付婷婷，胡瑋，陳勇，魏歡，楊光

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反芻獸月形單胞菌β-木糖苷酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

付婷婷*，胡瑋*，陳勇，魏歡，楊光

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052

付婷婷, 胡瑋, 陳勇, 等. 反芻獸月形單胞菌β-木糖苷酶基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì). 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 785–795.Fu TT, Hu W, Chen Y, et al. High-level expression and characterization of Selenomonas ruminantium β-xylosidase in Pichia pastoris. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 785–795.

β-木糖苷酶 (β-xylosidase，酶編號(hào)EC 3.2.1.37) 是木聚糖降解酶系中的重要組成部分。本研究以畢赤酵母GS115為宿主菌嘗試表達(dá)反芻獸月形單胞菌中的β-木糖苷酶基因。根據(jù)畢赤酵母對(duì)密碼子的偏愛(ài)性、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、GC含量和稀有密碼子，對(duì)基因進(jìn)行優(yōu)化；通過(guò)基因合成技術(shù)獲得了全長(zhǎng)基因并構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體pPIC9K-；以Ⅱ酶切重組載體pPIC9K-，電擊轉(zhuǎn)化將基因?qū)氘叧嘟湍窯S115中，獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)表型和遺傳霉素G418抗性篩選、PCR鑒定，得到表達(dá)β-木糖苷酶基因的工程菌GS115-pPIC9K-；通過(guò)活性測(cè)定獲得高效表達(dá)β-木糖苷酶的重組酵母，并對(duì)重組β-木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，重組β-木糖苷酶的分子量約為66 kDa。在發(fā)酵罐水平表達(dá)的酶活性達(dá)到了287.61 IU/mL。對(duì)酶學(xué)性質(zhì)研究顯示，該酶在溫度為40?60 ℃，pH為5.0?7.0時(shí)較穩(wěn)定，其最適反應(yīng)溫度和pH分別為55 ℃和6.0，專(zhuān)一性地作用于β-木糖苷鍵。Mn2+和Ca2+對(duì)該酶具有激活作用，而Fe3+、Cu2+、Co2+、Mg2+、EDTA及SDS抑制其酶活性。本研究首次將反芻獸月形單胞菌的β-木糖苷酶基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中獲得表達(dá)，并具有較高活性，為進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

反芻獸月形單胞菌，β-木糖苷酶，畢赤酵母，異源表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)

β-木糖苷酶 (β-xylosidase，酶編號(hào)為EC 3.2.1.37) 是木聚糖降解酶系中的一種，主要催化水解木糖苷和以外切方式作用于低聚合度木寡糖 (木二糖和木三糖) 的非還原性末端生成木糖[1]，在造紙、生物能源、食品、飼料以及醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[2]。

反芻獸月形單胞菌是瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌，占瘤胃總細(xì)菌的21%? 50%[3]，是利用低聚木糖的重要微生物，其降解低聚木糖的能力與木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性呈正相關(guān)[4]。由反芻獸月形單胞菌產(chǎn)生的β-木糖苷酶Sxa是具有β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的雙功能酶[5]。與以往發(fā)現(xiàn)的β-木糖苷酶相比，Sxa的活性更高，其cat和cat/m是目前發(fā)現(xiàn)的其他β-木糖苷酶的10倍[5]。由此可見(jiàn)，反芻獸月形單胞菌產(chǎn)生的木糖苷酶Sxa具有較好的商業(yè)價(jià)值。然而，反芻獸月形單胞菌為嚴(yán)格厭氧菌，直接利用其生產(chǎn)Sxa的成本較高。

本研究以為目的基因，根據(jù)宿主菌畢赤酵母密碼子的偏愛(ài)性等對(duì)來(lái)源于反芻獸月形單胞菌的β-木糖苷酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過(guò)全基因合成技術(shù)得到新的β-木糖苷酶基因，構(gòu)建重組載體pPIC9K-，并在畢赤酵母中表達(dá)；同時(shí)，對(duì)重組β-木糖苷酶mSxa的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌DH5α、宿主菌畢赤酵母GS115和表達(dá)載體pPIC9K為本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司；地衣多糖、大麥β-葡聚糖、燕麥木聚糖購(gòu)自Megazyme公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 反芻獸月形單胞菌β-木糖苷酶基因的優(yōu)化與基因的合成

在GenBank中檢索反芻獸月形單胞菌β-木糖苷酶基因(GenBank Accession No. AF040720.1) DNA序列，經(jīng)SignalP 4.1軟件在線分析Sxa是否存在潛在的信號(hào)肽序列；在不改變?cè)蠸xa氨基酸順序的情況下，利用Optimum GeneTM根據(jù)畢赤酵母對(duì)密碼子的偏愛(ài)性、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、GC含量和稀有密碼子進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的核苷酸序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成獲得優(yōu)化后的β-木糖苷酶基因。合成的基因和酵母表達(dá)載體pPIC9K用限制性內(nèi)切酶BⅠ和Ⅱ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物采用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。經(jīng)純化后的基因和表達(dá)載體pPIC9K用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建基因的酵母表達(dá)載體pPIC9K-。將pPIC9K-轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)過(guò)菌落PCR和限制性內(nèi)切酶鑒定后，由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3 重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及篩選

用限制性內(nèi)切酶Ⅱ?qū)⒅亟M質(zhì)粒pPIC9K-線性化，并用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化回收后，使用BTX ECM399電轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。將細(xì)胞涂布于葡萄糖再生培養(yǎng)基 (Regeneration dextrose base, RDB) 平板上，29 ℃培養(yǎng)48 h。挑選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞在最小葡萄糖培養(yǎng)基(Minimal dextrose medium，MD) 和最小甲醇培養(yǎng)基 (Minimal methanol medium，MM) 板上進(jìn)行甲醇利用慢型 (Muts) 和甲醇利用正常型 (Mut+) 的表型篩選，再經(jīng)不同濃度梯度遺傳霉素G418 (Geneticin?) 的抗性篩選以及PCR鑒定，得到高拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.4 重組β-木糖苷酶mSxa的誘導(dǎo)表達(dá)

選取表型為Muts、抗6 mg/mL G418的9個(gè)高拷貝轉(zhuǎn)化子分別于試管和搖瓶中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)每24 h補(bǔ)加甲醇1次至終濃度為0.5%。采用試管表達(dá)時(shí)培養(yǎng)48 h后結(jié)束；采用搖瓶表達(dá)時(shí)培養(yǎng)144 h結(jié)束，同時(shí)每12 h取5 mL菌液用于測(cè)定β-木糖苷酶酶活性。

1.5 重組β-木糖苷酶mSxa的活性檢測(cè)

1.5.1 剛果紅平板染色法定性檢測(cè)β-木糖苷酶活性

分別取培養(yǎng)96 h的宿主菌GS115、轉(zhuǎn)化pPIC9K空載體的重組菌以及pPIC9K-重組菌誘導(dǎo)表達(dá)0、60和96 h后的培養(yǎng)上清液80 μL，滴至含5 mmol/L對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷(-Nitrophenyl β-D-xyloside，NPX) 瓊脂平板的牛津杯中，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16?18 h，取出牛津杯在平板上緩慢添加適量0.1%剛果紅染液，靜置30 min，用適量1 mol/L 氯化鈉溶液進(jìn)行脫色30?60 min，再用適量0.5%乙酸固定平板。根據(jù)剛果紅染色平板上透明圈的直徑初步判斷表達(dá)產(chǎn)物的酶活性。

1.5.2 β-木糖苷酶活性的定量測(cè)定

參考胡瑋的方法定量測(cè)定β-木糖苷酶酶活性[6]。1個(gè)木糖苷酶活性單位 (IU) 為：以5 mmol/LNPX為底物，每分鐘在pH 6.0和55 ℃條件下分解NPX生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.6 重組β-木糖苷酶mSxa高密度誘導(dǎo)表達(dá)

參考Hoggins等[7]的方法進(jìn)行高密度發(fā)酵。在裝有6 L發(fā)酵FM22/PMT4培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種1%的種子液，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)114 h，每12 h取10 mL樣品，用于測(cè)定酶活性。

1.7 發(fā)酵上清的SDS-PAGE

取1 mL發(fā)酵上清液加入0.1 mL的100% 三氯乙酸 (TCA)，混勻后于-20℃放置30 min，離心20 min，棄上清后向沉淀加入0.2 mL冷丙酮洗去TCA，加入20 μL上樣緩沖液混勻后進(jìn)行SDS-PAGE。

1.8 重組β-木糖苷酶mSxa酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.8.1 表達(dá)產(chǎn)物的濃縮和純化

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)離心后，取6 mL發(fā)酵上清液經(jīng)超濾濃縮至1 mL。以G-75葡聚糖凝膠對(duì)濃縮上清進(jìn)行層析純化，用部分收集器每30 s收集1管。取2.5 μL于280 nm處測(cè)定280，通過(guò)280初步判定蛋白質(zhì)所在洗脫組分。

1.8.2 mSxa的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

1) 取200 μL適當(dāng)稀釋的重組β-木糖苷酶溶液，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃條件下與 5 mmol/LNPX于pH 6.0條件下反應(yīng)10 min，然后加入2 mol/L碳酸鈉750 μL終止反應(yīng)，測(cè)定酶活性。2) 取200 μL適當(dāng)稀釋的重組β-木糖苷酶液，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃條件下保持30 min后，在55 ℃及pH 6.0條件下測(cè)定其剩余酶活性，以最適溫度條件下的酶活性為100%計(jì)算各處理的相對(duì)酶活性。

1.8.3 mSxa的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

1) 取200 μL適當(dāng)稀釋的重組β-木糖苷酶液溶，分別在pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10和11及55 ℃條件下測(cè)定酶活性。2) 取200 μL適當(dāng)稀釋的重組β-木糖苷酶溶液，分別在pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10和11及55 ℃條件下保持30 min后測(cè)定剩余酶活性，以最適pH條件下的酶活性為100%計(jì)算各處理的相對(duì)酶活性。

1.8.4 mSxa的底物特異性

取200 μL適當(dāng)稀釋的重組β-木糖苷酶液，分別以大麥β-葡聚糖、地衣多糖、燕麥木聚糖、NPX和羧甲基纖維素鈉為底物在pH 6和55 ℃條件下測(cè)定酶活性，以最適底物的酶活性為100%計(jì)算各底物的相對(duì)酶活性。

1.8.5 金屬離子、螯合劑和表面活性劑對(duì)mSxa酶活性的影響

在最適反應(yīng)體系中加入適當(dāng)濃度的金屬離子 (FeCl3、MnSO4、CuSO4、CoCl2、CaSO4和MgSO4)，螯合劑 (EDTA) 和表面活性劑(SDS)，使金屬離子、螯合劑和表面活性劑的濃度為5 mmol/L，在pH 6和55 ℃條件下測(cè)定酶活性，以加入等體積緩沖液的樣品酶活性為100%計(jì)算各組相對(duì)酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 反芻獸月形單胞菌β-木糖苷酶基因的優(yōu)化與合成

經(jīng)DNA測(cè)序后確認(rèn)，人工合成的基因全長(zhǎng)1 617 bp，共編碼538個(gè)氨基酸殘基，與設(shè)計(jì)的優(yōu)化序列 (圖1) 完全一致。與基因(GenBank Accession No. AF040720.1) 相比，優(yōu)化核苷酸385個(gè)，涉及340個(gè)密碼子，優(yōu)化前后的序列的相似性為76.10%。通過(guò)Optimum GeneTM軟件分析后發(fā)現(xiàn)，密碼子優(yōu)化指數(shù)由優(yōu)化前的0.63提高到優(yōu)化后的0.85，GC含量由優(yōu)化前的53.68%降低至優(yōu)化后的43.68%，基因含有6.00%的稀有密碼子，優(yōu)化后被全部消除。

圖1 反芻獸月形單胞菌β-木糖苷酶Sxa基因優(yōu)化前和優(yōu)化后序列的比較

2.2 表達(dá)高活性β-木糖苷酶重組酵母的篩選

通過(guò)表型和抗遺傳霉素篩選，累積獲得9個(gè)抗6 mg/mL G418的Muts轉(zhuǎn)化子。在試管中，木糖苷酶的平均活性為1.98 IU/mL，其中91號(hào)轉(zhuǎn)化子酶活性明顯高于其他轉(zhuǎn)化子，其活性為8.56 IU/mL，是其他轉(zhuǎn)化子平均活性的7.3倍 (圖2)。后續(xù)研究均選取第91號(hào)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行。

2.3 平板剛果紅法鑒定重組β-木糖苷酶活性

如圖3所示，畢赤酵母GS115和轉(zhuǎn)化空表達(dá)載體pPIC9K的GS115誘導(dǎo)96 h后以及轉(zhuǎn)化pPIC9K-的GS115誘導(dǎo)前的培養(yǎng)上清未產(chǎn)生透明圈，表明畢赤酵母GS115和轉(zhuǎn)化空表達(dá)載體pPIC9K的GS115無(wú)木糖苷酶活性。轉(zhuǎn)化pPIC9K-的GS115誘導(dǎo)60和96 h后的培養(yǎng)上清產(chǎn)生了明顯的透明圈，誘導(dǎo)60 h后產(chǎn)生的透明圈直徑為13 mm，誘導(dǎo)96 h后的透明圈直徑為21 mm。這表明基因在畢赤酵母GS115中得到了表達(dá)，并且產(chǎn)生了明顯的木糖苷酶活性。

圖2 mSxa在試管表達(dá)水平下的酶活性

圖3 平板剛果紅法鑒定重組β-木糖苷酶活性

2.4 重組β-木糖苷酶mSxa的表達(dá)

如圖4所示，在搖瓶條件下，第91號(hào)轉(zhuǎn)化子在誘導(dǎo)表達(dá)84 h之前，隨著時(shí)間的增加，酶活性有緩慢上升；在84?96 h，酶活性迅速上升，并在96 h時(shí)活性達(dá)到最高值，為17.54 IU/mL。之后開(kāi)始緩慢下降。在10 L發(fā)酵罐中，mSxa的活性變化規(guī)律與搖瓶中的變化相似，但整體活性顯著提高，在誘導(dǎo)表達(dá)96 h時(shí)酶活性較高，為287.61 IU/mL。

2.5 發(fā)酵上清的SDS-PAGE

如圖5所示，發(fā)酵上清在66 kDa附近出現(xiàn)一條明顯的蛋白質(zhì)條帶。反芻獸月形單胞菌Sxa酶由538個(gè)氨基酸殘基組成，理論相對(duì)分子質(zhì)量為59.18 kDa。所得到的蛋白分子量略大于理論計(jì)算值，這可能是由于蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化的結(jié)果。

圖4 mSxa在搖瓶和發(fā)酵罐條件下的酶活性

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液上清的SDS-PAGE

2.6 重組β-木糖苷酶mSxa的酶學(xué)性質(zhì)

2.6.1 mSxa最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

如圖6所示，當(dāng)反應(yīng)的溫度低于55 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高酶活性逐步升高并在55 ℃時(shí)酶活性達(dá)到最高；之后隨著反應(yīng)溫度的不斷升高酶活性逐漸下降。因此，該重組β-木糖苷酶的最適溫度為55 ℃。

通過(guò)對(duì)剩余酶活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，重組β-木糖苷酶在溫度為40?60 ℃保持30 min后剩余酶活性均大于80%；但是當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃后，剩余酶活性急劇下降。這表明，該重組β-木糖苷酶在40?60 ℃時(shí)有較好的熱穩(wěn)定性。

2.6.2 重組β-木糖苷酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

如圖7所示，在pH 2.0的條件下，該酶的相對(duì)酶活性為40%；在pH 5.0?7.0之間，該酶相對(duì)酶活性均在80%以上，且該重組β-木糖苷酶的最適反應(yīng)pH為6.0；在pH 11.0時(shí)，該酶的相對(duì)酶活性僅為9.2%。

圖6 mSxa的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

圖7 mSxa的最適pH和pH穩(wěn)定性

通過(guò)測(cè)定剩余酶活性，在pH 2.0時(shí)該酶的剩余酶活性為53%；在pH 5.0?7.0時(shí)剩余酶活性均高于80.0%；當(dāng)pH升高至9.0時(shí)，該酶的剩余酶活性僅有11.5%。由此可知，該重組β-木糖苷酶在pH 5.0?7.0的條件下較為穩(wěn)定。

2.6.3 mSxa的底物特異性

底物特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組β-木糖苷酶對(duì)燕麥木聚糖 (Oat spelt xylan，OSX) 和NPX具有水解作用，但不降解地衣多糖(Lichenin，Li)、大麥β-葡聚糖 (Barley β-glucan, BG) 以及羧甲基纖維素鈉 (Sodium carboxymethyl cellulose，SCMC) (圖8)。此外，該重組β-木糖苷酶對(duì)NPX的降解效率遠(yuǎn)高于OSX。這表明重組β-木糖苷酶具有較高的底物特異性。

2.6.4 金屬離子、螯合劑和表面活性劑對(duì)mSxa酶活性的影響

圖9顯示，Mn2+和Ca2+對(duì)重組β-木糖苷酶的活性有激活作用，其中Ca2+使酶活性提高近50%，而Fe3+、Cu2+、Co2+、Mg2+、EDTA及SDS明顯抑制酶的活性。

圖8 mSxa的底物特異性

圖9 金屬離子、螯合劑及表面活性劑對(duì)mSxa酶活性的影響

3 討論

木聚糖酶和β-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰酯酶是降解木聚糖的主要酶類(lèi)[8–9]。一些細(xì)菌、放線菌和真菌等微生物以及高等植物均可產(chǎn)生β-木糖苷酶。與木聚糖酶相比，有關(guān)β-木糖苷酶的研究及異源表達(dá)還鮮見(jiàn)報(bào)道。

根據(jù)氨基酸組成，β-木糖苷酶分布于糖苷水解酶的第3、30、39、43、51、52和54家族[10]。由于β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性中心高度保守，因此β-木糖苷酶和一些α-阿拉伯呋喃糖苷酶可以水解α-阿拉伯呋喃糖苷鍵和β-吡喃糖苷鍵[11]。由反芻獸月形單胞菌產(chǎn)生的β-木糖苷酶Sxa是糖苷水解酶第43家族成員[12]，是具有β-木糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的雙功能酶[5]。這種雙功能酶不僅具有從木聚糖和低聚木聚糖中釋放木糖，也能夠從阿拉伯聚糖、阿拉伯低聚糖和阿拉伯木聚糖中釋放阿拉伯糖[13]。這表明Sxa在木聚糖的生物轉(zhuǎn)化中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在本研究中，重組β-木糖苷酶mSxa具有降解燕麥木聚糖和NPX的作用，而不降解其他非淀粉多糖，說(shuō)明mSxa具有較強(qiáng)的專(zhuān)一性。受條件限制，本研究未對(duì)mSxa的 α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性進(jìn)行研究。

瘤胃是降解纖維質(zhì)效率最高的生物反應(yīng)器，其中蘊(yùn)含了大量非淀粉多糖酶基因資源。但是由于大部分瘤胃微生物為嚴(yán)格厭氧微生物，因此，直接利用瘤胃微生物生產(chǎn)工業(yè)用酶制劑受到極大限制?；蚬こ碳夹g(shù)能很好地解決這一問(wèn)題。目前，一些來(lái)源于瘤胃微生物的基因獲得了異源表達(dá)[14–16]。

畢赤酵母是高效表達(dá)異源蛋白質(zhì)的優(yōu)良系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)，一些來(lái)源于瘤胃細(xì)菌和真菌的葡聚糖酶和木聚糖酶獲得了表達(dá)[16–18]。對(duì)目的基因進(jìn)行優(yōu)化常用于提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。優(yōu)化時(shí)不僅需考慮替換宿主低利用率的密碼子，同時(shí)還需注意mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能、順式作用元件以及重復(fù)序列和GC含量。Dehnavi等[19]對(duì)基因進(jìn)行優(yōu)化后，在畢赤酵母GS115中的表達(dá)水平達(dá)到0.5 U/mL。在本試驗(yàn)中，重組β-木糖苷酶mSxa在10 L發(fā)酵罐中的表達(dá)水平達(dá)到287.61 IU/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于之前的任何報(bào)道。這可能與以下因素有關(guān)：1) 優(yōu)化核苷酸的位置。Dehnavi等[19]對(duì)編碼Sxa的 365個(gè)核苷酸進(jìn)行了優(yōu)化，涉及341個(gè)氨基酸，GC含量由52%下降至46%；本研究對(duì)385個(gè)核苷酸進(jìn)行了優(yōu)化，涉及340個(gè)密碼子 (339個(gè)氨基酸和終止密碼子)，GC含量由優(yōu)化前的53.68%降低至優(yōu)化后的43.68%。這表明，本研究中的核苷酸與Dehnavi等[19]合成的基因存在明顯不同，的mRNA自由能可能更低，更易于表達(dá)。2) 異源表達(dá)系統(tǒng)。Dehnavi等[19]所采用的表達(dá)系統(tǒng)為pPinkα-HC/GS115，而本研究中采用的表達(dá)系統(tǒng)為pPIC9K/GS115。眾所周知，表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)元件是影響外源蛋白質(zhì)表達(dá)的因素之一。3) 甲醇利用表型。pPinkα-HC/GS115無(wú)需進(jìn)行甲醇利用表型篩選，通過(guò)同源重組產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子均為Mut+。而本研究中，利用Ⅱ線性化pPIC9K-后，獲得的轉(zhuǎn)化子是Muts。不同的甲醇利用表型是影響外源蛋白質(zhì)表達(dá)水平的重要因素[20]。與Muts相比，Mut+的生長(zhǎng)速度和甲醇攝入速度要快得多[21]。因此，目前大部分的研究均利用Mut+型菌株表達(dá)外源蛋白質(zhì)。然而，研究發(fā)現(xiàn)盡管Muts菌株達(dá)到最高表達(dá)量的誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，但其代謝甲醇較少，受氧的限制較小，有時(shí)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量比Mut+菌株還要高[21–22]。

酶的熱穩(wěn)定性是影響工業(yè)應(yīng)用的重要因素。由微生物產(chǎn)生的β-木糖苷酶最適反應(yīng)溫度一般介于40–60 ℃之間[8]，而一些嗜熱微生物產(chǎn)生的β-木糖苷酶有較高的熱穩(wěn)定性。Bachmann等[23]研究發(fā)現(xiàn)，褐色高溫單孢菌的β-木糖苷酶最適反應(yīng)溫度為82 ℃，其活性在70 ℃可以保持1.5 h。在本研究中，重組β-木糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃；在40?60 ℃時(shí)保持30 min，剩余約80%的酶活性；當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，酶活性基本喪失。這說(shuō)明本研究中獲得的mSxa耐熱性能不強(qiáng)。要獲得工業(yè)應(yīng)用，還需通過(guò)蛋白質(zhì)改造以提高其熱穩(wěn)定性。Jordan等[5]在大腸桿菌中表達(dá)了Sxa基因，將第145位的色氨酸替換為苯丙氨酸或亮氨酸可提高重組 β-木糖苷酶的KiD-glucose和KiD-xylose，增加對(duì)pH和溫度的穩(wěn)定性。對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行替換并不總能產(chǎn)生有益的結(jié)果。Jordan等[24]將Sxa第186位的谷氨酸替換為丙氨酸后，酶活性顯著降低。

大部分β-木糖苷酶的最適pH在3.0?6.0之間，耐受弱酸性[8]。如來(lái)源于出芽短梗霉菌的β-木糖苷酶，其最適pH為4.0[25]。然而，由嗜熱脫氮芽孢桿菌產(chǎn)生的β-木糖苷酶具有耐熱、耐堿和耐鹽的特性，其最適pH為7.0[26]。這提示，該β-木糖苷酶可能具有更廣闊的應(yīng)用范圍。本試驗(yàn)以NPX為底物，在反應(yīng)溫度55 ℃時(shí)測(cè)得mSxa的最適pH為6.0，在pH 5.0?7.0都保持良好的穩(wěn)定性，表明mSxa亦呈弱酸性。

不同金屬離子、螯合劑和表面活性劑對(duì)重組β-木糖苷酶的影響有顯著差異。有研究表明，金屬離子Fe3+、Fe2+、Co2+、Ag+、Cu2+和Hg2+，SDS以及螯合劑EDTA抑制酶的活性；而金屬離子Mg2+、Ni2+、Ca2+和K+對(duì)酶的活性起激活作用[17,27]。在本研究中，5 mmol/L的Fe3+、Cu2+、Co2+、Mg2+、EDTA及SDS明顯抑制酶的活性。而Ca2+和Mn2+對(duì)mSxa具有明顯的激活作用，因此推測(cè)Ca2+和Mn2+可能是mSxa的輔因子。

4 結(jié)論

通過(guò)密碼子優(yōu)化，反芻獸月形單胞菌β-木糖苷酶基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。在發(fā)酵罐水平表達(dá)的酶活性達(dá)到了287.61 IU/mL。該酶在溫度為40?60 ℃，pH為5.0?7.0時(shí)較穩(wěn)定，其最適反應(yīng)溫度和pH分別為55 ℃和6.0。該酶對(duì)β-木糖苷鍵具有特異的切割作用，Mn2+和Ca2+激活其活性，而Fe3+、Cu2+、Co2+、Mg2+、EDTA及SDS抑制其活性。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

High-level expression and characterization ofβ-xylosidase in

Tingting Fu*, Wei Hu*, Yong Chen, Huan Wei, and Guang Yang

,,830052,,

β-xylosidase (EC 3.2.1.37) is an important part of the xylanolytic enzymes system. In the present research, β-xylosidase genederived fromwas expressed inGS115. According to the codon bias and rare codons of, mRNA secondary structure and GC contentgene was optimized. The optimized full-length genewas obtained by gene synthesis technique and the recombinant yeast expression vector pPIC9K-was constructed. After being digested by restriction enzymeⅡ, thegene was transformed intoGS115. Then, phenotype and geneticin G418 resistance screening, and PCR were adopted to identify the positive transformants. Finally, the recombinantGS115-pPIC9K-was obtained. Based on enzymatic activity assay, a high-level expression clone was picked up and then the enzymatic characteristics of the recombinant β-xylosidase were studied. The results showed that the molecular weight of the mSxa expressed inG115 was about 66 kDa. The maximum activity was achieved 287.61 IU/mL at fermenter level. Enzymatic characterization showed the β-xylosidase was stable between 40 ℃ and 60 ℃, and pH between 5.0 and 7.0. The optimal reaction temperature and pH were 55 ℃ and 6.0, and preferentially degrading the β-xylose glycosidic bond. The enzymatic activity was activated by Mn2+and Ca2+, and inhibited by Fe3+, Cu2+, Co2+, Mg2+, EDTA and SDS. The study indicates that the modified β-xylosidase genefromcan express successfully with high activity in.. The study lays a foundation for further industrial application of the β-xylosidase.

, β-xylosidase,, heterologous expression, enzymatic characteristics

November 8, 2016; Accepted: February 7, 2017

Yong Chen. Tel: +86-991-8763771; E-mail: xjaucy@163.com

10.13345/j.cjb.160433

Supported by:The Xinjiang Uygur Autonomous Region High Tech Research Project (No. 201211104).

2017-02-16

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170216.1109.005.html

*These authors contributed equally to this study.

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究項(xiàng)目 (No. 201211104) 資助。