段艷芳 (本刊記者)

科學聚焦

合成生物學的里程碑：釀酒酵母基因組合成

段艷芳 (本刊記者)

每一個物種都擁有一套獨一無二的遺傳信息，哪怕是結構和功能最簡單的生命體，想要在實驗室里“創(chuàng)造”出來，也曾經被認為幾乎是不可能的。盡管如此，科學家從未停止對生命奧秘的探索。近年來，以“通過創(chuàng)造來理解”為核心理念的合成生物學快速興起，其中一個方向即通過大規(guī)模的工程化設計和遺傳操作，將人工合成的DNA序列組合拼接在一起，組裝成有功能的基因組，從而創(chuàng)造全新的生命體[1]。

釀酒酵母基因組合成計劃(Sc2.0計劃)是目前正在進行中的首個真核生物基因組全合成計劃，旨在重新設計并完整地合成釀酒酵母的16條染色體，并將其作為系統(tǒng)地研究真核生物染色體結構與功能的平臺。該計劃被稱為Sc2.0計劃，以區(qū)別于野生型酵母，其中“Sc”是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的簡寫。2017年3月，美國《科學》雜志以專刊的形式報道了該項目的最新進展：新合成5條完整的酵母染色體(synII、synV、synVI、synX、synXII)和一條完成一半的染色體(synIXR)，合成任務已完成1/3，從而將“Sc2.0計劃”向前推進了一大步。

1 Sc2.0計劃：國際合作的大科學計劃

Sc2.0計劃是繼人類基因組計劃后基因組學方面的另一項國際合作的大科學計劃，也是人類首次嘗試改造并從頭合成真核生物的計劃。該計劃由紐約大學朗格尼醫(yī)學中心的酵母遺傳學家杰夫?伯克(Jef Boeke)發(fā)起，來自美國、中國、英國、法國、澳大利亞、新加坡等多國研究機構的200多位科學家共同參與并分工協(xié)作。

釀酒酵母是一種單細胞真核生物，也是分子生物學實驗室最常用的實驗材料和生命科學領域最重要的模式生物之一。作為首個完成測序的真核生物，早在1996年，包含16條染色體、約1 200萬個堿基對、約6 000個基因的釀酒酵母基因組序列就已全部測序完成，為人類基因組計劃的順利實施奠定了基礎。2014年，在歷經長達7年的研究后，Sc2.0計劃研究團隊成功地合成了第一條能正常行使功能的釀酒酵母3號染色體(synIII)，標志著構建完整的真核生物基因組的歷史階段已經開啟。

2017年3月，酵母基因組的重新設計工作已經全部完成，染色體合成和組裝任務完成1/3。圖1列出了Sc2.0計劃的任務分配和完成進度，全球多家研究機構共同參與了該研究計劃。根據計劃，研究團隊將在2017年年內完成酵母全部染色體的合成任務。

2 Sc2.0計劃：中國科學家由“跟跑”到“并跑”

值得關注的是，在“Sc2.0計劃”這項國際合作研究中，中國科學家發(fā)揮了重要的作用?！犊茖W》專刊中報道的研究進展包括synII、synV、synVI、synX和synXII在內的5條完整酵母染色體的人工合成以及synIX染色體右臂(synIXR)的合成，其中中國科學家負責了大部分研究，即完成4條染色體的合成并且開發(fā)了一些新技術。

天津大學元英進教授帶領研究團隊完成了5號(synV)和10號(synX)染色體的化學合成。該團隊通過共轉化策略和CRISPR/Cas9技術修復了合成過程中的點突變，使得長為536 kb的synV合成序列與設計序列“完美”地保持一致。在人工合成長約707 kb的synX過程中，元英進團隊開發(fā)了高效的染色體缺陷靶點定位技術——庫RCR標簽圖譜(PoPM)。該技術可以鑒定出影響細胞適應度的遺傳突變，并且可以推廣到任何含有水印標簽的人工合成基因組。

圖1 Sc2.0計劃染色體合成的任務分配[2]。圖中標識出了釀酒酵母染色體(羅馬數字所示)及其相對大小(千堿基對)，以及進行染色體合成、組裝和調試的主要研究機構。黑點：染色體著絲粒的位置。藍色：完成合成；黃色：完成設計，正在合成或組裝。I和VIII紐約大學；II和VII愛丁堡大學+華大基因；III和IX約翰·霍普金斯大學；IV紐約大學+美國能源部聯(lián)合基因組研究所；V和X天津大學；VI約翰·霍普金斯大學+紐約大學+金思瑞公司；XI倫敦帝國理工學院；XII清華大學；XIII華大基因；XIV麥考瑞大學+澳大利亞葡萄酒研究所；XV新加坡國立大學；XVI麥考瑞大學；tRNA新染色體：愛丁堡大學

清華大學戴俊彪研究員帶領團隊完成了目前已合成的最長的真核線性染色體——全長為976 kb的12號染色體(synXII)的設計與合成。天然的釀酒酵母16條染色體中，12號染色體長度最長，功能最為特殊，其長約為2.5 Mb(百萬個堿基對)，含有一個約由150個重復單元組成的長約1.5 Mb的核糖體DNA(rDNA)區(qū)域。該區(qū)域形成了細胞核內一個特殊結構——核仁，是核糖體形成和組裝的場所。由于synXII太長，在合成過程中，研究團隊采取了分級組裝策略：在6個菌株中分別完成了對染色體不同區(qū)域內源DNA的逐步替換；然后，利用酵母減數分裂過程中同源重組的特性，將多個菌株中的合成序列進行合并，從而獲得完整的人工合成染色體。在synXII的組裝過程中，rDNA區(qū)域首先被完整地保留下來，接著在合成染色體上被完全去除，最后在基因組3個不同的位置上利用修飾過的rDNA進行再生。

深圳華大基因研究院楊煥明院士團隊聯(lián)合英國愛丁堡大學團隊完成了長為770 kb的2號染色體(synII)的設計、合成和鑒定，并對synII進行了深度基因型－表型關聯(lián)分析。通過一系列的表型測試、結構和功能基因組分析發(fā)現，盡管存在細微差別，包含synII的菌株能夠像天然菌株那樣，表現出對環(huán)境的高度適應性。

從“人類基因組計劃”時承擔1%的測序任務，到在“Sc2.0計劃”中承擔重要研究工作，中國科學家更深入地參與國際科技合作。中國科學家已經由“跟跑”到“并跑”，成為該國際科技合作項目的研究主力之一。

3 Sc2.0計劃：從設計到組裝

基因組是指一套染色體中完整的DNA序列，既包含編碼基因又包括大量非編碼序列。在漫長的生物演化過程之中，作為最終調控所有生命活動的遺傳物質，基因組一直處于動態(tài)變化中?；蚩赡軙粍h除、復制和插入到別的位置，能夠發(fā)生重組和重排，也可能會因轉座子的入侵而喪失功能。這些變化又受制于變幻莫測的自然選擇，使得基因組在排列組織上并非基于空間上的有效性和經濟性，而是可能基于生物演化歷史中的一系列偶然事件。即便是研究最為深入的酵母，人們對其基因組的認知依然十分有限。

隨著DNA合成與分析技術的迅猛發(fā)展，合成生物學正在快速興起，從而為更深刻、更全面地了解生命提供一種全新的思路。Sc2.0計劃對酵母這一研究最為透徹的真核生物的基因組藍圖進行重新組織和設計，既能深入分析染色體的結構與功能，解答生物學基本問題，同時也能夠得到在醫(yī)藥、能源、環(huán)境、農業(yè)、工業(yè)等領域有重要應用潛力的酵母菌株。

對釀酒酵母基因組進行精心設計，是Sc2.0計劃開始階段的關鍵所在。野生型釀酒酵母基因組序列是設計的起點，通過BioStudio軟件對基因組序列進行設計。一些通用的設計原則主要包括：①刪除重復序列和絕大部分內含子序列；②將TAG終止密碼子置換為TAA終止密碼子；③將轉運RNA(tRNA)基因移動至“新染色體”；④在全部染色體上非必需基因的3′末端引入對稱型loxP位點；⑤引入可與天然DNA進行區(qū)分的PCR標簽。

這些設計，力求在精簡基因組、保持基因組的正常生理功能和賦予基因組一定的可變性之間取得平衡。通過刪除重復或冗余序列，對酵母基因組進行了精簡；為了便于大規(guī)模的工程操作而引入必需的標簽序列，以便區(qū)分人工合成染色體與天然染色體；利用Cre/loxP重組系統(tǒng)，在人工合成染色體中引入突變和篩選機制。Cre重組酶是源于噬菌體P1的一種酶蛋白，能專一性催化兩個loxP位點間的DNA進行特異性重組，導致DNA序列倒置或缺失。這樣的設計，意在探索染色體重組和修飾對酵母活性和功能的影響，相當于在實驗室里建立酵母快速演化的模型，體現出Sc2.0計劃對酵母演化基本問題的探索。

野生型酵母基因組大小為12 071 kb。按照設計，人工合成的16條酵母染色體共有11 353 kb，刪減了約6%的基因組。雖然有刪減和替換，但總體上來說，依然屬于對基因組比較“溫和”的改變，這也是保證人工合成染色體能夠具有正常生理功能的重要因素。

在組裝階段，通過一步操作將整條酵母染色體置換為人工合成的染色體太困難，因此研究團隊采用逐步的、分層次的組裝策略。以約750 bp的寡核苷酸為起點，將其裝配成2～3 kb的小片段，再進一步裝配成約10 kb的大片段。3～6個這樣的片段通過限制性內切酶的酶切和連接過程組裝成30～60 kb的巨區(qū)段(megachunk)。最后，利用酵母的同源重組機制，每次將長為30～60 kb的野生型基因組大片段用相對應的人工合成的區(qū)段置換出來。這樣操作的好處是可以對每次同源重組的效果進行評估，若出現致死表型或者可檢測到的適應缺陷可以及時糾錯。即按照“設計—構建—組裝—測試—學習”的循環(huán)逐步完成人工染色體的構建。每個巨區(qū)段(除了最末端一個區(qū)段)都攜帶一個營養(yǎng)缺陷型篩選標記，通過交替使用URA3和LEU2兩個篩選標記，逐步完成整條染色體的裝配過程。

Sc2.0計劃運用工程化的手段重新裝配和構建酵母的16條染色體。每條構建完成的人工染色體開始時都分散于不同的酵母菌株中，若將不同的酵母人工合成染色體整合至同一個酵母菌株，需要利用酵母的特點：不同結合型的單倍體酵母可以雜交形成二倍體，二倍體酵母在適當的培養(yǎng)條件下可以形成單倍體的孢子。然而，由于減數分裂過程發(fā)生多次染色體同源重組，人工合成染色體中往往含有很多天然染色體的區(qū)段，篩選含有多條完整人工合成染色體的子代細胞更是困難。為此，研究人員建立了“核內再復制雜交”(endoreduplication intercross)的方法，成功獲得同時含有多條人工合成染色體的酵母菌株。圖2展示了運用該方法將synIII和synIXR整合至同一酵母菌株的過程。

圖2 運用核內再復制雜交方法將synIII和synIXR兩條人工合成染色體整合至同一酵母菌株[2]。首先改造III和IXR兩條野生型染色體的著絲粒，使著絲粒的功能既可以保持又可以被抑制；分別含有synIII和synIXR的兩個酵母菌株雜交，并同時抑制III和IXR著絲粒的功能，相當于雜交后的二倍體酵母含有“2n-2”條染色體；通過酵母的核內再復制現象，兩條人工合成的染色體再次復制，即形成synIII/synIII和synIXR/synIXR同源染色體，酵母染色體重新回復到2n條。含有多個合成染色體的酵母單倍體菌株通過孢子制備和分離獲得

目前，研究團隊已經將synII、synIII、synV、synVI、synX和synXII共六條人工合成染色體的酵母整合至同一酵母菌株，而且該酵母菌株可以像野生型酵母那樣具有正常的表型和生理功能(圖3)。距離構建完整真核生物基因組已經不再遙遠。

圖3 同時包含6條人工合成染色體的酵母具備與野生型酵母一樣的正常生理功能[3]

4 Sc2.0計劃：首個人造真核生物

在Sc2.0計劃之前，人工合成生命體僅限于簡單的細菌。2010年，克雷格?文特爾研究所合成大小為1 078 kb的絲狀支原體(Mycoplasma mycoides)精簡版本的基因組，并將其植入細胞，成功構建世界上首個完全人工合成生命體——JCVI-syn1.0的細菌。支原體是能夠自主生活的最小的原核生物。2016年，該團隊在syn1.0的基礎上設計并合成了有最小基因組的自主生活生命體——僅包含473個基因的syn3.0，成為合成生物學的標志性成果之一。

Syn3.0的合成，旨在探索能夠支持生命活動的最小基因組的內容是什么，而“Sc2.0計劃”為在真核生物中揭示同樣的問題打開了一扇門。

釀酒酵母作為單細胞的真核生物，體積比原核生物大得多，基因組信息更為龐大復雜，細胞結構也復雜得多。Sc2.0計劃在復雜程度和技術難度上都非細菌人工合成可比擬的，這是科學家首次嘗試改造并從頭合成真核生物，成為合成生物學發(fā)展的新階段?！案淖兓蚪M就像賭博。一個錯誤的變化，就可能殺死細胞，”Sc2.0計劃的發(fā)起人伯克說，“而我們的酵母仍然活著，這非常重要，說明我們的合成染色體生命力頑強，賦予酵母新的屬性?！?“如果說基因組測序是‘讀懂生命密碼’，基因組合成就是在‘編寫生命密碼’，從讀到寫，是一個巨大飛躍?！比A大基因理事長楊煥明院士評價說。同濟大學傅繼梁教授認為：“Sc2.0計劃是非常有意義的一項研究，其設計體現了一種新的研究思路，在合成過程中能夠促進實驗技術的進步，并且在產業(yè)方面有極大的應用潛力，可以大大加快在醫(yī)藥、能源或環(huán)境等領域有重要應用的酵母新菌株的開發(fā)，無疑是合成生物學發(fā)展的一個里程碑，也標志著合成生物學從理論到現實的轉變?！?/p>

在Sc2.0計劃從設計到組裝的不斷試錯過程中，加深對基因組的理解與認識。酵母中揭示的復雜而保守的調控機制，對其他高等生物基因組結構與功能的研究具有重要的借鑒意義。另外，大量對稱型loxP位點的插入是極具創(chuàng)新性的研究方法。它可以通過基因組重排實現快速演化，為深入分析或者改變染色體結構與功能提供無限的可能性，也為產業(yè)上的應用奠定了基礎。

(2017年4月25日收稿)

[1] 傅繼梁. 基因: 探究、思辨與創(chuàng)新[M].上海: 上海科學技術出版社, 2016.

[2] RICHARDSON S M, MITCHELL L A, STRACQUADANIO G, et al. Design of a synthetic yeast genome [J]. Science, 2017, 355: 1040-1044.

[3] KANNAN K, GIBSON D G. Yeast genome, by design. Scientists are inching closer to generating a synthetic eukaryotic cell [J]. Science, 2017, 355: 1024-1025.

（編輯：溫文）

Milestone of synthetic biology: the synthetic yeast genome project

DUAN Yanfang

10.3969/j.issn.0253-9608.2017.03.010

?通信作者，E-mail: yfduan@shu.edu.cn