白少云， 卿吉琳， 劉 振， 譚源?！?， 陳治中

1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 2婦產(chǎn)科 3檢驗科，南寧 530021

重組人可溶性Tim-3原核表達載體的構(gòu)建及其重組蛋白的優(yōu)化表達*

白少云1， 卿吉琳2， 劉 振1， 譚源福1△， 陳治中3△

1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院2婦產(chǎn)科3檢驗科，南寧 530021

目的 構(gòu)建人可溶性Tim-3(sTim-3)的重組質(zhì)粒表達載體pET28a-sTim-3-EGFP，在大腸埃希菌中進行誘導表達并對其表達條件進行優(yōu)化。方法 取健康人外周血提取總RNA，RT-PCR擴增Tim-3基因胞外段序列，克隆入已構(gòu)建的表達載體pET28a-EGFP中，鑒定陽性克隆。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，通過調(diào)整IPTG濃度、誘導時機、誘導溫度與誘導時間優(yōu)化蛋白表達條件。結(jié)果 成功構(gòu)建原核表達載體pET28a-sTim-3-EGFP，并轉(zhuǎn)化BL21(DE3)進行誘導表達。溫度和IPTG濃度對蛋白表達量影響不大；在培養(yǎng)至A600 nm值約為0.6～0.8時于25℃誘導5 h可獲得較高的蛋白表達。結(jié)論 成功表達可溶性重組蛋白sTim-3-EGFP，為該蛋白的進一步純化生產(chǎn)及應用奠定了良好基礎。

Tim-3； 原核表達； 增強綠色熒光蛋白; 融合蛋白

T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域家族(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecules family，TIM)是2001年McIntire等[1]在研究過敏和哮喘基因過程中發(fā)現(xiàn)并定位克隆的一個新的基因家族。該家族共包括8個成員(Tim-1～Tim-8)，其中僅Tim-1、Tim-3、Tim-4存在于人類，定位于與過敏、哮喘和自身免疫性疾病相關的人類5號染色體5q33.2上。全長人Tim-3蛋白共由301個氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)從N端到C端分別由信號肽、IgV亞單位、黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域、單跨膜結(jié)構(gòu)域和富含Tyr的胞質(zhì)尾區(qū)組成[2]。Tim-3蛋白是Ⅰ型膜蛋白，其基因序列的信號肽區(qū)多肽在其成為有功能的蛋白分子前已被剪切去除，IgV亞單位和黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的胞外部分為其發(fā)揮功能的重要區(qū)域，參與配體的識別和結(jié)合。先前的研究在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了缺乏黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)的Tim-3的可溶性形式[3]；近些年在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了Tim-3的可溶形式，是由金屬蛋白酶ADAM10和ADAM17將全長膜型Tim-3在細胞膜表面裂解產(chǎn)生，其僅由IgV亞單位和黏蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成[4]。

2002年Monney等[5]首先報道了Tim-3主要表達于產(chǎn)γ干擾素(IFN-γ)的CD4+T輔助細胞1(Th1)和CD8+細胞毒性T細胞(Tcl)表面。隨后在Th17細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等其他免疫細胞表面也相繼發(fā)現(xiàn)了Tim-3的表達[6-7]。半乳糖凝集素-9(galectin-9，Gal-9)是Tim-3的天然配體，可與Th1和Th17細胞表面的Tim-3分子特異性結(jié)合負性調(diào)節(jié)Th1和Th17細胞的免疫功能[8]。隨后又確認磷脂酰絲氨酸(phosphatidyl serine，PtdSer)、高遷移率組蛋白B1(HMGB1)、Ceacam-1等為Tim-3的其他幾種配體，其中一些主要在固有免疫細胞中發(fā)揮作用。功能研究顯示Tim-3是一種具有多種生物學功能的免疫調(diào)節(jié)分子，在哮喘、自身免疫性疾病、過敏性疾病、器官移植、病毒感染、不明原因習慣性流產(chǎn)及腫瘤等多種疾病的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，且在免疫調(diào)節(jié)的不同階段發(fā)揮的作用有所不同[6]。在腫瘤組織中，高表達Tim-3往往提示預后不良，因而Tim-3有望作為腫瘤免疫治療的新靶點。

本研究應用基因工程技術(shù)，將Tim-3胞外段基因與增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)重組到原核表達載體，并誘導其初步表達產(chǎn)生sTim-3-EGFP融合蛋白，為sTim-3的后續(xù)研究及臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NocⅠ和SacⅠ、250 bp DNA Ladder marker、1 kb DNA ladder marker及pMD18-T載體購自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、T4DNA連接酶、HRP標記羊抗小鼠二抗、感受態(tài)大腸埃希菌DH5α和BL21(DE3)均購自天根生化科技(北京)有限公司?？敲顾?、氨芐西林購自上海生工生物技術(shù)公司。人外周血淋巴細胞分離液、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopro-pyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)購自索萊寶公司。蛋白預染Marker購自Thermo公司。小鼠抗His標簽單抗、小鼠抗EGFP標簽單抗購自Origene公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司。pET28a原核表達載體及已構(gòu)建好的pET28a-EGFP重組質(zhì)粒[9]由本實驗室保存。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 Tim-3胞外段RT-PCR引物的設計

在GenBank中查找到Tim-3基因編碼序列，結(jié)合跨膜預測軟件如TMHMM Server v.2.0、TMpred、TMAP等預測胞外段序列，自行設計引物。上游引物：5′-CATGCCATGGATATGTTTTCACATCTTCCCTTTGAC-3′，下游引物：5′-GCG-AGCTCTCTGATGGTTGCTCCAGAGTCC-3′，劃線部分分別為NcoⅠ和SacⅠ酶切位點，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 RNA提取、RT-PCR擴增Tim-3胞外段及產(chǎn)物的克隆測序

分離人外周血單個核細胞，根據(jù)Trizol試劑說明書從單個核細胞中提取總RNA。將獲得的RNA進行RT-PCR，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物與pMD18-T載體(TaKaRa公司)連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，氨芐西林(Amp)篩選陽性克隆，進行菌液PCR、提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，后選取陽性克隆菌液送上海生工生物技術(shù)公司測序。其中PCR擴增反應條件為：先95 ℃預變性5 min；后94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72℃延伸45 s進行30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.4 pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建

提取測序正確的質(zhì)粒，行NcoⅠ和SacⅠ雙酶切，同時對本實驗室已構(gòu)建保存的pET28a-EGFP重組質(zhì)粒經(jīng)相同的內(nèi)切酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳和DNA純化回收后進行連接反應，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，卡那霉素篩選陽性克隆，進行菌液PCR、提取質(zhì)粒行PCR和雙酶切鑒定后選取陽性克隆菌液送公司測序。提取測序正確的陽性菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌BL21(DE3)，并再次行PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性菌株。同時取pET28a-EGFP重組質(zhì)粒和pET28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌BL21(DE3)作為對照。

1.5 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導表達、鑒定及條件優(yōu)化

1.5.1 誘導sTim-3-EGFP重組蛋白表達的IPTG濃度最佳化 熒光顯微鏡下觀察單菌落培養(yǎng)菌液，選取熒光較強的一管進行后續(xù)IPTG誘導表達。根據(jù)預實驗結(jié)果，我們先于37 ℃、225 r/min培養(yǎng)約2 h 45 min至A600 nm值達0.6左右吸取1 mL誘導前菌液，隨后在0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L等不同IPTG濃度下于25 ℃誘導表達6 h；每管吸取2.5 μL菌液于玻片上，在熒光顯微鏡下觀察熒光強度；另每組各吸取1 mL菌液，離心棄去上清，加入160 μL PBS和40 μL 5×蛋白上樣緩沖液，吹打混勻后沸水浴5 min，行SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍染色及Western blot檢測。

1.5.2 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導時機最佳化 在25 ℃、0.1 mmol/L IPTG濃度下不同時機的誘導表達，分別取誘導前、A600 nm值分別為0.23、0.36、0.50、0.64、0.81、1.02、1.18時誘導表達6 h的菌液1 mL，離心棄去上清行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色分析。

1.5.3 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導時間及溫度最佳化 0.1 mmol/L IPTG濃度下不同時間和溫度的誘導表達，在25℃的誘導前及誘導后1、2、3、4、5、6 h，31 ℃的誘導前、誘導后6 h，37 ℃的誘導前、誘導后6 h，各吸取1 mL菌液離心棄去上清，后進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色。同時取pET28a質(zhì)粒及pET28a-EGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)作為對照。

2 結(jié)果

2.1 Tim-3胞外段基因的RT-PCR結(jié)果

根據(jù)設計的引物擴增目的基因，Tim-3胞外段片段大小約620 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示，在相對于DNA Marker 500 bp與750 bp之間有一特異性擴增條帶，分子量大小與預期相符(圖1)。

①：Tim-3胞外段基因RT-PCR擴增產(chǎn)物；②：250 bp DNA Ladder Marker圖1 Tim3胞外段基因RT-PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of the extracellular domain of Tim-3 gene

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-sTim-3-EGFP的鑒定

將擴增產(chǎn)物sTim-3經(jīng)NcoⅠ和SacⅠ雙酶切，并用DNA純化試劑盒按廠家說明書純化回收備用。雙酶切純化的sTim-3片段亞克隆于經(jīng)過相同內(nèi)切酶雙酶切后的pET28a-EGFP載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，后對單菌落培養(yǎng)菌液行sTim-3片段和EGFP片段的PCR鑒定(圖2)，可見2、3號管菌液鑒定陽性；后對鑒定陽性的2號管菌液擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行sTim-3片段PCR鑒定及雙酶切鑒定(圖3)，結(jié)果與預期相符。將2號管菌液送上海生物工程技術(shù)公司測序，序列與GenBank中序列比對一致，無突變與移位。

M：DNA Marker；①～⑤：分別對應第1～5號管菌液的EGFP片段擴增產(chǎn)物；⑥～⑨：分別對應1～5號管菌液的sTim-3片段PCR擴增產(chǎn)物；其中第2、3號管菌液的sTim-3片段和EGFP片段擴增產(chǎn)物均有目的條帶出現(xiàn)圖2 重組質(zhì)粒pET28a-sTim-3-EGFP的菌液PCR鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pET28a-sTim-3-EGFP by bacteria liquid PCR

①：pET28a-EGFP質(zhì)粒的SacⅠ和NcoⅠ雙酶切產(chǎn)物；②：pET28a-EGFP質(zhì)粒；③：新構(gòu)建質(zhì)粒的SacⅠ和NcoⅠ雙酶切產(chǎn)物；④：提取的新構(gòu)建質(zhì)粒；⑤：新構(gòu)建質(zhì)粒的sTim-3片段圖3 重組質(zhì)粒pET28a-sTim-3-EGFP的PCR鑒定及雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET28a-sTim-3-EGFP by double restriction enzyme digestion and PCR

2.3 重組質(zhì)粒pET28a-sTim-3-EGFP在BL21(DE3)中的誘導表達、鑒定與條件優(yōu)化

2.3.1 誘導sTim-3-EGFP重組蛋白表達的IPTG濃度最佳化 將鑒定陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后，在不同IPTG濃度誘導下sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導表達，熒光顯微鏡下觀察可見在藍色激發(fā)光下菌體發(fā)出較強的綠色熒光(圖4)，SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色結(jié)果示重組蛋白大小與預期相符(sTim-3-EGFP融合蛋白大小理論值約為50.0 kD)；在一定范圍內(nèi)的IPTG濃度對蛋白表達量沒有影響；同時取誘導前及誘導后菌液行Western blot檢測進行驗證，結(jié)果采用His標簽單抗及EGFP單抗的驗證均在目標位置出現(xiàn)單一條帶(圖5)。為了減少IPTG對細菌毒性作用，確定IPTG最佳濃度為0.1 mmol/L。

2.3.2 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導時機最佳化 為了找出IPTG誘導表達的最佳時機，我們在不同A600 nm值進行IPTG誘導表達sTim-3-EGFP。研究發(fā)現(xiàn)在A600 nm值為0.64和0.81時重組蛋白獲得較高表達，隨著A600 nm值增加，誘導培養(yǎng)6 h后的重組蛋白略有增加，但遠不如菌體自身蛋白的增加明顯(圖6)。大約在2 h 45 min即A600 nm值在0.64與0.81之間時進行IPTG誘導為最佳。

2.3.3 sTim-3-EGFP重組蛋白的誘導時間及溫度最佳化 經(jīng)預實驗，我們發(fā)現(xiàn)IPTG誘導6 h以上，蛋白表達無變化。為了找出IPTG誘導表達的最佳溫度與誘導時間，我們分別進行不同時間及溫度的誘導表達(圖7)，可見25 ℃誘導5 h蛋白達到最大表達量，隨時間增加表達量不再增加，不同溫度誘導表達時表達量區(qū)別不大。為了減少sTim-3-EGFP重組蛋白的降解，確定IPTG誘導表達的最佳溫度與誘導時間為25 ℃誘導5 h。

圖4 熒光顯微鏡觀察sTim-3-EGFP融合蛋白的表達(×400)Fig.4 Microscopic evaluation of sTim-3-EGFP fusion protein expression(×400)

A：SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色；①：蛋白Marker；②～⑨：pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒組誘導前及0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L的IPTG濃度下28 ℃誘導表達6 h；⑩：pET28a空質(zhì)粒對照組。B：采用His標簽單抗及EGFP單抗對重組蛋白進行的驗證圖5 不同IPTG濃度誘導下蛋白的表達及Western blot驗證Fig.5 Expression of sTim-3-EGFP protein induced by different concentrations of IPTG and identification by Western blotting

①：蛋白Marker；②：pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒組誘導前(A600 nm值為0.64)；③～⑨：A600 nm值分別為0.23、0.36、0.50、0.64、0.81、1.02、1.18時25 ℃進行誘導表達6 h；⑩：pET28a空質(zhì)粒對照組圖6 SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色檢測不同時機誘導的重組蛋白表達Fig.6 Determination of expression of sTim-3-EGFP fusion protein with respect to different A600 nmvalues by SDS-PAGE electrophoresis and coomassie brilliant blue staining

①：蛋白Marker；②：pET28a-sTim-3-EGFP重組質(zhì)粒組誘導前；③～⑧：25℃誘導后1、2、3、4、5、6 h；⑨：31℃誘導后6 h；⑩：37℃誘導后6 h圖7 SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色檢測不同誘導時間和溫度下的誘導表達Fig.7 Determination of expression of sTim-3-EGFP fusion protein with respect to different induction time and temperature by SDS-PAGE electrophoresis and coomassie brilliant blue staining

3 討論

Tim-3是在多種免疫細胞上表達的一種跨膜蛋白，在機體的固有免疫和特異性免疫應答方面都起著重要的調(diào)節(jié)作用。由于Tim-3在多種類型疾病的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，尤其是在腫瘤免疫治療領域作為治療靶點的潛在意義巨大，因此Tim-3的研究成為近幾年的研究熱點。作為一種負性免疫調(diào)節(jié)分子，Tim-3與配體Gal-9的結(jié)合產(chǎn)生的信號可以阻止Th1細胞的激活而負向調(diào)節(jié)細胞免疫功能，阻斷或增加這一結(jié)合有望改變與Th1/Th2比例失衡相關疾病的發(fā)展方向。Tim-3與Ceacam-1的相互作用被證明可以導致T細胞對各類疾病產(chǎn)生免疫耐受[10]，這在自身免疫性疾病中具有積極的作用，而在癌癥的發(fā)展過程中卻存在消極影響。而Tim-3與這些配體結(jié)合發(fā)生作用的具體下游信號傳導通路尚需深入研究。

作為與PD-1、CTLA-4相似的分子，Tim-3已成為免疫治療與藥物研發(fā)領域熱門的靶點分子。在腫瘤免疫治療領域，以PD-1/PD-L1為靶點的單抗已經(jīng)應用于臨床，對黑色素瘤及非小細胞肺癌等實體瘤顯示出良好的療效，但仍有很多患者對于這一治療無響應。而實驗研究中發(fā)現(xiàn)，抗Tim-3單抗和抗PD-1藥物聯(lián)合使用比單獨使用抗Tim-3或抗PD-1可以起到更好的抗腫瘤效果。其他的研究也顯示抗Tim-3與抗CTLA-4的組合使用可以提高抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤消退[11-12]；其中的一項研究還發(fā)現(xiàn)抗Tim-3治療與立體定向放射外科(stereotactic radiosurgery，SRS)聯(lián)合應用或抗Tim-3與抗PD-1的聯(lián)合應用相比單獨的抗Tim-3治療能夠改善患膠質(zhì)瘤小鼠的存活，而3種治療方法的結(jié)合可以達到100%的總生存率[12]。另外，最近的研究顯示Tim-3阻斷和絲裂原活化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)抑制劑的聯(lián)合應用能夠增強對黑色素瘤的療效[13]。這些研究提示針對Tim-3與其他免疫檢查點進行腫瘤治療可能具有重要作用，并有巨大的應用潛力。

目前已知序列基因組中膜蛋白占所有開放閱讀框中的20%～25%，在疾病中起重要作用[14]。而且，所有藥物靶標約有70%是膜蛋白[15]。然而，由于其本身含量低，膜蛋白常常很難分離足夠量的天然蛋白質(zhì)。Tim-3作為一種膜蛋白，在真核細胞中的表達量很低，使其功能研究受到了很大的限制。Tim-3可溶性形式(sTim-3)的發(fā)現(xiàn)，也尚有待更深入的研究。本實驗中，我們采用pET28a作為表達載體對sTim-3進行高效表達，同時引入EGFP標簽以監(jiān)測可溶性蛋白的表達，以獲得高豐度且具有較多可溶性的sTim-3-EGFP重組蛋白。因為保留了C端的His標簽，可以很方便地采用Ni-NTA(或Ni-IDA)親和層析介質(zhì)進行蛋白純化和后續(xù)功能研究?？紤]到外源基因的異源表達受多種因素的影響，我們對IPTG濃度、誘導時機、誘導時間和誘導溫度進行了探索，發(fā)現(xiàn)IPTG濃度和誘導溫度對重組蛋白的表達量影響不大，誘導時機和誘導時間可能是影響重組蛋白在大腸埃希菌中表達的最重要因素。但過高濃度的IPTG對細菌有潛在的毒性，后續(xù)的實驗我們采用了較低濃度的IPTG進行誘導。溫度雖然對蛋白的最大表達量影響不大，但溫度高時大腸埃希菌表達的異源蛋白容易被降解，同時較高溫度下重組蛋白的高速表達不利于蛋白的正確折疊，易產(chǎn)生不具有生物活性的不可溶性形式(包涵體表達)，而包涵體純化后的復性較為復雜且不能確保復性成功，故我們建議盡可能采用低溫誘導。誘導時機的探索中，我們發(fā)現(xiàn)在A600 nm值約為0.6～0.8時重組蛋白可獲得較高表達，隨著A600 nm值繼續(xù)增加，誘導培養(yǎng)6 h后重組蛋白的增加遠不如因A600 nm值增加導致的菌體自身蛋白的增加明顯，不利于后續(xù)的蛋白純化，建議培養(yǎng)至此范圍時進行誘導。綜上，sTim-3-EGFP重組蛋白最佳誘導條件為：A600 nm值約為0.6～0.8時，用0.1 mmol/L IPTG在25 ℃誘導約5 h。

總之，我們成功構(gòu)建pET28a-sTim-3-EGFP表達載體，在C末端引入EGFP標簽以監(jiān)測sTim-3的可溶性表達，EGFP下游的His6標簽便于Ni-NTA純化。并且對sTim-3-EGFP原核表達的最佳條件進行摸索，為sTim-3-EGFP純化和功能研究及臨床應用奠定了堅實基礎。

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(2017-03-08 收稿)

Construction and Optimized Expression of Recombinant Human sTim-3-EGFP Fusion Protein

Bai Shaoyun1，Qing Jilin2，Liu Zhen1etal

1DepartmentofNeurosurgery，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China2DepartmentofGynecology，ThePeople’sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530021，China

Objective To construct and optimize the condition for inducing expression of recombinant human sTim-3-EGFP inE.coli.Methods Total RNA was extracted from peripheral blood of healthy people.The extracellular fragment of human Tim-3 gene was amplified by RT-PCR and cloned into the constructed prokaryotic expression vector pET28a-EGFP，and identified by PCR，double digestion and sequencing.The recombinant plasmid was transformed into BL21(DE3)to optimize protein expression by adjusting IPTG concentration，induction starting time，induction temperature and induction expression time.Results The prokaryotic expression vector pET28a-sTim-3-EGFP was successfully constructed and transformed into BL21(DE3)for expression.The temperature and IPTG concentration had little effect on the protein expression.When theA600 nmvalue was about 0.6-0.8，temperature 25°C and induction time 5 h，higher protein expression could be obtained.Conclusion The human sTim-3-EGFP is successfully constructed and expressedinvitro.This study provides a good experimental basis for further purification，production and application of Tim-3.

T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3； prokaryotic expression； enhanced green fluorescent protein； fusion protein

*國家自然科學基金資助項目(No.81260007)；廣西衛(wèi)生廳課題資助項目(No.Z2012316)

R

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.007

白少云，男，1988年生，碩士研究生，E-mail：baishaoyun1988@126.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：neurosurgui@vip.163.com(譚源福)；E-mail：tjchenzz@126.com(陳治中)