高宇，劉中美，劉克，周哲敏，崔文璟

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雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化富馬酸制備β-丙氨酸的工藝的建立與優(yōu)化

高宇，劉中美，劉克，周哲敏，崔文璟

江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122

高宇, 劉中美, 劉克, 等. 雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化富馬酸制備β-丙氨酸的工藝的建立與優(yōu)化. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(5): 875–879.Gao Y, Liu ZM, Liu K, et al. Biocatalytic access to β-alanine by a two-enzyme cascade synthesis. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 875–879.

酶轉(zhuǎn)化法是生產(chǎn)β-丙氨酸的重要途徑，但單一酶法轉(zhuǎn)化存在底物價格較高的問題。通過構(gòu)建雙酶催化體系制備β-丙氨酸，即將來源于大腸桿菌的天冬氨酸酶 (AspA) 和來源于谷氨酸棒桿菌的L-天冬氨酸 α-脫羧酶 (PanD) 偶聯(lián)，以富馬酸和氨為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)合成β-丙氨酸。催化反應(yīng)中AspA與PanD的最適加酶比例為1∶80，其中AspA的濃度為10 μg/mL，轉(zhuǎn)化溫度為37 ℃，pH為7.0；濃度為100 mmol/L的富馬酸可在8 h內(nèi)被完全轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率為100%，摩爾產(chǎn)率為90.9%，β-丙氨酸的產(chǎn)量為90 mmol/L，約為7 g/L；濃度為200 mmol/L的富馬酸在反應(yīng)8 h后，體系中β-丙氨酸的產(chǎn)量為126 mmol/L，約合9.8 g/L，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，轉(zhuǎn)化率并沒有明顯提高。根據(jù)該研究提出的雙酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化工藝可將價格低廉的富馬酸一步轉(zhuǎn)化為具有高附加值的β-丙氨酸。

天冬氨酸酶，L-天冬氨酸 α-脫羧酶，β-丙氨酸，天冬氨酸酶，雙酶偶聯(lián)

β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β-型氨基酸，也是一種非蛋白氨基酸，存在于某些細(xì)菌、真菌和植物中[1]。β-丙氨酸及其衍生物在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)藥方面，β-丙氨酸用于合成泛酸、泛酸鈣、肌肽、帕米膦酸鈉和巴柳氮等[2]；在化工方面應(yīng)用于電鍍、鉛中毒解毒劑及合成甜味劑[3]。國內(nèi)外β-丙氨酸的生產(chǎn)主要以化學(xué)合成法為主[4]，即以丙烯酸或丙烯腈為底物進(jìn)行合成，此法生產(chǎn)過程中消耗大量能量，同時對環(huán)境和生物體都有一定的毒害作用。另一種生產(chǎn)方法是生物合成法，利用L-天冬氨酸α-脫羧酶(L-aspartate α-decarboxylase，EC4.1.1.11，PanD)、以L-天冬氨酸為底物催化生成β-丙氨酸[5]，此法專一性高且環(huán)保，缺點是L-天冬氨酸價格偏高。

L-天冬氨酸α-脫羧酶催化L-天冬氨酸脫去α位的羧基生成β-丙氨酸，是生物體內(nèi)泛酸合成途徑中重要的酶。諸多報道對不同來源的PanD進(jìn)行了詳細(xì)的研究[6-8]，其中來源于谷氨酸棒桿菌的PanD酶是一類依賴于丙酮酰基的四聚體脫羧酶，其特點為酶活高且能夠在菌體內(nèi)進(jìn)行自裂解。酶法制備β-丙氨酸的研究中，浙江工業(yè)大學(xué)張瀟瀟[9]通過將鈍齒棒桿菌來源panD基因重組到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)并優(yōu)化條件，最終β-丙氨酸的產(chǎn)量達(dá)到76.47 mg/L；華東理工大學(xué)范海洋[10]優(yōu)化大腸桿菌來源PanD重組菌，將產(chǎn)量提高至130 mg/L；浙江工業(yè)大學(xué)樓堅等[11]最終將發(fā)酵液中β-丙氨酸的產(chǎn)量提高至649 mg/L。

工業(yè)生產(chǎn)天冬氨酸，主要是由天冬氨酸酶(L-Aspartase，EC4.3.1.1，AspA) 催化富馬酸加氨合成L-天冬氨酸。大腸桿菌來源AspA由4個相同的亞基組成，單體分子量為50 kDa左右。AspA催化富馬酸加氨合成L-天冬氨酸的反應(yīng)為可逆反應(yīng)，所以富馬酸不能完全轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸[12-13]。

因為富馬酸價格較天冬氨酸低廉，本研究以富馬酸和氨水為底物，構(gòu)建AspA和PanD雙酶偶聯(lián)制備β-丙氨酸體系。通過條件優(yōu)化，確定了最適酶比例和最適底物濃度，使整個反應(yīng)體系中無中間產(chǎn)物L(fēng)-天冬氨酸積累，將價格低廉的富馬酸轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物。本研究為制備β-丙氨酸提供了新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

重組菌株BL21 pET-28a-和BL21 pET-24a-，均為實驗室前期構(gòu)建。

的種子培養(yǎng)基為 Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 Terrific-Broth (TB) 培養(yǎng)基。

1.1.2 生化試劑

富馬酸、L-天冬氨酸鈉、β-丙氨酸均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PanD酶的表達(dá)

將重組大腸桿菌BL21/pET24a-接種于 4 mL卡那霉素濃度為100 μg/mL的TB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將上述過夜培養(yǎng)物按1%的接種量接種于含卡那霉素濃度為100 μg/mL的TB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液600至0.6–0.8，加入IPTG至終濃度0.8 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16–20 h，收集菌體超聲破碎，通過Tris-tricine SDS-PAGE方法[14]分析鑒定重組蛋白表達(dá)水平。

1.2.2 AspA酶的表達(dá)

將重組大腸桿菌BL21/pET28a-接種于 4 mL卡那霉素濃度為100 μg/mL的TB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將上述過夜培養(yǎng)物按1%的接種量接種于含卡那霉素濃度為100 μg/mL的TB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液600為0.6–0.8，加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，24 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16–20 h，收集菌體超聲破碎，通過SDS-PAGE分析鑒定重組蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 重組蛋白的純化和鑒定

將重組菌體溶于結(jié)合緩沖溶液(50 mmol/L Na2HPO4、50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)，超聲破碎，離心，上清用0.22 μm 濾膜過濾。用10倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液平衡5 mL的His Trap HF柱，取20 mL的破碎上清上樣，用10倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液洗去非特異性吸附的蛋白，分別用8倍柱體積的150、300和500 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫蛋白，收集樣品后用透析袋密封，置于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.0) 中4 ℃透析6–8 h，去除殘余咪唑，并用SDS-PAGE分析鑒定。

1.2.4 蛋白濃度的測定

蛋白質(zhì)定量采用常規(guī)的Bradford法[15]。

1.2.5 L-天冬氨酸及β-丙氨酸的測定

反應(yīng)液用苯基異硫酸酯 (PITC) 衍生，具體步驟為：取500 μL反應(yīng)液于1.5 mL離心管，加入250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液和250 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混勻，避光室溫放置0.5 h，加入700 μL正己烷溶液，渦旋振蕩器振蕩1 min，靜置30–60 min，吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)樣量為10 μL[16]。

β-丙氨酸衍生產(chǎn)物用HPLC測定[17]。色譜柱為 La Chrom C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相A溶液為80% (/) 已腈水溶液，B溶液為97∶3 (/，pH 6.5) 的0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈溶液；采用梯度洗脫：0–20 min，B溶液由95%下降到65%；20–30 min，B液由65%上升到95%；30–35 min，B溶液梯度不變。檢測波長為254 nm，柱溫為40 ℃。所測得衍生產(chǎn)物的含量等同于衍生前物質(zhì)的含量。

1.2.6 富馬酸的測定

反應(yīng)液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后用HPLC檢測，色譜柱為Prevail Organic Acid (OA)分析柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)。流動相為20%甲醇溶液 (磷酸調(diào)pH至2.2)，流速為0.6 mL/min，檢測波長為220 nm，柱溫為40 ℃，檢測時間為15 min，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.7 AspA催化富馬酸生成L-天冬氨酸

取20 μL AspA酶液 (0.5 mg/mL) 加到終濃度為50 mmol/L的NaH2PO4/Na2HPO4(pH 7.0) 緩沖液中，然后在該體系中加入100 μL濃度為500 mmol/L的富馬酸 (NH4調(diào)pH至7.0)、10 μL濃度為100 mmol/L的MgCl2、無菌水補(bǔ)足1 mL反應(yīng)體系，37 ℃、200 r/min下進(jìn)行酶促反應(yīng) (振蕩反應(yīng))，終止反應(yīng)時取適量反應(yīng)液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，利用HPLC檢測產(chǎn)物生成量。

1.2.8 PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸反應(yīng)進(jìn)程的測定

取200 μL PanD酶液 (2 mg/mL) 加到終濃度為50 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液(pH 7.0) 中，然后在該體系中加入100 μL濃度為500 mmol/L的L-天冬氨酸溶液，最后用無菌水補(bǔ)足至1 mL反應(yīng)體系，37 ℃、200 r/min下進(jìn)行酶促反應(yīng) (振蕩反應(yīng))，終止反應(yīng)時取適量反應(yīng)液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，利用HPLC檢測產(chǎn)物生成量。

1.2.9 雙酶串聯(lián)反應(yīng)

在含有一定濃度的底物富馬酸和足量氨 (調(diào)pH至7.0) 的10 mL反應(yīng)液中，加入一定比例的兩種酶，反應(yīng)體系中含有1 mmol/L的MgCl2，50 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液 (pH 7.0)，37 ℃、200 r/min下進(jìn)行酶促反應(yīng) (振蕩反應(yīng))，終止反應(yīng)時取適量反應(yīng)液于100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，用0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，利用HPLC檢測反應(yīng)液中各成分的含量，計算β-丙氨酸的產(chǎn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的表達(dá)和純化

攜帶和目的基因的重組大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)，細(xì)胞超聲破碎后的細(xì)胞破碎液經(jīng)親和柱純化后，得到電泳純的重組蛋白。結(jié)果如圖1A所示，純化后的AspA蛋白為50 kDa左右，與AspA的理論分子量一致。

Tris-tricine電泳 (圖1B) 結(jié)果顯示大部分PanD單體已自身裂解為α亞基 (12.4 kDa) 和β亞基 (2.8 kDa)。β亞基在Tris-tricine凝膠上發(fā)生一定的遷移，是由于分子量小的蛋白形成球形，其較高的多肽內(nèi)部的電荷不能被結(jié)合的SDS電荷所覆蓋，所以偏離了相對遷移率和分子量對數(shù)的相互關(guān)系。電泳結(jié)果表明，在大腸桿菌中成功表達(dá)了大腸桿菌來源的和谷氨酸棒桿菌來源的。

2.2 雙酶偶聯(lián)催化富馬酸生成β-丙氨酸

2.2.1 AspA催化富馬酸加氨生成L-天冬氨酸

10 μg/mL的AspA純酶催化50 mmol/L的富馬酸，結(jié)果如圖2所示。催化反應(yīng)在2 h后即達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，由于該反應(yīng)是可逆反應(yīng)，即使延長反應(yīng)時間，L-天冬氨酸的摩爾產(chǎn)率仍為75%。

2.2.2 PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸

400 μg/mL PanD催化L-天冬氨酸合成β-丙氨酸的反應(yīng)情況如圖3所示，50 mmol/L底物可在8 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸，轉(zhuǎn)化率約為98%。

圖1 重組蛋白及純化電泳鑒定

圖2 AspA催化富馬酸生成L-天冬氨酸

圖3 PanD催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸

2.3 優(yōu)化兩種酶比例

上述結(jié)果可知，PanD的酶活較AspA低，催化反應(yīng)進(jìn)行較慢，是雙酶體系中的限速酶。PanD的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，最適pH為7.0左右[18]，而AspA的最適條件分別為55 ℃和pH 8.0左右[19]。由于偶聯(lián)反應(yīng)時間較長，考慮到蛋白酶在55 ℃條件下的反應(yīng)12 h酶活損失嚴(yán)重，設(shè)定雙酶偶聯(lián)體系反應(yīng)條件為37 ℃、pH 7.0。

在雙酶偶聯(lián)催化體系中，固定富馬酸濃度為 50 mmol/L，AspA的添加濃度為10 μg/mL，調(diào)整PanD的添加量，使AspA與PanD的加酶質(zhì)量比分別為1∶40、1∶60、1∶80，進(jìn)行雙酶偶聯(lián)反應(yīng)。

結(jié)果如圖4所示，在1∶40和1∶60 (/) 的反應(yīng)體系中，反應(yīng)8 h，β-丙氨酸的產(chǎn)率只有82%和93%，且尚有部分中間產(chǎn)物未完全轉(zhuǎn)化，留在反應(yīng)體系中，反應(yīng)至12 h，1∶40的反應(yīng)體系中仍有中間產(chǎn)物。

而在1∶80的反應(yīng)體系中，反應(yīng)8 h，富馬酸可完全轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸，β-丙氨酸的產(chǎn)率>95%，中間產(chǎn)物L(fēng)-天冬氨酸無殘余。

隨著PanD濃度的提高，β-丙氨酸的合成速度大大增加，且中間產(chǎn)物L(fēng)-天冬氨酸的殘余量減少。綜合考慮選擇1∶80 (/) 作為最適濃度比。

2.4 優(yōu)化底物富馬酸濃度

前期研究以50 mmol/L的富馬酸為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)研究，此濃度無法滿足高濃度制備β-丙氨酸的要求，故將AspA和PanD按照1∶80 (/) 的比例催化濃度為50、100、200 mmol/L的富馬酸，HPLC檢測β-丙氨酸含量 (表1)。同時監(jiān)測了200 mmol/L富馬酸反應(yīng)進(jìn)程中富馬酸、天冬氨酸與β-丙氨酸的變化情況 (圖5)。

表1結(jié)果顯示，底物濃度為50 mmol/L時，酶促反應(yīng)能在8 h內(nèi)轉(zhuǎn)化率達(dá)100%；底物濃度為100 mmol/L時，8 h內(nèi)摩爾生成率為90%，合成β-丙氨酸的濃度為90 mmol/L，24 h后β-丙氨酸的產(chǎn)率在95%左右；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾又?00 mmol/L時，反應(yīng)速度明顯減緩，8 h內(nèi)β-丙氨酸的摩爾生成率為62%，體系中β-丙氨酸的濃度為126 mmol/L，延長反應(yīng)時間至24 h后，β-丙氨酸的摩生成爾率為70%。圖5結(jié)果顯示底物濃度為200 mmol/L時，反應(yīng)12 h后殘余約40 mmol/L的中間產(chǎn)物L(fēng)-天冬氨酸，我們推測是由于高濃度的β-丙氨酸對PanD酶有抑制作用，使得β-丙氨酸得率在高濃度底物條件下反而降低至62%。

圖5 雙酶偶聯(lián)體系催化200 mmol/L富馬酸

表1 不同底物濃度下雙酶偶聯(lián)體系轉(zhuǎn)化生成β-丙氨酸的濃度

雙酶偶聯(lián)酶促反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率隨著時間的延長而增加，但由于反應(yīng)逐漸趨于平衡，且振蕩反應(yīng)過程中部分酶會失活，24 h后反應(yīng)體系中可明顯觀察到白色懸浮物，推斷為蛋白酶變性沉淀。

3 結(jié)論

本文利用AspA和PanD構(gòu)建雙酶偶聯(lián)反應(yīng)體系，催化底物富馬酸合成β-丙氨酸。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，確定最佳反應(yīng)條件：100 mmol/L富馬酸，AspA與PanD比例為1∶80，其中AspA的濃度為10 μg/mL，溫度37 ℃，pH 7.0。此條件下，8 h時β-丙氨酸的濃度為90 mmol/L，約合7 g/L。提高富馬酸濃度為200 mmol/L，8 h底物的摩爾生成率為63%，β-丙氨酸的濃度約為126 mmol/L，約合10 g/L，相較之前的研究有顯著的提高。然而就工業(yè)生產(chǎn)而言，β-丙氨酸的產(chǎn)量仍有很大提升空間。有文獻(xiàn)報道真核來源的PanD酶具有更高的催化活性，下一步將考慮用真核來源PanD酶替代谷氨酸棒桿菌來源的PanD酶，進(jìn)一步提高β-丙氨酸的產(chǎn)量。同時，細(xì)胞催化具有可重復(fù)利用、操作簡便等優(yōu)點，建立并優(yōu)化全細(xì)胞催化工藝是下一步研究方向。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Biocatalytic access to β-alanine by a two-enzyme cascade synthesis

Yu Gao, Zhongmei Liu, Ke Liu, Zhemin Zhou, and Wenjing Cui

College of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Enzymatic synthesis is an important way to produce β-alanine, but the biological method is expensive generally because of the high price of substrate. In this paper, a two-step enzymatic cascade system was developed, combining L-aspartase fromDH5α and L-aspartate α-decarboxylase from. This system catalyzes Fumarate and ammonia to β-alanine. The optimal ratio of AspA and PanD was 1:80 (/), and the concentration of AspA was 10 μg/mL, at 37 ℃ and pH 7.0. When the concentration of Fumarate was 100 mmol/L, the reaction reached its equilibrium after 8 h, and the yield of β-alanine was 90 mmol/L (7 g/L). The yield of β-alanine can reach 126 mmol/L (9.8 g/L) when the concentration of Fumarate increased to 200 mmol/L. Extending reaction time, the conversion rate did not change obviously. Using this two-step enzymatic cascade system, β-alanine from cheaper substrate Fumarate can be obtained.

L-aspartase, L-aspartate α-decarboxylase, β-alanine, L-aspartase, enzyme cascade

November 1, 2016; Accepted: January 24, 2017

Wenjing Cui. Tel/Fax: +86-510-85197551; E-mail: wjcui@jiangnan.edu.cn

10.13345/j.cjb.160416

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