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摘 要：優(yōu)化魚類腸道外源乳酸桿菌DNA提取的方法。樣本勻漿后加入PEG8000（40%）1000rpm離心10min，可以沉淀并去除影響DNA提取質(zhì)量及抑制Real-timePCR反應(yīng)的雜質(zhì)。平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，對(duì)比未處理前樣品，離心上清保留90%以上的菌液，同時(shí)雜質(zhì)的去除大幅度地降低了樣本的背景值。本研究為優(yōu)化魚類腸道外源乳酸桿菌定量分析體系提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：DNA提??；前處理；微生物多樣性定性定量

目前國內(nèi)外對(duì)腸道乳酸桿菌的定量方法主要有培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法。培養(yǎng)法主要采用對(duì)腸內(nèi)容物樣本平板計(jì)數(shù)法，是最原始的計(jì)數(shù)方法，易操作好掌握，成本低，但耗時(shí)長，且只能檢測(cè)活菌數(shù)量。在多種免培養(yǎng)法中，Real-time PCR技術(shù)已廣泛運(yùn)用于各個(gè)領(lǐng)域的微生物定量中，一般步驟包括樣本前處理、DNA提取、PCR計(jì)數(shù)，該方法最主要的優(yōu)勢(shì)為不僅可以計(jì)數(shù)活菌還可以計(jì)數(shù)死菌量，大量研究表明，死菌同樣具有益生功效，通過特異性引物的設(shè)計(jì)可以達(dá)到絕對(duì)定量。

本研究旨在優(yōu)化腸道外源添加乳酸桿菌定量方法體系，確定針對(duì)于魚類腸道樣本前處理的最佳方法，解決快速、準(zhǔn)確定量魚類腸道外源添加乳酸桿菌的計(jì)數(shù)方法。為以后深入研究菌群代謝提供技術(shù)依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料

（1） 試驗(yàn)動(dòng)物。

羅非魚1.5～2.5g（貴州省羅甸羅非魚養(yǎng)殖場(chǎng)），斑馬魚0.3～0.5g（貴州省都勻市觀賞魚市場(chǎng)）。正式試驗(yàn)進(jìn)行前，試驗(yàn)動(dòng)物均在適宜條件下暫養(yǎng)，確保其健康。

（2） 試驗(yàn)菌株。

菌株來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所水產(chǎn)研究室保存菌株。在MRS培養(yǎng)基中靜置37℃培養(yǎng)12 h。

（3） 試劑耗材。

PEG8000，MRS液體培養(yǎng)基，MRS固體培養(yǎng)基（oxide），溶菌酶粉末，溶菌酶緩沖液，5M NaCl，CTAB/NaCl，氯仿，異戊醇，tris飽和酚，乙醇，20×TE緩沖液，10%SDS，蛋白酶K，100μm、40μm細(xì)胞過濾器（Biologix，美國），DNA小提試劑盒（Qiagen，德國）。

（4） 主要儀器。

T10勻漿器（IKA，德國），TDZ5-WS 多管架臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀），SPX-80生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠），Gel Doc XR+凝膠成像儀（Bio-rad，美國）等。

2.方法

（1）樣本前處理優(yōu)化。

JCM1149為MRS卡納抗性，卡納濃度12.5ng/ml。對(duì)于方法A和方法B，選取羅非魚12條，上午10點(diǎn)喂食，下午2點(diǎn)腸道取樣。其中11條每條腸道均添加JCM1149菌液1ml。1條羅非魚腸道直接勻漿稀釋涂板。菌液稀釋涂板計(jì)數(shù)。

方法A：震蕩靜止取上清法對(duì)比常規(guī)勻漿處理。4條剪開腸道較為強(qiáng)烈的震蕩（1200rpm/min），靜止，取上清，4條為全腸勻漿，處理后五個(gè)重復(fù)梯度稀釋涂板（卡納抗性MRS板），剩余樣本12000rpm，5min離心，留沉淀于-80℃，用于DNA提取。

方法B：3條勻漿后再加入MRS1ml，100um濾網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)過40um濾網(wǎng)再次過濾，留濾液2ml梯度稀釋涂板。涂板后，12000rpm，5min離心，沉淀于-80℃。

方法C：在10ml，20%，40%PEG8000中分別加入2ml菌液，1000rpm離心10min，20min后取上清2ml，上清下1ml，剩余9ml混勻后稀釋涂板，梯度稀釋，3個(gè)重復(fù)。計(jì)數(shù)經(jīng)過不同濃度的PE8000，不同離心時(shí)間前處理后的菌落數(shù)，比對(duì)未經(jīng)處理JCM1149純菌數(shù)，計(jì)算此方法的回收率。

方法D：將JCM1149菌液，加入9ml滅菌后的MRS中，終體積10ml；取2條羅非魚腸道，于上一步10ml含JCM1149菌液的PBS中，充分勻漿，混勻。取4個(gè)15ml細(xì)胞離心管分別加入10ml40%PEG8000，于上層分別緩慢加入2ml勻漿后樣本，分別以不同轉(zhuǎn)速（1000rpm，1500rpm），不同時(shí)間（10min，20min）離心；取離心后上清，上清下1ml，剩余液體9ml混勻分別梯度稀釋，3個(gè)重復(fù)，涂板計(jì)數(shù)；JCM1149原液梯度稀釋涂板計(jì)數(shù)。涂板稀釋后剩余樣本均12000rpm，5min離心，留沉淀于-80℃，用于DNA提取。

二、結(jié)果與分析

1.樣本前處理優(yōu)化結(jié)果

不同方法前處理羅非魚腸道，比較回收率，可見震蕩靜止取上清方法獲取的目的菌約為原始勻漿方法的50%，而100μm，40μm濾網(wǎng)過濾只占添加菌液的15.64%（表1）。當(dāng)PEG80000濃度是40%，且離心時(shí)間為1000rpm，10min時(shí)JCM1149菌液回收率最高，高達(dá)91.04%（表2），進(jìn)一步摸索對(duì)于羅非魚腸道PEG8000前處理的最佳離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，結(jié)果當(dāng)PEG80000濃度是40%，且離心時(shí)間為1000rpm，10min時(shí)回收率最高（表3），這與之前試驗(yàn)結(jié)果相符，且PEG8000處理，可沉淀大量雜質(zhì)（圖1）。因此，后面試驗(yàn)均使用40%PEG8000，1000rpm，10min離心作為DNA提取前處理樣品。

三、討論

羅非魚屬于雜食性，腸道菌群多樣化（Saravanan and Geurden et al. 2012），勻漿方式前處理腸道樣本回收率最高，且大于100%，分析是復(fù)雜的腸道菌群結(jié)構(gòu)，含有部分適應(yīng)該濃度卡納抗性的菌群所致。而震蕩取上清方法，對(duì)于沉淀的時(shí)間較難把握，過短則不能沉淀大量雜質(zhì)，過長則使大量細(xì)菌沉淀，降低回收率。過濾法，二次過濾，濾網(wǎng)孔徑較小，由于雜質(zhì)的存在，容易堵塞濾孔，所需時(shí)間冗長，更換濾網(wǎng)造成更大損失，但擴(kuò)大濾網(wǎng)孔徑，則不能很好的除去雜質(zhì)。

PEG（polyethylene glycol，聚乙二醇）是一種高分子滲壓劑，用于對(duì)樣本的沉淀，分離純化作用，可用來沉淀蛋白質(zhì)等（Matsuda and Waldo et al. 1988）。有研究用PEG處理對(duì)云南松種子，研究其對(duì)種族發(fā)芽及生理生化特性的影響。結(jié)果表明， PEG處理種子發(fā)芽率、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有顯著變化（王曉麗與曹子林等， 2012）。不同分子量的PEG聚乙二醇，分子量的大小會(huì)影響PEG在粒子上的吸附牢固程度及粒子的相互作用，PEG鏈長過短，粒子易脫落，過長則使粒子不易脫落（施一鳴與單國榮， 2013）。聚乙二醇沉淀（PEG8000）可以沉淀小球藻病毒FJ-1，最佳使用量為 PEG8000 7%和4%氯化鈉，但PEG8000的沉淀效率低于超速離心法（Han and Kang et al. 2000）。免疫學(xué)上，對(duì)于循環(huán)免疫復(fù)合物的沉淀，PEG也有好的結(jié)果（Herreman and Godeau et al. 1978）。研究疾病時(shí)，從血漿中獲得的沉淀物用PEG重懸純化，得到的在PEG中的沉淀物再次重懸，進(jìn)行后續(xù)研究，有很好的純化作用（Ristol and Gensana et al. 1996）。20%PEG8000濃度過低，不足以阻止含所需樣本的MRS層停留在上清，導(dǎo)致目的菌沉入上清以下的部分。

對(duì)比純菌涂板結(jié)果，40%PEG8000處理后回收率最高，可以初步確定PEG8000用于樣本前處理的可行性，但隨著離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的增長，回收率顯著降低，表明離心轉(zhuǎn)速與回收率高低密切相關(guān)。為了進(jìn)一步確定合適的離心時(shí)間和離心轉(zhuǎn)速，因此降低增大的離心轉(zhuǎn)速，由2000rpm改為1500rpm，再次驗(yàn)證，結(jié)果仍然為1000rpm，10min回收率最高，且1500rpm，20min回收率顯著降低。MRS上清于PEG8000分界線不顯著，出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，結(jié)果證明隨著離心轉(zhuǎn)速增大和離心時(shí)間的增長，使大量目的菌離開含MRS上清，向PEG8000層移動(dòng)，導(dǎo)致回收率降低。

參考文獻(xiàn)：

[1] 任大勇， 曹婧， 章檢明， 等. 6種乳酸菌計(jì)數(shù)方法比較[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械， 2012， 27： 1-4.

[2] 戴方偉， 宋曉明， 周莎桑， 等. 大鼠腸內(nèi)容物細(xì)菌基因組DNA提取方法的比較[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2011， 19（3）： 246-249.

[3] 陳蓓， 黃瑞. 糞便標(biāo)本中細(xì)菌DNA提取方法的比較[J]. 中國血液流變學(xué)雜志， 2007， 17（2）： 210-212.

[4] 何夙旭， 周志剛， 姚斌， 等. 3 種DNA 提取方法對(duì)養(yǎng)殖池塘不同生境菌群PCR-DGGE 分析的影響[J ] . 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2009 ，11 （1） ：73279.

[5] Matthew Jemielita， Michael J. Taormina， Adam R. Burns， et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut[J]. RESEARCH ARTICLE， 2014， 5（6）： 1-8.