潘劍茹，吳倫巧，何火聰，陳莉娟，蘇穎，李玲玲，劉樹滔

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GST-SOD1-R9融合蛋白的表達(dá)、純化、穩(wěn)定性與跨膜效應(yīng)

潘劍茹1，吳倫巧1，何火聰2，陳莉娟1，蘇穎2，李玲玲1，劉樹滔1

1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108 2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院福建省科技廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福建省腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)及腫瘤放射治療學(xué)研究室，福建福州 350014

潘劍茹, 吳倫巧, 何火聰, 等. GST-SOD1-R9融合蛋白的表達(dá)、純化、穩(wěn)定性與跨膜效應(yīng). 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(5): 828–837.Pan JR, Wu LQ, He HC, et al. Expression, purification, stability and transduction efficiency of GST-SOD1-R9 fusion protein. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 828–837.

穿膜肽TAT介導(dǎo)的雙效抗氧化酶GST (谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)-TAT-SOD1 (Cu, Zn 超氧化物歧化酶)，可有效清除胞內(nèi)自由基，其預(yù)防氧化損傷的效果強(qiáng)于SOD1-TAT，但前者的跨膜能力不如后者。為增強(qiáng)雙效抗氧化酶的跨膜效率，本研究融合了SOD1和穿膜肽R9，合成SOD1-R9全基因序列，并將其插入帶有GST的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，成功構(gòu)建了GST-SOD1-R9融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。然后，將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD1-R9轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，通過改變誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，確定了融合蛋白在25 ℃下表達(dá)11 h，可得到高表達(dá)量的可溶性GST-SOD1-R9融合蛋白。利用80%硫酸銨沉淀和GST瓊脂糖樹脂純化得到純蛋白，應(yīng)用SDS-PAGE和酶活性鑒定純化的蛋白為正確表達(dá)的目標(biāo)蛋白。GST-SOD1-R9融合蛋白的溫度和pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該蛋白在生理?xiàng)l件下具有良好的SOD和GST活性。細(xì)胞跨膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明其跨膜能力與GST-TAT-SOD1融合蛋白相比顯著增強(qiáng) (<0.05)。這些工作為深入研究GST-SOD1-R9的抗氧化損傷效應(yīng)建立了基礎(chǔ)。

GST-SOD1-R9，構(gòu)建，融合蛋白，表達(dá)純化，穩(wěn)定性，跨膜效應(yīng)

氧化壓力會(huì)導(dǎo)致ROS (活性氧自由基) 的大量產(chǎn)生，活性氧或活性氮爆發(fā)可能影響直接或間接參與氧化代謝的蛋白/基因[1-2]。慢性炎癥反應(yīng)就與這種對(duì)正常的氧化代謝持續(xù)不斷的干擾有關(guān)[3-4]。超氧陰離子自由基O2·–是ROS中毒性較大的一種，它不僅產(chǎn)生直接的氧化損傷作用，還會(huì)作為信使，將氧化損傷帶給受損細(xì)胞周圍的正常細(xì)胞[5]。

生物體內(nèi)存在維持ROS數(shù)量從而防止氧化損傷的天然屏障。這個(gè)屏障由各種抗氧化酶組成。超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase，SOD) 是這些天然抗氧化酶中一種十分重要的胞內(nèi)酶。它能催化體內(nèi)不同來源的超氧陰離子生成氧氣和過氧化氫，過氧化氫可在過氧化物酶或過氧化氫酶的作用下進(jìn)一步生成水 (H2O) 和氧氣，從而保護(hù)機(jī)體免受超氧陰離子自由基O2·–的毒性作用[6]，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的唯一可以清除O2·–的酶。人體內(nèi)有位于胞漿的Cu, Zn-SOD (SOD1)、位于線粒體的Mn-SOD (SOD2) 和分泌到胞外的EC-SOD (SOD3)，它們從不同的部位分工清除O2·–。但由于分子量太大，天然SOD無法進(jìn)入細(xì)胞，清除細(xì)胞內(nèi)的自由基。

起源于HIV-1 Tat蛋白的細(xì)胞穿膜肽TAT (YGRKKRRQRRR) 可攜帶大分子跨膜進(jìn)入細(xì)胞[7-12]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOD1和TAT融合在一起后就可以進(jìn)入細(xì)胞，預(yù)防細(xì)胞內(nèi)的自由基過量導(dǎo)致的氧化損傷[13-16]。但胞內(nèi)自由基并非只有一種，為了進(jìn)一步增強(qiáng)抗氧化損傷能力，為此，我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建了雙效抗氧化酶GST-TAT-SOD1。GST (谷胱甘肽--轉(zhuǎn)移酶) 是生物體內(nèi)一種重要的解毒酶，它可以催化親核性的谷胱甘肽與自由基的結(jié)合反應(yīng)，起到解毒作用[17-18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAT介導(dǎo)的雙效抗氧化酶具有比SOD1-TAT更好的預(yù)防放射損傷的能力，但前者的跨膜能力不如后者[19-20]。這一方面是由于前者的分子量比后者大，另一方面可能是由于前者的TAT處于融合蛋白的中間部分，影響了其與細(xì)胞膜的接觸。

為了進(jìn)一步增強(qiáng)雙效抗氧化酶的跨膜能力，以提升其應(yīng)用潛力，我們引入了TAT衍生物R9取代TAT，R9是帶有9個(gè)Arg的穿膜肽，其跨膜效率是TAT的20倍[21]，并將其融合在雙效抗氧化酶GST-SOD1的C端。本研究擬合成SOD1- R9全長基因，將SOD1-R9克隆至帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1- SOD1-R9，轉(zhuǎn)化后表達(dá)得到GST-SOD1-R9融合蛋白，優(yōu)化表達(dá)條件，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化、鑒定及穩(wěn)定性研究，最后對(duì)其跨膜效應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究GST-SOD1-R9融合蛋白抗氧化損傷效應(yīng)等提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-4T-1質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21 (DE3) 均為本實(shí)驗(yàn)室保存；酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；各種限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；GST親和柱購自生工生物工程上海(股份)有限公司；IPTG、考馬斯亮藍(lán)R-250購自AMRESCO公司；蛋白marker購于Fermentas公司；DNA marker購自北京天根生化科技有限公司；基因合成與DNA測序由生工生物工程上海(股份) 有限公司進(jìn)行。SOD和GST活力檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白含量檢測試劑盒購自Thermo Scientific (美國)。FITC購自Sigma (美國)。L-02人正常肝細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

全基因合成SOD1-R9的基因序列，在其上、下游分別引入RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，將其與pGEX-4T-1質(zhì)粒均用RⅠ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，然后用T4 DNA連接酶將酶切后經(jīng)膠回收純化的SOD1-R9和pGEX-4T-1于4 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行RⅠ和Ⅰ雙酶切鑒定，并將雙酶切鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行DNA測序鑒定。

1.3 GST-SOD1-R9融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將DNA測序正確的陽性克隆菌于37 ℃培養(yǎng)至600=0.6?0.8時(shí)，分別加入CuSO4、ZnSO4和IPTG至終濃度為0.5 mmol/L、0.1 mmol/L和0.25 mmol/L，誘導(dǎo)GST-SOD1-R9融合蛋白表達(dá)，同時(shí)探索誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度對(duì)表達(dá)量的影響。取誘導(dǎo)后的菌液，10 000 r/min離心2 min，棄上清收集菌體沉淀，一部分菌體直接加入SDS-PAGE電泳樣品處理液，用于檢測全菌蛋白；另一部分加入9倍體積的緩沖液1 (50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，5%甘油， 2 mmol/L DTT)，冰浴超聲破碎30 min，然后 10 000 r/min離心20 min，取上清電泳檢測。

用12.5% SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色比較不同條件下的菌體全蛋白與超聲破碎上清中的蛋白比例，分析融合蛋白在不同條件下的表達(dá)量，篩選較好的可溶表達(dá)條件。

1.4 GST-SOD1-R9融合蛋白的純化

在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)GST-SOD1-R9融合蛋白的表達(dá)。收集誘導(dǎo)后菌體超聲破碎的上清液，按體積在冰浴中緩慢加入硫酸銨 (561 g/L)，待硫酸銨全部溶解后，繼續(xù)攪拌30 min后，置于4 ℃冰箱靜置過夜。沉淀結(jié)束后4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集沉淀，加入2倍體積的緩沖液2 (10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4， 2.7 mmol/L KCl，pH 7.3) 溶解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，利用GST親和柱，按照柱子說明書進(jìn)行純化。分別收集親和柱穿透峰和洗脫峰，進(jìn)行12.5%的SDS-PAGE。

1.5 GST-SOD1-R9融合蛋白的鑒定

使用SOD和GST活力檢測試劑盒，按試劑盒說明書分別測定純化后的GST-SOD1-R9融合蛋白的SOD和GST活力，結(jié)合SDS-PAGE測定的蛋白分子量，鑒定是否為目標(biāo)蛋白。

1.6 GST-SOD1-R9融合蛋白的穩(wěn)定性

取等份GST-SOD1-R9融合蛋白，分別置于25 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、80 ℃的水浴中保溫30 min，取出，待回至室溫，取樣分別測定殘留SOD活力和GST活力，分析融合蛋白的熱穩(wěn)定性。

取等份GST-SOD1-R9融合蛋白，用廣泛緩沖液分別調(diào)至pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，4 ℃放置30 min，取出，待回至室溫，取樣分別測定殘留SOD活力和GST活力，分析融合蛋白的pH穩(wěn)定性。

1.7 GST-SOD1-R9融合蛋白的跨膜效應(yīng)

參照文獻(xiàn)[19]，分別用FITC標(biāo)記GST-TAT- SOD1和GST-SOD1-R9融合蛋白。

取對(duì)數(shù)生長期的L-02細(xì)胞用含15%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，將其接種到24孔板，每孔40 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)液，加磷酸緩沖液 (PBS) 清洗2次，往每孔中分別加入400 μL不同濃度的FITC-蛋白，37 ℃作用3 h。吸去蛋白液，用PBS清洗2次，加入250 μL細(xì)胞裂解液 (0.5% Triton-X-100+0.1% SDS)，漩渦振蕩2 min，放置4 ℃、15 min后、1 200 r/min離心5 min，取200 μL上清液用熒光酶標(biāo)儀檢測，并以BCA試劑盒測定上清液的蛋白含量。以每μg細(xì)胞蛋白所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度來比較2種融合蛋白的跨膜效率。

每組數(shù)據(jù)3個(gè)平行孔，采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，作標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算、檢驗(yàn)等。以>0.05為相差無顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-4T-1-SOD1-R9原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將合成的SOD1-R9基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒均用RⅠ和Ⅰ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，膠回收純化酶切后的SOD1-R9基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒片段，通過T4 DNA連接酶將SOD1-R9基因定向插入到pGEX-4T-1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中。挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行RⅠ和Ⅰ酶切鑒定，結(jié)果見圖1。重組子經(jīng)酶切鑒定后得到2條目的帶，大約為4 946 bp和492 bp，分別與pGEX-4T-1質(zhì)粒和SOD1-R9預(yù)期分子量一致。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序鑒定，測序結(jié)果與預(yù)期的序列一致，證明SOD1-R9基因已經(jīng)成功插入pGEX-4T-1載體，pGEX-4T-1-SOD1-R9重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 GST-SOD1-R9融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD1-R9轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，收集細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2和圖3所示。

由圖2可知，與未誘導(dǎo)的菌體相比，誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，融合蛋白的表達(dá)量也逐漸增加。對(duì)比圖2A與圖2B可知，融合蛋白基本處于菌體超聲破碎液的上清中，表明誘導(dǎo)而得的GST-SOD1-R9融合蛋白主要以可溶性的形式存在，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為11 h。

由圖3可知，同樣誘導(dǎo)6 h，不同的誘導(dǎo)溫度對(duì)GST-SOD1-R9融合蛋白的表達(dá)量與可溶表達(dá)有很大影響。誘導(dǎo)溫度為16 ℃，融合蛋白的表達(dá)量較低，隨著誘導(dǎo)溫度的增加，融合蛋白的表達(dá)量隨之增加。但當(dāng)誘導(dǎo)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，菌體超聲破碎液的上清中的融合蛋白量開始降低，這表明可能有部分融合蛋白形成了包涵體。對(duì)比圖3A與圖3B可知，最佳誘導(dǎo)溫度為25 ℃。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD1-R9的構(gòu)建

圖2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)GST-SOD1-R9融合蛋白表達(dá)量的影響

圖3 誘導(dǎo)溫度對(duì)GST-SOD1-R9融合蛋白表達(dá)量的影響

2.3 GST-SOD1-R9融合蛋白的純化與鑒定

GST-SOD1-R9表達(dá)菌超聲破碎后，收集上清，進(jìn)行80%硫酸銨沉淀。沉淀溶解液使用GST親和柱純化后，最終得到高純度的GST-SOD1-R9融合蛋白，結(jié)果如圖4所示。

通過計(jì)算，可知圖4中GST-SOD1-R9融合蛋白實(shí)際分子量約為46 kDa，GST-SOD1-R9蛋白理論分子量為45 kDa左右，二者基本相符。由于GST-SOD1-R9融合蛋白是由SOD和GST兩種抗氧化酶融合而得的獨(dú)特蛋白，同時(shí)具有SOD和GST活力，因此我們進(jìn)一步使用SOD和GST檢測試劑盒分別測定了該蛋白的酶活力。結(jié)果表明，純蛋白的SOD活力為7 800 U/mL，GST活力為740 U/mL。綜合分子量與活性分析的結(jié)果，可確認(rèn)GST-SOD1-R9融合蛋白得到正確的表達(dá)。

圖4 GST-SOD1-R9融合蛋白的純化

2.4 GST-SOD1-R9融合蛋白的穩(wěn)定性

由圖5可以看出，溫度對(duì)GST-SOD1-R9融合蛋白酶活的影響很大。融合蛋白的SOD活力在50 ℃以內(nèi)隨溫度的升高緩慢降低，當(dāng)處理溫度超過50 ℃后，活性隨溫度的升高迅速降低，在60 ℃水浴30 min后，SOD活力幾乎完全喪失。融合蛋白的GST活力在50 ℃以內(nèi)隨溫度的升高緩慢升高，當(dāng)處理溫度超過50 ℃后，活性開始隨溫度的升高而降低，在60 ℃水浴30 min后，GST活力還有約33%，在80 ℃水浴30 min后，GST活力接近于0。

由圖6可以看出，pH對(duì)GST-SOD1-R9融合蛋白酶活也有很大影響。融合蛋白的SOD活力在pH≤6的范圍內(nèi)隨pH的降低而降低，在pH 6?7的范圍內(nèi)活力基本不變，當(dāng)pH超過7后，活性隨pH的升高而降低。融合蛋白的GST活力在pH≤5.3的范圍內(nèi)隨pH的降低而迅速降低，在pH 5?6的范圍內(nèi)活力基本不變，當(dāng)pH超過6后，活性隨pH的升高而降低。

2.5 GST-SOD1-R9融合蛋白的跨膜效應(yīng)

為比較兩種融合蛋白的跨膜能力，將它們進(jìn)行FITC標(biāo)記后通過細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化檢測其對(duì)正常人肝細(xì)胞株L-02的跨膜效果，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，兩種融合蛋白都有顯著的跨膜能力 (<0.05)。但無論在0.125 mg/mL還是0.25 mg/mL的劑量下，GST-SOD1-R9融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞的量都顯著高于GST-TAT-SOD1融合蛋白 (<0.05)，尤其是0.25 mg/mL的劑量下，前者的跨膜量是后者的2.5倍以上 (<0.05)。這表明GST-SOD1-R9融合蛋白比GST-TAT-SOD1融合蛋白具有更強(qiáng)的跨膜能力。

圖5 GST-SOD1-R9融合蛋白的溫度穩(wěn)定性

圖6 GST-SOD1-R9融合蛋白的溫度穩(wěn)定性

圖7 GST-SOD1-R9融合蛋白的跨膜效應(yīng)

3 討論

超氧陰離子是引起機(jī)體氧化損傷的主要原因之一，SOD是唯一一種可以清除超氧陰離子的天然酶，在抗氧化損傷方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。然而受分子量限制，SOD對(duì)胞內(nèi)的自由基束手無策。為此，我們先是將其與穿膜肽TAT融合，突破了SOD的應(yīng)用屏障[13-16]，并在此基礎(chǔ)上，融合載體自帶的GST，設(shè)計(jì)構(gòu)建了TAT介導(dǎo)的雙效抗氧化酶GST-TAT-SOD1，取得了更好的清除胞內(nèi)自由基的效果，但它的跨膜能力卻不如單純的SOD1-TAT，約為其80%左右[19-20]。

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，TAT可以穿膜的首要原因在于其含有多個(gè)堿性氨基酸，這使其帶有大量正電荷，易于吸附在細(xì)胞膜上，然后誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)現(xiàn)跨膜[22]。TAT的跨膜能力主要與其精氨酸殘基有關(guān)，它們不僅提供了正電荷，其特有的胍基使其跨膜能力強(qiáng)于其他幾種陽離子氨基酸 (組氨酸、賴氨酸和鳥氨酸)。在所有的TAT類似肽衍生物中，L-精氨酸的9聚體 (R9)被證實(shí)比TAT的效率高20倍[21,23-25]。融合了R9穿膜肽的過氧化氫酶 (CAT) 的跨膜效率是融合了TAT穿膜肽的過氧化氫酶的1.5倍左右[26]。此外，穿膜肽在蛋白中所處的位置也會(huì)影響其介導(dǎo)的蛋白的跨膜能力。我所早期研究結(jié)果表明，在自由C端融合穿膜肽的GST-GFP (綠色熒光蛋白)-TAT的跨膜效率是將穿膜肽融合在兩個(gè)蛋白中間的GST-TAT-GFP的2倍以上[27]。

為此，本研究重新設(shè)計(jì)了可穿膜的雙效抗氧化酶。在新的設(shè)計(jì)中，我們以R9作為穿膜肽，將其融合在SOD1的C端，再在SOD1的N端，融合載體自帶的GST，得到可穿膜的新型雙效抗氧化酶GST-SOD1-R9融合蛋白。GST-SOD1- R9融合蛋白在其N端融合的GST的幫助下，可實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)，其可溶表達(dá)量受誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度影響。經(jīng)過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，本研究利用IPTG，在25 ℃時(shí)誘導(dǎo)11 h，得到高表達(dá)量的可溶性GST-SOD1-R9融合蛋白。然后通過超聲破碎，80%硫酸銨沉淀和GST親和柱純化得到了電泳純蛋白，該蛋白分子量與理論分子量相符，同時(shí)具有SOD和GST活力，證實(shí)我們構(gòu)建與表達(dá)了正確的蛋白。

此外，本研究還對(duì)GST-SOD1-R9融合蛋白的溫度和pH穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在37?50 ℃的范圍內(nèi)，該蛋白的SOD活力殘留91%?89%，GST活力殘留86%?100%；在pH 6?7的范圍內(nèi)，該蛋白的SOD活力殘留99%?100%，GST活力殘留100%?88%，表明GST-SOD1-R9 融合蛋白在生理?xiàng)l件下具有良好的活性。與GST-TAT-SOD1的穩(wěn)定性[28]相比，二者pH穩(wěn)定性相當(dāng)，但當(dāng)?shù)鞍椎奶幚頊囟却笥?0 ℃時(shí)，GST-SOD1-R9更容易喪失活性。最終的細(xì)胞跨膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的GST-SOD1-R9融合蛋白低劑量 (0.125 mg/mL) 下，跨膜能力是GST-TAT-SOD1融合蛋白的1.6倍以上 (< 0.05)，高劑量 (0.25 mg/mL) 下，跨膜能力超過GST-TAT-SOD1融合蛋白2.5倍以上 (< 0.05)。由此可知，GST-SOD1-R9融合蛋白的跨膜能力已超過SOD1-TAT。

綜上所述，重新構(gòu)建的GST-SOD1-R9融合蛋白可取代GST-TAT-SOD1融合蛋白，更有效地發(fā)揮雙效抗氧化能力，防治機(jī)體各種氧化損傷。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Expression, purification, stability and transduction efficiency of GST-SOD1-R9 fusion protein

Jianru Pan1, Lunqiao Wu1, Huocong He2, Lijuan Chen1, Ying Su2, Lingling Li1, and Shutao Liu1

1 College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, Fujian, China 2 Fujian Cancer Hospital & Fujian Medical University Cancer Hospital, Laboratory of Radiation Oncology and Radiobiology, Fujian Key Laboratory of Tumor Translational Cancer Medicine, Fuzhou 350014, Fujian, China

The fusion of cell permeable peptide TAT and bifunctional antioxidant enzymes, GST (Glutathione sulfur transferase)-TAT-SOD1 (Cu, Zn superoxide dismutase), is an intracellular superoxide scavenger. Compared with SOD1-TAT, GST-TAT-SOD1 has better protective effect on oxidative damage but less transduction efficiency. A novel cell permeable bifunctional antioxidant enzymes with the fusion of GST, SOD1 and polyarginine R9 was constructed for higher transduction efficiency. The full nucleotide sequence of SOD1-R9 was synthesized and inserted into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 with the GST tag. After the successful construction of the prokaryotic expression vectors of GST-SOD1-R9, the recombinant vector was then transformed intoBL21 (DE3) and the GST-SOD1-R9 fusion protein was produced with the induction of IPTG. The soluble expression of GST-SOD1-R9 fusion protein was combining with the induction temperature and time. The best soluble expression was obtained with the induction temperature of 25 ℃ and the induction time of 11 h. The fusion protein was purified through the combination of 80% ammonium sulfate precipitation and affinity chromatography using glutathione agarose, and verified by SDS-PAGE and special enzymatic activity. The thermal and pH stability of GST-SOD1-R9 fusion protein were analyzed and the SOD and GST activity of fusion protein were proved to be well maintained under physiological conditions. Finally, the transduction efficiency of GST-SOD1-R9 fusion protein was proved to be better than GST-TAT-SOD1 fusion protein (<0.05). These works establish a foundation for further study of the protective effect of GST-SOD1-R9 fusion protein against oxidative damage.

GST-SOD1-R9, construction, fusion protein, expression and purification, stability, transduction efficiency

October 26, 2016; Accepted: December 22, 2016

Jianru Pan. Tel: +86-591-83732462; E-mail: panjr@fzu.edu.cn

10.13345/j.cjb.160401

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 81472907).

國家自然科學(xué)基金(No. 81472907) 資助。

2017-01-09

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170109.1243.003.html