徐 寒，劉 歡，陳 念，冷大躍*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

清胰逐瘀湯對(duì)急性胰腺炎大鼠微循環(huán)的影響及其機(jī)制

徐 寒1，劉 歡2，陳 念2，冷大躍2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

目的探討清胰逐瘀湯對(duì)急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）大鼠微循環(huán)的影響及其機(jī)制。方法將Wistar大鼠54只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組。檢測(cè)各組手術(shù)后8 h的血清白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平、血清淀粉酶(AMS)、血漿凝血酶原時(shí)間（PT）、血漿D二聚體（D-D）及血小板計(jì)數(shù)（PLT）。結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的 IL-6、TNF-α、AMS、PT、D-D 升高，PLT 降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，治療組大鼠 IL-6、TNF- α、AMS、PT、D-D的升高程度及PLT的降低程度都有減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論清胰逐瘀湯能在一定程度上改善大鼠AP的微循環(huán)，其機(jī)制與影響AP大鼠的某些炎癥介質(zhì)及凝血纖溶系統(tǒng)，減輕由微循環(huán)障礙導(dǎo)致的組織器官損害有關(guān)。

胰腺炎；微循環(huán)；清胰逐瘀湯；白細(xì)胞介素6；腫瘤壞死因子α；血漿凝血酶原時(shí)間；血漿D二聚體

急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）是一種臨床常見的急腹癥，其病情兇險(xiǎn)，并發(fā)癥多，死亡率高，中醫(yī)學(xué)名為“胰癉”。近年來研究表明，微循環(huán)障礙可能是始動(dòng)因素，并作為一種持續(xù)損傷機(jī)制貫穿于AP發(fā)展的整個(gè)過程，而促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6是引起AP凝血功能改變的主要炎癥介質(zhì)[1]，對(duì)胰腺微循環(huán)產(chǎn)生顯著的影響。清胰逐瘀湯具有活血化瘀、清熱解毒、滌蕩臟腑瘀毒的作用，在我院已應(yīng)用于AP的治療多年。但其是否可以改善AP的微循環(huán)障礙及其相關(guān)機(jī)制，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬在建立大鼠 AP模型基礎(chǔ)上，研究清胰逐瘀湯對(duì)AP炎癥因子及凝血纖溶指標(biāo)的影響，從而探討清胰逐瘀湯對(duì)AP大鼠微循環(huán)的影響及其相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用清胰逐瘀湯治療AP提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠54只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（250～280）g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

清胰逐瘀湯由生大黃10 g，牡丹皮9 g，桃仁9g，紅花 6 g，赤芍 9 g，丹參 9 g，柴胡 12 g，黃芩9 g，枳實(shí)9 g，白芍9 g，敗醬草9 g組成，飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院。先將飲片用清水浸泡1 h，加水300 mL，后10味中藥煎沸35 min后，加入生大黃再煎 5 min，然后將湯液濃縮成100 mL，制成1 g/mL的藥液。

1.3 主要試劑及儀器

?；悄懰徕c（T4009-250MG），購自美國(guó)sigma公司，生理鹽水配制成3%的?；悄懰徕c溶液，-20℃ 避光保存。4%多聚甲醛溶液（WB03004A），購自長(zhǎng)沙維爾生物科技有限公司。IL-6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒（ERC003）、TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒（ERC102a），購自深圳欣博盛生物科技有限公司。epoch型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,美國(guó)柏騰（biotek）。徠卡RM2235轉(zhuǎn)輪石蠟切片機(jī)購自北京中儀光科科技有限公司，BA410研究型顯微鏡（Motic），購自杭州明凱科技有限公司，Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，購自深圳市深沅恒科技有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

大鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，用4%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉滿意后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮，75%酒精消毒。AP模型組和治療組參照王單松等[2]介紹的AP建模方法。在劍突下作長(zhǎng)約2～3 cm的正中橫行切口，然后逐層切開直至進(jìn)入腹腔。提起脾和胰尾，用1號(hào)針頭平面朝上沿胰被膜下均勻注射3%牛磺膽酸鈉溶液，依次向胰管開口方向推進(jìn)，緩慢注入?；悄懰崛芤?.0 mL，使整個(gè)胰腺均勻隆起，約10 min后胰腺出現(xiàn)肉眼可見的水腫出血，表明制作AP模型成功，再縫合切口。假手術(shù)組開腹后僅輕揉胰腺及十二指腸，10 min后縫合切口。術(shù)后各組均禁食，限量飲水。

2.2 分組及處理

將Wistar大鼠 54只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組，每組18只大鼠。模型組和假手術(shù)組在造模前2 h和造模后2、5 h分別按10 mL/kg給予生理鹽水灌胃1次；治療組在造模前2 h和造模成功后2、5 h分別按10 mL/kg給予1 g/mL清胰逐瘀湯灌胃1次，相當(dāng)于成人劑量的3.33倍。假手術(shù)組、模型組和治療組大鼠分別在末次灌胃后3 h麻醉處死大鼠，取下腔靜脈血及胰腺組織備檢，胰腺組織用4%多聚甲醛溶液保存。隨后處死各組大鼠。

2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本及觀察指標(biāo)

術(shù)后8 h以采血針抽取各組大鼠下腔靜脈血3 mL滴入紅色促凝管，2 mL滴入紫色抗凝管（EDTAK2抗凝管），再取2 mL滴入藍(lán)色抗凝管（3.2%枸櫞酸鈉/3.2%檸檬酸鈉）中。紅色管中血4 000 r/min離心10 min，取一小部分上清液，用于檢查血清淀粉酶（AMS）,將剩余上清液放入-80℃冰箱保存，用于測(cè)定血清IL-6和TNF-α含量；紫色管中血用于檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)（PLT）；藍(lán)色管中血用于檢測(cè)血漿凝血酶原時(shí)間（PT）、血漿D二聚體（D-D）。再取胰腺組織用4%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡下觀察胰腺的組織學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠AMS、TNF-α、IL-6水平比較

與假手術(shù)組大鼠比較，模型組和治療組大鼠血清 IL-6、TNF-α、AMS 水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組大鼠比較，治療組大鼠血清IL-6、TNF-α、AMS 均顯著降低（P＜0.01）。 見表1。

表 1 各組大鼠 AMS、TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n=18）

表 1 各組大鼠 AMS、TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n=18）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 AMS（U/L） TNF-α（pg/mL） IL-6（pg/mL）假手術(shù)組 987±47 19.58±6.64 53.70±5.08模型組 6 885±73* 115.28±7.19* 306.03±6.29*治療組 3 392±50*# 88.27±5.97*# 118.54±5.48*#F值 16.35 28.18 26.55 P值 0.00 0.00 0.00

3.2 血漿PT、D-D、PLT水平比較

與假手術(shù)組大鼠比較，模型組和治療組血漿PT、D-D 均顯著升高，PLT 顯著降低（P＜0.01）；與模型組大鼠比較，治療組大鼠血漿PT、D-D均顯著降低，PLT 顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血漿 PT、D-D、PLT水平比較（±s，n=18）

表2 各組大鼠血漿 PT、D-D、PLT水平比較（±s，n=18）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別 PT（s） D-D（μg/L） PLT（×109/L）假手術(shù)組 16.89±0.95 252.06±11.17 830.52±6.36模型組 22.04±0.65* 338.21±8.75* 711.18±6.3*治療組 19.94±0.69*# 289.89±8.8*# 782.14±7.82*#F值 54.8 14.56 30.78 P值 0.00 0.00 0.00

3.3 胰腺組織光鏡檢查

假手術(shù)組表現(xiàn)為正常的胰腺組織，模型組表現(xiàn)為大量胰腺組織出血、壞死，治療組表現(xiàn)為少量胰腺組織出血、壞死。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理光鏡圖（HE×400）

4 討論

AP是胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原激活引起細(xì)胞自溶的過程,但近年來大量研究表明AP的發(fā)生與發(fā)展不僅取決于胰酶的自家消化，還與胰腺缺血造成的胰腺微循環(huán)障礙及炎性遞質(zhì)導(dǎo)致的多臟器損害有關(guān)[3]。AP時(shí)，損傷的胰腺組織釋放大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子進(jìn)入血循環(huán)，激活凝血途徑，使胰腺內(nèi)微血栓形成，導(dǎo)致胰腺組織的局部缺血，并促發(fā)炎癥介質(zhì)瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)[4]，進(jìn)而引起胰腺及其它臟器微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，影響胰腺的微循環(huán)。

研究表明，TNF-α主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，大量失控性釋放時(shí)具有細(xì)胞毒性作用，介導(dǎo)胰腺局部和全身的凝血反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[5]，被認(rèn)為是AP發(fā)生的觸發(fā)因子，還可以直接損傷多種臟器的細(xì)胞層，導(dǎo)致缺血、出血、壞死、炎癥及水腫。IL-6主要來源于胰腺內(nèi)活化的單核巨噬細(xì)胞,是在內(nèi)毒素、TNF-α、IL-1誘導(dǎo)下產(chǎn)生的，具有廣泛的前炎癥效應(yīng)，影響血液凝固及纖溶系統(tǒng)，導(dǎo)致組織損傷[6]，其水平高低與胰腺炎的嚴(yán)重程度及并發(fā)癥的發(fā)生率呈正相關(guān)。血漿D-D能反映體內(nèi)纖溶酶和凝血酶的活性，可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)的分子標(biāo)志物之一，增高時(shí)多見于各種栓塞，AP患者體內(nèi)凝血功能發(fā)生紊亂，DD明顯升高[7]。PT是外源性凝血途徑的篩選指標(biāo)。PT縮短見于血液高凝狀態(tài)，PT延長(zhǎng)見于凝血因子缺乏、纖溶亢進(jìn)等。AP早期出現(xiàn)微循環(huán)障礙，其微循環(huán)內(nèi)血栓的形成需消耗大量凝血因子，表現(xiàn)出PT明顯延長(zhǎng)[8]。AP早期PLT明顯降低，說明參與了血管內(nèi)血栓的形成，可能與生成減少，自身破壞增多有關(guān)。凝血纖溶的指標(biāo)變化與炎癥反應(yīng)存在因果關(guān)系，機(jī)制可能為：胰腺炎癥致組織細(xì)胞損害、血小板聚集、凝血因子消耗、纖維蛋白降解產(chǎn)物增加，從而引起彌漫性血管內(nèi)凝血，凝血功能紊亂，導(dǎo)致系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，器官功能障礙[9]。

我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為胰腺炎屬“胰癉”范疇，多表現(xiàn)為腹痛、腹脹、惡心、嘔吐、便結(jié)、黃疸等癥狀，歷代醫(yī)家認(rèn)為其病機(jī)是外邪侵襲、飲食不節(jié)、情志失暢、蟲積內(nèi)積等導(dǎo)致的氣滯、瘀血、熱盛、邪結(jié)及厥逆夾雜。但近年來不少醫(yī)家認(rèn)為“毒、瘀”是AP的發(fā)病基礎(chǔ)，也是AP病機(jī)演變的必然，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之微循環(huán)障礙、細(xì)胞因子與炎性介質(zhì)、氧自由基等發(fā)病學(xué)說相吻合[10]。

近年來，應(yīng)用中藥治療AP在動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)方面均取得了一定的進(jìn)展，清胰逐瘀湯具有抗感染、抗炎性介質(zhì)釋放、改善胰腺微循環(huán)障礙作用，方中生大黃苦寒，泄熱通便，同時(shí)具有抗菌作用，且能活血；牡丹皮涼血清熱，活血散瘀，二者合用，共瀉腸腑濕熱瘀結(jié)。桃仁性善破血，助大黃以通瘀滯，紅花活血祛瘀以止痛。丹參、赤芍祛瘀止痛、涼血消腫，合牡丹皮、桃仁、紅花活血祛瘀之力倍增。敗醬草清熱解毒，祛瘀排膿。柴胡疏肝解郁，黃芩和解清熱，兩藥合用可調(diào)肝膽之氣機(jī)。白芍柔肝緩急止痛，與大黃相配可治腹中實(shí)痛，與枳實(shí)相伍可以理氣和血，以除心下滿痛。諸藥合用，共奏祛瘀泄熱之效。

清胰逐瘀湯是我院冷大躍教授治療AP的經(jīng)驗(yàn)方，具有活血化瘀、清熱解毒、滌蕩臟腑瘀毒的作用，已取得顯著療效。因此筆者推測(cè)其治療AP的機(jī)制與其對(duì)炎癥因子IL-6、TNF-α及PLT和凝血纖溶系統(tǒng)的影響有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清胰逐瘀湯治療組大鼠的 IL-6、TNF-α、AMS、PT、D-D 升高程度及PLT降低的程度均較AP模型組有所減輕。胰腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，較之AP模型組，清胰逐瘀湯治療組大鼠組織學(xué)水腫、出血和壞死情況均有明顯改善。以上結(jié)果表明清胰逐瘀湯可明顯降低 AP大鼠血清淀粉酶的活性，減輕大鼠胰腺出血、壞死程度，其改善胰腺微循環(huán)的機(jī)制可能是抑制了TNF-α和IL-6水平的升高，從而減輕了其它炎癥因子的暴發(fā)，進(jìn)而在一定程度上阻斷這些炎性介質(zhì)對(duì)PLT和凝血纖溶系統(tǒng)的破壞及凝血—炎癥間相互促發(fā)的惡性循環(huán)。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Qingyi Zhuyu Decoction on Microcirculation of Rats with Acute Pancreatitis and its Mechanism

XU Han1,LIU Huan2,CHEN Nian2,LENG Dayue2*
（1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.The First Affililiatd Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China）

ObjectiveTo explore the effect and mechanism of Qingyi Zhuyu decoction on microcirculation of rats with acute pancreatitis.MethodsFifty-four Wistar rats were randomly divided into sham-operation group,model group,treatment group.The IL-6,TNF-α,serum amylyse(AMS),Prothrombin time(PT),D-dimer(D-D),platelets(PLT)in each group were examined at 8 h after operation.ResultsCompared with the sham-operation group,the IL-6,TNF-α,AMS,PT and D-D were higher in the model group,but the PLT was lower,the difference was statistically significant (P＜0.01).Compared with the model group,the increased degree of IL-6,TNF-α,AMS,PT and D-D level in treatment group,the reduced degree of PLT were relieved,the difference was statistically significant (P＜0.01).ConclutionQingyi Zhuyu decoction could improve the microcirculation of rats with acute pancreatitis insome extent.Its mechanism was realated to its influence in the inflammatory mediator and coagulation fibrinolysis system of rats with acute pancreatitis,and alleviation of tissues organ's injure caused by microcirculation disturbance.

acute pancreatitis;microcirculation； Qingyi Zhuyu decoction;IL-6;TNF-α;PT;plasma D-dimer

R285.5；R657.5+1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.02.009

2016-06-26

湖南省科技廳項(xiàng)目（2013sk3101）。

徐 寒，女，在讀碩士研究生，方向：中西醫(yī)結(jié)合外科學(xué)。

*冷大躍，男，主任醫(yī)師，E-mail:lengdyaa@126.com。

本文引用：徐 寒，劉 歡，陳 念，冷大躍.清胰逐瘀湯對(duì)急性胰腺炎大鼠微循環(huán)的影響及其機(jī)制[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（2）：149-152.