李 翊

(天津市第一醫(yī)院內(nèi)二科, 天津 300232)

定量PCR檢測對侵襲性真菌感染肺組織標(biāo)本病原真菌的診斷價(jià)值*

李 翊

(天津市第一醫(yī)院內(nèi)二科, 天津 300232)

目的：探討應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測技術(shù)診斷侵襲性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)肺組織標(biāo)本病原真菌的臨床意義。 方法：收集2010年6月至2016年6月手術(shù)切除且病理診斷為真菌感染的肺組織標(biāo)本33例為研究對象，設(shè)計(jì)針對真菌的通用引物和針對隱球菌屬和曲霉菌的特異性引物，采用PCR技術(shù)和雙脫氧鏈終止法(Sanger法測序)檢測石蠟包埋肺切除組織中的真菌。 結(jié)果：33份真菌感染的肺組織標(biāo)本PCR檢測結(jié)果均為陽性，與病理診斷相符，Sanger測序可以鑒定真菌到種別。PCR檢測與Sanger測序敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100%比91.67%，P>0.05)，PCR檢測與Sanger測序特異性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100%比100%，P>0.05)；PCR檢測種屬鑒定率顯著優(yōu)于鏡檢(100%比81.82%，χ2=6.60，P=0.01)，PCR檢測與Sanger測序差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100%比90.91%，χ2=3.14，P=0.08)。結(jié)論：定量PCR檢測用于診斷侵襲性真菌感染肺組織標(biāo)本敏感性高、特異性好，具有一定參考意義。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 侵襲性真菌感染； 肺組織； 雙脫氧鏈終止法

侵襲性真菌感染是指真菌侵入人體血液和組織后，經(jīng)生長繁殖對機(jī)體組織、器官功能造成損害并引發(fā)炎癥反應(yīng)的病理過程[1]。隨著免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用、大劑量廣譜抗生素的長期應(yīng)用和環(huán)境因素的危害，侵襲性真菌感染的患病率和死亡率呈現(xiàn)出明顯的上升態(tài)勢[2]?；颊叨嘁驘o特征性臨床表現(xiàn)，而易被細(xì)菌感染、原發(fā)病因遮蓋，錯(cuò)過治療的最佳時(shí)機(jī)[3]。因此，快速準(zhǔn)確的檢出該類病原菌是治療的關(guān)鍵。目前臨床上主要采用人工鏡檢、病理檢查等方法對真菌感染進(jìn)行檢測，但這些方法敏感性較低、檢測時(shí)間長且易受主觀因素影響[4]。定量PCR技術(shù)具有簡便快速、靈敏性和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，能夠在極短時(shí)間內(nèi)檢測處組織中微量的真菌DNA，可以在一定程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足[5]。在此次研究中，我們對比分析了用PCR和Sanger法測序兩種方法來檢測真菌，以期為臨床診斷提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2010年6月至2016年6月間我院行肺大泡和肺癌手術(shù)切除且病理診斷為真菌感染的肺組織標(biāo)本33例為研究對象，其中真菌感染組9例，隱球菌感染組10例，曲霉菌感染組14例。兩組病理標(biāo)本均經(jīng)我院病理科確診。曲霉菌感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：菌絲多呈桿狀且長短不一，直徑為3～5μm，多條菌絲沿相同方向呈45度角反復(fù)分支，呈珊瑚狀或放射狀排列。經(jīng)HE染色后，菌絲與孢子呈灰藍(lán)色，背景略呈紅色，嗜銀染色和糖元染色分別呈黑色和紅色。隱球菌感染診斷：染色后菌體為圓形，外周夾膜肥厚呈透明狀，內(nèi)有反光孢子，無菌絲。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提?。簩?片6μm石蠟組織切片裝入0.5mlDEXPEA溶液EP管中，蓋上管蓋后于100℃水浴鍋中加熱2min，冷至室溫后加入3U/100μl破壁酶，于37℃環(huán)境中靜置45min。于100℃加熱5min,將EP管搖晃3次混勻，繼續(xù)加熱5min，4℃下離心10min，冰浴靜置5min。用移液槍吸取吸附樹脂膠狀物上的水層，置入EP管中，加入0.1倍體積的3M醋酸鈉和2.5倍體積的無水乙醇后搖勻。于-20℃下靜置30min～1h，4℃下離心10min。去除上清液，加入70%乙醇1ml,4℃下離心10min,去除上清液，將沉淀干燥后用20～25μl的TE緩沖液溶解。

1.2.2 引物設(shè)計(jì):見表1。

在美國國家生物技術(shù)信息中心的GenBankDNA序列數(shù)據(jù)庫中查找隱球菌屬、曲霉菌和真菌通用的基因序列，通過pubmed檢索真菌種屬特異性引物或采用Blast軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物委托南京金斯瑞公司合成。

表1 PCR和Sanger測序引物表

1.2.3 PCR反應(yīng)體系：采用普通PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)體系為DNA模板5μL，濃度為20nmoL/μL的引物1μL，Taq酶25μL，補(bǔ)充重蒸水至50μL。于94℃下預(yù)變性4Min,再變性45s，于57℃下退火45s，72℃下延伸45s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。

1.2.4 Sanger測序：Sanger測序委托南京金斯瑞公司完成。

1.3 觀察指標(biāo)：記錄PCR檢測及Sanger測序?qū)?組肺組織標(biāo)本的鑒定結(jié)果，考察其敏感性、特異度及種屬鑒定率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織標(biāo)本的檢測結(jié)果比較：33份真菌感染肺組織標(biāo)本經(jīng)真菌通用引物擴(kuò)增，PCR檢測結(jié)果均為陽性，隱球菌感染組、曲霉菌感染組經(jīng)曲霉菌屬引物、隱球菌屬引物擴(kuò)增，PCR檢測結(jié)果與病理診斷相符。具體結(jié)果見表2。

表2 肺組織標(biāo)本的PCR檢測、Sanger檢測結(jié)果比較

表3 PCR檢測與Sanger測序敏感性與特異性比較

2.2 PCR檢測與Sanger測序敏感性及特異性比較：33例患者均經(jīng)病理診斷確診，真菌感染組不能具體到種屬，因而不能與PRC方法進(jìn)行敏感性和特異性比較。PCR檢測結(jié)果顯示，敏感性為100%，特異性為100%，Sanger測序結(jié)果顯示，敏感性為91.67%，特異性為100%。PCR檢測與Sanger檢測敏感性與特異性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體結(jié)果見表3。

表4 PCR檢測及Sanger測序鑒定真菌種屬比較n(%)

2.3 真菌種屬鑒定統(tǒng)計(jì)：隱球菌感染組中的10份肺組織標(biāo)本病理診斷為真菌感染，鏡檢不能鑒定其真菌種屬，PCR檢測可以鑒定真菌種屬；除有三份標(biāo)本Sanger測序不明外，其余30份肺組織標(biāo)本均可鑒定真菌種屬。PCR檢測種屬鑒定率顯著優(yōu)于鏡檢(100%比81.82%，χ2=6.60，P=0.01)，PCR檢測與Sanger測序差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100%比90.91%，χ2=3.14，P=0.08)，具體結(jié)果見表4。

3 討 論

侵襲性真菌感染又稱系統(tǒng)性真菌感染或深部真菌感染，是一種病死率高的機(jī)會(huì)性感染疾病，最常發(fā)于呼吸系統(tǒng)[6]。近年來，侵襲性真菌感染的發(fā)病率顯著上升，相應(yīng)病原菌譜也在不斷變化，且耐藥率顯著增加[7]。侵襲性真菌感染缺乏典型臨床癥狀，影像學(xué)表現(xiàn)特異性低，實(shí)驗(yàn)室檢查陽性率低，這導(dǎo)致其診斷難度大，漏診、誤診率高[8]。

目前針對侵襲性真菌感染的診斷方法主要包括影像學(xué)檢查、病理組織學(xué)檢查、特異性抗原測定和無菌部位組織鏡檢等[9]。影像學(xué)檢查包括MRI、X線片等，對于肺部侵襲性真菌感染診斷具有一定價(jià)值，但是影像學(xué)特征不具有特異性，也可見于其他病原菌感染。病理組織學(xué)檢查是有創(chuàng)檢查，包括病理組織染色、活組織檢查和真菌形態(tài)學(xué)等部分，其診斷正確率與患者免疫功能、病灶性質(zhì)、技師水平、標(biāo)本處理方法緊密相關(guān)，且費(fèi)用高、操作復(fù)雜、陽性率低。

PCR是一種新興的分子生物學(xué)技術(shù)，可對特定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，可用于檢測細(xì)菌、真菌、病毒等病原體。PCR用于檢測全血、血清標(biāo)本具有較高敏感性和特異性，近年來陸續(xù)有PCR用于檢測肺組織標(biāo)本的報(bào)道。Sanger法主要用于分析DNA序列，通過測定病原體和腫瘤基因的突變序列能夠鑒定真菌種類、發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。其中真菌感染組9例，隱球菌感染組10，曲霉菌感染組14例。結(jié)果顯示，所有組織標(biāo)本PCR檢測均為陽性，與病理診斷結(jié)果相符。真菌感染組中9份標(biāo)本，PCR檢測證實(shí)為曲霉菌6份，隱球菌3份， Sanger測序結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)A組中曲霉菌感染組織標(biāo)本可以分為煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉感染，實(shí)驗(yàn)B組中隱球菌感染組織標(biāo)本可以分為格魯比隱球菌、格特隱球菌感染，真菌感染組中真菌感染組織標(biāo)本可以分為煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、格魯比隱球菌感染。真菌感染組、隱球菌感染組、曲霉菌感染組各有1例Sanger測序不明。

隱球菌感染組、曲霉菌感染組均經(jīng)病理明確診斷，真菌感染組不能具體到種屬，因而不能與PRC方法進(jìn)行敏感性和特異性比較，PCR和Sanger測序檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)得，PCR方法對應(yīng)的敏感性和特異性分別為100%，Sanger法對應(yīng)的敏感性和特異性為91.67%和100%，兩組比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，統(tǒng)計(jì)三種方法對真菌種屬的鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR方法用于鑒定真菌種屬的能力顯著優(yōu)于鏡檢(P=0.01)，Sanger測序用于鑒定真菌種屬的能力與鏡檢差異不具有明顯差異。

病理鏡檢雖能根據(jù)病原結(jié)構(gòu)特點(diǎn)判斷是否為真菌感染，但由于部分真菌存在結(jié)構(gòu)相似的特點(diǎn)，鏡檢不能有效鑒定真菌種屬。本次研究結(jié)果也證實(shí)，PCR方法在鑒定真菌種屬方面明顯優(yōu)于鏡檢。本研究中Sanger測序有3份結(jié)果不忙，分析原因可能是標(biāo)本中的真菌未經(jīng)培養(yǎng)分離純化，可能同時(shí)含有兩種或兩種以上的真菌，另一方面可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程中存在污染。

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1006-6233(2017)06-0999-03

天津市衛(wèi)生局科研基金項(xiàng)目，(編號：2013JM40132)

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10.3969/j.issn.1006-6233.2017.06.036