李文媛，牛強(qiáng)，宋麗華

(1.長治醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，山西 長治 046000； 2.中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院，北京 100032)

·論 著·

卵巢癌中E2通過ERα降低順鉑敏感性的研究

李文媛1，牛強(qiáng)2，宋麗華1

(1.長治醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，山西 長治 046000； 2.中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院，北京 100032)

卵巢癌是最致命的婦科癌癥，約70%的患者被診斷出時(shí)已是晚期。目前卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療是手術(shù)，然后是基于鉑類的化療[1]；但其因?qū)︺K的敏感性降低而容易復(fù)發(fā)[2]。因此了解卵巢癌如何變得鉑耐受并開發(fā)針對(duì)鉑抗性卵巢癌的分子靶向治療非常重要。

細(xì)胞存活和凋亡之間的平衡可以評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療劑的敏感性。我們發(fā)現(xiàn)Akt和ERK通路在卵巢癌細(xì)胞中被順鉑激活，并且參與卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受性調(diào)節(jié)。在卵巢癌細(xì)胞中，ER拮抗劑氟維司群(ICI)可以改善順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞的功效。然而，尚不知道ERα激活是否會(huì)誘導(dǎo)卵巢癌的鉑抗性。在本研究中，我們檢測了順鉑是否通過激活ERK或Akt通路誘導(dǎo)ERα的磷酸化，同時(shí)還研究了E2介導(dǎo)的ERα激活對(duì)順鉑敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染

1.4 細(xì)胞增殖、活性及凋亡實(shí)驗(yàn)

1.5 蛋白質(zhì)印跡

1.6 熒光素酶測定

使用熒光素酶試劑盒檢測。去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，使用PBS洗3次。加入裂解液，充分裂解后10 000×g離心5 min，取上清用于測定。融解螢火蟲螢光素酶檢測試劑和海腎螢光素酶檢測緩沖液，并達(dá)到室溫。按照每個(gè)樣品需100 μl的量，取適量海腎螢光素酶檢測緩沖液，按照1∶100加入海腎螢光素酶檢測底物(稀釋100倍)配制成海腎螢光素酶檢測工作液。每個(gè)樣品測定時(shí)取樣品100 μl。加入100 μl螢火蟲螢光素酶檢測試劑，用槍打勻后測定相對(duì)光單位(relative light unit，RLU)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，LSD用于進(jìn)一步的兩兩比較。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 下調(diào)ERα可抑制E2誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞增殖

2.2 順鉑可誘導(dǎo)ERα在絲氨酸118位點(diǎn)處的磷酸化及其轉(zhuǎn)錄活性

圖2 順鉑可誘導(dǎo)ERα的磷酸化及轉(zhuǎn)錄活性 A.順鉑誘導(dǎo)ERα在絲氨酸118位點(diǎn)處的磷酸化；B.分別為0.1 μmol·L-1E2、10 μmol·L-1ICI和100 μmol·L-1順鉑的不同組合對(duì)ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響；C.分別為100 μmol·L-1順鉑、10 μmol·L-1LY294002和10μmol·L-1PD98059的不同組合對(duì)ERα、AKT和ERK磷酸化的影響；aP<0.05，bP<0.005

2.3 E2通過ERα拮抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性

圖3 E2通過ERα拮抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性 A、B.分別為0.1 μmol·L-1E2、10 μmol·L-1ICI和100 μmol·L-1順鉑的不同組合對(duì)卵巢癌細(xì)胞活性的影響；C.0.1 μmol·L-1E2、10 μmol·L-1ICI和100 μmol·L-1順鉑不同組合的IC50檢測；D、E.ERα被下調(diào)后，0.1 μmol·L-1E2和100 μmol·L-1順鉑的不同組合對(duì)細(xì)胞活性的影響；aP<0.05，bP<0.01

3 討 論

本研究結(jié)果與其他報(bào)道一致，都表明E2通過對(duì)ERK和Akt的調(diào)節(jié)進(jìn)而促進(jìn)ERα表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，但并無相關(guān)報(bào)道說明順鉑在卵巢癌細(xì)胞中可激活ERα。本研究發(fā)現(xiàn)順鉑可誘導(dǎo)ERα在絲氨酸118處的磷酸化，PD98059(ERK抑制劑)而不是LY294002(PI3K/Akt抑制劑)降低順鉑誘導(dǎo)的ERα活化。這些研究結(jié)果表明ERK可能是順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞ERα激活的主要機(jī)制。

激素ERα靶向治療可預(yù)防ERα陽性乳腺癌復(fù)發(fā)并降低死亡率，然而，卵巢癌中對(duì)ERα靶向治療的反應(yīng)有限，他莫昔芬(一種選擇性雌激素受體拮抗劑)對(duì)復(fù)發(fā)性卵巢癌的臨床反應(yīng)率為48%[7]。此外，在卵巢癌的治療中，與一線化療藥物和他莫昔芬聯(lián)合治療并未提高藥物的細(xì)胞毒性[8]。然而，以前的臨床研究并沒有觀察ERα的表達(dá)，需要進(jìn)一步的研究來評(píng)價(jià)ERα表達(dá)情況與他莫昔芬療效之間的關(guān)聯(lián)。ICI是一種新型的雌激素受體拮抗劑，其可競爭性結(jié)合ER，結(jié)合能力比他莫昔芬大約100倍，這種結(jié)合可誘導(dǎo)ER的快速降解，導(dǎo)致E2誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性的抑制[9- 10]。在ERα陽性復(fù)發(fā)性卵巢癌中，ICI的Ⅱ期研究表明，幾乎一半的患者具有臨床療效，并且沒有發(fā)展成2、3或4期腫瘤，ICI在復(fù)發(fā)性卵巢癌患者中具有良好的耐受性和有效性[11- 12]。在本研究中，ICI雖不能增加順鉑的療效，但可抑制E2誘導(dǎo)對(duì)順鉑細(xì)胞毒性的保護(hù)作用，因此，ICI可能用于在E2高表達(dá)的卵巢癌中與順鉑聯(lián)合治療。

綜上，順鉑激活的ERα可被ERK調(diào)節(jié)，同時(shí)，E2誘導(dǎo)的ERα激活可降低順鉑的細(xì)胞毒性，這種降低是通過抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡實(shí)現(xiàn)的。我們還發(fā)現(xiàn)，ERα表達(dá)的下調(diào)可通過抑制E2誘發(fā)的對(duì)順鉑的抗性的拮抗作用，ERα可能是一個(gè)潛在的治療靶標(biāo)，并可應(yīng)用于鉑抗性卵巢癌的治療。此外，以前的臨床研究表明ERα靶向治療在卵巢癌中效果有限。因此，在ERα靶向治療中，新型的ER阻斷劑ICI用于卵巢癌治療新策略十分重要，并且需要選擇ERα高表達(dá)的患者，這對(duì)卵巢癌患者的治療十分有益。

[3] CHAN K K,LEUNG T H,CHAN D W,et al.Targeting estrogen receptor subtypes (ERα and ERβ) with selective ER modulators in ovarian cancer[J].J Endocrinol，2014,221(2):

E2 reduces the sensitivity of cisplatin in ovarian cancer

(1.DepartmentofPharmacy,GraduateSchoolofChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China；2.GeneralHospitalofChinesePeople’sLiberationArmyRocketForce，Beijing100032,China)

R737.31

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