魏亞芬 殷萍 劉永丹 盧沖 李晶鑫 劉麗 吳珊珊 肖淑媛

并發(fā)麻痹性腸梗阻的實驗性自身免疫性神經(jīng)炎的研究

魏亞芬 殷萍 劉永丹 盧沖 李晶鑫 劉麗 吳珊珊 肖淑媛

目的 對并發(fā)麻痹性腸梗阻的實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)進行探究。方法 60只健康清潔級的雄性Lewis大鼠,隨機分成三組,第一組為200 μg P2(57-81)多肽特異性肽段實驗性自身免疫性神經(jīng)炎組,第二組為400 μg P2(57-81)多肽特異性肽段實驗性自身免疫性神經(jīng)炎組,第三組為對照組,各20只。分析每組大鼠的臨床癱瘓評分,評價炎性細胞浸潤和脫髓鞘的情況。結果 實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組的大鼠全部發(fā)病,對照組大鼠沒有發(fā)病。第二組大鼠最大臨床癱瘓評分(7.25±0.36)分高于第一組(7.02±0.43)分,發(fā)病時間(5.05±0.61)d早于第一組(6.51±0.50)d,癱瘓持續(xù)時間(37.12±1.01)d長于第一組(23.81±1.76)d,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第一組和第二組的高峰期開始時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組第18天、第35天、第45天3個不同時間坐骨神經(jīng)HE染色炎性細胞比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第一組第18天、第35天、第45天坐骨神經(jīng)HE染色炎性細胞均低于第二組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 在致敏第45天,400 μg P2(57-81)多肽組仍有炎性反應,一些重度格林巴利綜合征在慢性癱瘓下不恢復階段可能會存在自身免疫反應。

麻痹性腸梗阻；實驗性自身免疫性神經(jīng)炎；格林巴利綜合征

格林巴利綜合征又稱為急性感染性多發(fā)性神經(jīng)炎,與格林巴利綜合征有相似臨床表現(xiàn)和免疫學特點的是實驗性自身免疫性神經(jīng)炎,它是由于T細胞介導,出現(xiàn)的一種周圍神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘性自身免疫疾病,利用實驗性自身免疫性神經(jīng)炎對于人類研究格林巴利綜合征有重要的意義,是研究格林巴利綜合征的理想動物模型［1-4］。為探究并發(fā)麻痹性腸梗阻的實驗性自身免疫性神經(jīng)炎,特選取Lewis大鼠建立實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇60只健康清潔級的雄性Lewis大鼠,4～6周齡,體重150～160 g,將其隨機分成三組,第一組為200 μg P2(57-81)多肽特異性肽段實驗性自身免疫性神經(jīng)炎組,第二組為400 μg P2(57-81)多肽特異性肽段實驗性自身免疫性神經(jīng)炎組,第三組為對照組,各20只。選取的主要試劑P2(57-81)多肽特異性肽段序列為f、k、n、t、e、i、s、f、k、l、g、q、e、f、e、e、t、t、a、d、n、r、k、t、k,其他試劑有結核菌素,抗大鼠二抗PV-6002,大鼠抗兔一抗CD4、CD8、CD68免疫試劑,Incomplete Freund佐劑等。

1.2 方法 建立實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型,對模型組的Lewis大鼠注射P2(57-81)多肽特異性肽段,從大鼠尾根部皮下注射致敏原,分別以200 μg或者400 μg P2(57-81)多肽,混合2 mg的結核菌素,100 μl的生理鹽水以及100 μl的不完全福氏佐劑,對照組以同樣的方式注射。從大鼠致敏的當天開始每天對大鼠臨床癱瘓評分進行記錄,一直觀察到致敏45 d。在大鼠致敏的第18天、第35天、第45天分別處死大鼠,對雙側坐骨神經(jīng)進行蘇木精-伊紅(HE)染色,并記錄浸潤炎性反應細胞的平均數(shù)。采用二步法對坐骨神經(jīng)CD4、CD8、 CD68免疫組織化學染色。

1.3 觀察指標及評定標準 比較三組的發(fā)病時間、癱瘓持續(xù)時間、高峰期開始時間及臨床癱瘓評分。臨床癱瘓評分標準［5］：無異常為0分；大鼠尾巴尖上翹,尾部的張力減少為1分；尾部癱瘓,翻正反射部分缺失為2分；翻正反射完全缺失為3分；姿態(tài)和步調(diào)異常為4分；后肢有輕微癱瘓為5分；后肢中度癱瘓為6分；后肢嚴重癱瘓為7分；四肢癱瘓為8分；瀕臨死亡為9分；死亡為10分。對三組大鼠致敏的第18天、第35天、第45天坐骨神經(jīng)HE染色炎性細胞進行比較。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗；多組比較采用方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 第一組和第二組大鼠臨床癱瘓評分、發(fā)病時間、癱瘓持續(xù)時間及高峰期開始時間比較 實驗性自身免疫性神經(jīng)炎模型組的大鼠全部發(fā)病,對照組大鼠沒有發(fā)病。第二組大鼠最大臨床癱瘓評分(7.25±0.36)分高于第一組(7.02±0.43)分,發(fā)病時間(5.05±0.61)d早于第一組(6.51±0.50)d,癱瘓持續(xù)時間(37.12±1.01)d長于第一組(23.81±1.76)d,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第一組和第二組的高峰期開始時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 第一組和第二組坐骨神經(jīng)HE染色炎性細胞比較 兩組第18天、第35天、第45天3個不同時間坐骨神經(jīng)HE染色炎性細胞比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第一組第18天、第35天、第45天坐骨神經(jīng)HE染色炎性細胞均低于第二組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 第一組和第二組大鼠臨床癱瘓評分、發(fā)病時間、癱瘓持續(xù)時間及高峰期開始時間比較(±s)

表1 第一組和第二組大鼠臨床癱瘓評分、發(fā)病時間、癱瘓持續(xù)時間及高峰期開始時間比較(±s)

注：與第二組比較,aP<0.05,bP>0.05

組別 只數(shù) 最大臨床癱瘓評分(分) 發(fā)病時間(d) 癱瘓持續(xù)時間(d) 高峰期開始時間(d)第一組 20 7.02±0.43a 6.51±0.50a 23.81±1.76a 15.22±2.07b第二組 20 7.25±0.36 5.05±0.61 37.12±1.01 15.38±1.71

表2 第一組和第二組坐骨神經(jīng)HE染色炎性細胞比較(±s)

表2 第一組和第二組坐骨神經(jīng)HE染色炎性細胞比較(±s)

注：與第二組比較,aP<0.05；組內(nèi)不同時間比較,P<0.05

組別 只數(shù) 第18天 第35天 第45天 F P第一組 20 419.5±72.4a 90.6±41.3a 0a 418.24 0.000第二組 20 495.6±55.1 221.4±35.2 90.6±14.3 385.92 0.000

3 討論

實驗性自身免疫性神經(jīng)炎動物模型可以利用抗原特異性的自身免疫性T細胞,注入大鼠尾靜脈在大鼠體內(nèi)誘導而成,也可以從周圍神經(jīng)組織、髓鞘蛋白成分或者其他合成的多肽免疫誘導而成［6-9］。有研究已經(jīng)證實,實驗性自身免疫性神經(jīng)炎癱瘓的程度和導致神經(jīng)炎抗原接種的劑量、種類有關系,P2(57-81)多肽比P0(180-199)多肽的致敏性要高［10］。P2具有膜蛋白的理化特性,P2蛋白誘導實驗性自身免疫性神經(jīng)炎中,Lewis大鼠的免疫反應最強［11］。在格林巴利綜合征中,如果出現(xiàn)腹腔神經(jīng)叢副交感神經(jīng)受損,可能出現(xiàn)麻痹性腸梗阻,副交感神經(jīng)功能損壞,使胃腸平滑肌蠕動受到抑制,出現(xiàn)脊神經(jīng)脫髓鞘,首先累及植物神經(jīng)節(jié),導致出現(xiàn)特發(fā)性全植物神經(jīng)功能不全,在臨床上出現(xiàn)腸梗阻［12-15］。早期通過大劑量注射人免疫球蛋白可以緩解患者的癥狀,減少顱神經(jīng)損害,促進四肢肌力的恢復［16］。

總之,實驗性自身免疫性神經(jīng)炎的發(fā)病機制是針對神經(jīng)髓鞘或者神經(jīng)軸索的組織成分的一種自身免疫反應,巨噬細胞、T細胞參與了這一過程,同時趨化因子、細胞因子、基質金屬蛋白酶也是參與因素。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.06.097

2017-02-09］

哈爾濱應用技術研究與開發(fā)項目(項目編號：2014RFXGJ082)

150036 黑龍江省醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科

殷萍