò)尾靜脈向小鼠體內(nèi)注射200 μL含有4 mg/kg G13C的注射液。注射30天后將小鼠處死，快速取出肝和脾組織，經(jīng)2.5%戊二醛前固定、1%鋨酸后固定、乙醇系列脫水和Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋處理后，使用LEICA EM UC7型超薄切片機(jī)半薄切片定位后做超薄切片，然后用醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，用TEM觀察及攝片。

Au NPs毒性實(shí)驗(yàn)：按上述相同方法處理小鼠，在注射G13X后1、7和30 天分別抽取血液用于血常規(guī)和ICPMS測(cè)試； 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)將3只小鼠處死，取出心、肝、脾、肺、腎和腦等器官，使用10%（V/V）福爾馬林中性緩沖液固定，取部分組織，用Hematoxylin&Eosin染色，在顯微鏡下觀察并拍攝圖片。以正常飼養(yǎng)的小鼠作為對(duì)照組。

3結(jié)果與討論

3.1金納米粒子合成與表征

Au NPs的UVvisible光譜和TEM表征如圖1所示。所合成的檸檬酸根保護(hù)的Au NPs的平均粒徑為（13.2±2.5） nm，最大表面等離子體共振（Surface plasmonic resonance， SPR）吸收峰為519 nm，與文獻(xiàn)＼[22，23＼]報(bào)道的值一致。經(jīng)PEG修飾后，G13X的UVvisible光譜沒(méi)有發(fā)生顯著變化，說(shuō)明納米粒子沒(méi)有發(fā)生大規(guī)模的聚集。TEM表征也證明， G13X具有良好的分散性。表1給出了所合成的G13X在不同介質(zhì)中的表面電荷（Zeta potential，ZP）和水合粒徑（Hydrodynamic size，HD）。由于在G13X表面存在雙電層，在純水和磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中G13X的水合粒徑比TEM所測(cè)得的粒徑稍大。FBS中含有大量不同種類的蛋白質(zhì)，能夠通過(guò)自組裝、靜電吸附等相互作用在G13X表面形成一層蛋白質(zhì)，因此在含有10%血清的PBS中， G13X的水合粒徑遠(yuǎn)大于其在純水和PBS中的水合粒徑＼[24，25＼]。另外，帶正電荷的G13X能夠通過(guò)靜電作用吸附大量帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，其表面電勢(shì)由正電荷轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷。

3.2Au NPs與細(xì)胞相互作用

選取5種來(lái)源于不同組織的細(xì)胞（THP1、HeLa、MCF7、Hep G2和A549），與G13X共培養(yǎng)，考察細(xì)胞種類和G13X表面電荷對(duì)G13X與細(xì)胞相互作用的影響。這5種細(xì)胞中， THP1具有免疫細(xì)胞的某些特征，Hep G2和A549具備代謝器官（肝、肺）細(xì)胞的主要特征，MCF7為腺細(xì)胞，HeLa和A549具有上皮細(xì)胞的特征。在100

SymbolmA@ g/mL G13X存在時(shí)，所考察的細(xì)胞均能保持

Symbol～@@ 95%的存活率，說(shuō)明G13X具有較低的細(xì)胞毒性。如圖2所示，當(dāng)與100 μg/mL G13X共培養(yǎng)后，ICPMS分析結(jié)果表明，細(xì)胞對(duì)G13X的吞噬量與G13X的表面電荷以及細(xì)胞的種類有關(guān)。 5種細(xì)胞對(duì)G13X的吞噬量遵循G13C

Symbol～@@ G13N

Symbol～@@ G13A的規(guī)律， 不同細(xì)胞對(duì)同種G13X的吞噬量存在顯著差異，即免疫細(xì)胞（THP1）對(duì)G13X的吞噬能力遠(yuǎn)大于體細(xì)胞，代謝能力強(qiáng)的細(xì)胞對(duì)G13X的吞噬能力也較強(qiáng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)＼[12，13，26，27＼]的相關(guān)研究結(jié)果一致。細(xì)胞表面存在大量可與正電荷的G13C相互作用的電負(fù)性物質(zhì)，這種靜電吸引力能夠增強(qiáng)G13C的跨膜能力，從而增大細(xì)胞對(duì)G13C的吞噬量。另外，在無(wú)FBS的培養(yǎng)基中，細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，代謝能力強(qiáng)的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外物質(zhì)的吞噬能力也較強(qiáng)。

3.3Au NPs的生物相容性

將G13X分別通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，在注射后第1、7和30天進(jìn)行小鼠器官指數(shù)（器官重量除以小鼠體重）、血常規(guī)和免疫組化分析。如圖3所示，在所考察的時(shí)間內(nèi)，小鼠器官指數(shù)的變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）值小于8%，此結(jié)果表明，G13X對(duì)小鼠器官指數(shù)沒(méi)有顯著影響。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的組織切片未表現(xiàn)出顯著的毒性和副作用（圖4）。血常規(guī)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的白細(xì)胞（White blood cell，WBC）相對(duì)于對(duì)照組（正常飼養(yǎng)）小鼠的WBC均顯著升高（表2）。在

注射G13X后第1天，小鼠的WBC升高了3倍以上； 在注射G13X后第1天，小鼠的WBC升高了3倍以上； 在注射G13X后第30天，小鼠的WBC仍是正常飼養(yǎng)的小鼠WBC的1.4倍以上。另外，注射G13C小鼠的WBC值大于注射G13N和G13A小鼠的WBC值。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管G13X未表現(xiàn)出明顯的生物毒性，但能夠引起小鼠免疫系統(tǒng)的強(qiáng)烈響應(yīng)，并與G13X與細(xì)胞作用能力存在正相關(guān)性，即G13C

Symbol～@@ G13N

Symbol～@@ G13A。這種強(qiáng)烈的免疫響應(yīng)有可能誘發(fā)某些重大疾?。ㄈ缙鞴傺装Y等）。因此，在研發(fā)納米藥物時(shí)，必須考慮納米材料對(duì)生命體系的長(zhǎng)期影響。

3.4Au NPs在小鼠體內(nèi)的分布

使用ICPMS對(duì)尾靜脈注射G13X的小鼠體內(nèi)主要器官（心、肝、脾、肺、腎、腦和骨髓）的金元素的含量進(jìn)行了測(cè)定以獲得G13X在各個(gè)器官的分布。在注射后1天，G13X廣泛分布于小鼠的各個(gè)器官，其中肝和脾對(duì)G13X富集量較大（圖5A）。在注射7天后，肝和脾中G13X的量顯著增加并表現(xiàn)出表面電荷依賴性（富集量G13A>G13N>G13C），但其它器官中G13X的量減少（圖5B）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠肝和脾中G13X的量逐漸減少（圖5C）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，G13X可以在不同器官之間易位，最終在肝和脾中富集， 并可能由肝代謝緩慢排出體外。在注射30天后，G13X仍大量富集于肝和脾中，說(shuō)明G13X能夠長(zhǎng)期滯留在動(dòng)物體內(nèi)（圖5C），這種長(zhǎng)期滯留與血液中WBC升高具有一致性（見(jiàn)表3）。由于細(xì)胞對(duì)G13A的吞噬速度遠(yuǎn)小于G13C和G13N（圖2），因此G13A在體內(nèi)清除較慢。另外，小鼠血液中G13X隨時(shí)間的增加而逐漸降低，但在30天后血液中仍存有痕量G13X， 這也說(shuō)明Au NPs能夠通過(guò)血液循環(huán)由其它器官逐漸轉(zhuǎn)移到肝脾中，并被排出體外。這種緩慢的代謝過(guò)程增加了G13X的生物毒性風(fēng)險(xiǎn)。

為了進(jìn)一步考察Au NP是否在體內(nèi)發(fā)生分解，在注射G13C 30天后對(duì)小鼠的肝、脾組織進(jìn)行了TEM表征。如圖6所示，在肝組織的上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及脾組織的淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的G13C，其粒徑?jīng)]有發(fā)生顯著減小。此結(jié)果表明Au NP在活體體內(nèi)具有良好的膠體穩(wěn)定性，能夠被上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞長(zhǎng)期儲(chǔ)存，并逐漸被肝臟的巨噬細(xì)胞緩慢清除體外。

4結(jié) 論

考察了表面電荷對(duì)PEG修飾的13 nm Au NPs與細(xì)胞相互作用以及在活體體內(nèi)分布的影響。結(jié)果表明， PEG修飾的Au NPs具有較低的生物毒性， Au NPs的表面電荷決定細(xì)胞對(duì)AuNPs的吞噬量和AuNPs在體內(nèi)器官的富集量， Au NPs能夠通過(guò)血液循環(huán)在體內(nèi)發(fā)生器官易位，最后富集于肝和脾中并通過(guò)肝代謝緩慢排出體外， 細(xì)胞對(duì)Au NPs的吞噬速度能夠影響其在體內(nèi)的代謝速度， Au NPs在體內(nèi)能夠長(zhǎng)時(shí)間的保持形貌并能夠引起動(dòng)物的免疫響應(yīng)。Au NPs在代謝器官中的長(zhǎng)期滯留，提示在使用貴金屬類納米藥物時(shí)必須考慮其對(duì)活體細(xì)胞及器官功能的長(zhǎng)期和潛在的影響。

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