簡 雷， 肖才文， 何慶文， 李漢琳， 周 衛(wèi)， 徐 翔， 王 勇， 朱宏飛

1江漢大學附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)耳鼻喉科，武漢 4300152武漢大學動物實驗中心，武漢 4300713武漢大學口腔醫(yī)院麻醉與危重癥醫(yī)學科，武漢 430079

金銀花提取物對變應性鼻炎小鼠細胞因子表達的影響*

簡 雷1， 肖才文1， 何慶文1， 李漢琳1， 周 衛(wèi)1， 徐 翔1， 王 勇2， 朱宏飛3△

1江漢大學附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)耳鼻喉科，武漢 4300152武漢大學動物實驗中心，武漢 4300713武漢大學口腔醫(yī)院麻醉與危重癥醫(yī)學科，武漢 430079

目的 建立小鼠變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)模型，觀察金銀花提取物對變應性鼻炎小鼠炎性因子水平的影響。方法 選取60只健康成年雄性C57BL/6小鼠，按照隨機數(shù)字法隨機分為4組：空白對照組、模型對照組、金銀花治療組、陽性對照組，每組15只。采用卵清蛋白(OVA)建立小鼠AR模型。采取積分法記錄AR癥狀嚴重程度；取小鼠鼻中隔黏膜，用流式細胞儀分析IL-17來源；ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、sIgE的表達水平；小鼠鼻中隔黏膜病理切片計數(shù)嗜酸性粒細胞；RT-PCR法檢測鼻中隔黏膜中IL-17 mRNA的表達；Western blot法檢測IL-17蛋白表達水平。結果 金銀花治療組及陽性對照組小鼠撓鼻、噴嚏及流涕情況較模型對照組有明顯減輕。通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)IL-17主要來源于γδT細胞。金銀花治療組及陽性對照組小鼠鼻黏膜病理切片嗜酸性粒細胞計數(shù)，血清IL-4、IL-17、sIgE水平，組織IL-17 mRNA的表達，IL-17蛋白表達水平等，均較模型對照組降低(均P<0.01)，而血清IL-2、IFN-γ水平均上升(均P<0.01)。結論 金銀花提取物可調控OVA致敏的AR小鼠炎性因子的表達，對AR具有免疫調節(jié)作用。

金銀花提取物； 小鼠； 變應性鼻炎； 白細胞介素-17； γδT細胞

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉頭頸外科臨床的一個常見病、多發(fā)病，是特應性個體接觸了致敏原后由IgE介導的介質釋放、并有多種免疫活性細胞和細胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應性疾病[1]。其發(fā)病機制復雜且尚不明確，使得目前臨床上用于治療AR的藥物種類繁多、使用周期長、費用高、效果不理想，所以對AR發(fā)病機制的研究成為國內外研究的熱點[2]。AR發(fā)病機制有多種因素參與，比如特應型個體學說和衛(wèi)生假說[3]。近期又有研究指出IL-17在AR的發(fā)病中也起到了重要作用，但分泌IL-17的T細胞和與IL-17有關的細胞因子在AR中是否也有相應變化尚不清楚。本實驗通過建立小鼠AR模型，檢測小鼠鼻腔黏膜內IL-17+T細胞比例，血清中IL-17等相關細胞因子含量，初步探討了小鼠AR模型中IL-17的來源及金銀花對相應細胞因子表達的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

實驗動物：本研究中所有動物實驗，均按照國家相關法律及動物倫理學要求在武漢大學動物實驗中心內進行，70只(其中10只備用)健康成年雄性C57BL/6小鼠(7～9周齡、體重20～25 g)飼養(yǎng)于光/暗周期為12 h/12 h(光照時間7：00～19：00)、(22±2)℃、濕度(52±2)%的標準實驗室條件下，自由獲得飼料和飲水。

主要試劑：卵清蛋白(OVA)購于美國Sigma公司，金銀花提取物購自四川省廣漢市維康植化有限公司，IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、sIgE檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程公司。引物由上海賽百盛基因技術有限公司設計、合成并提純。氟波酯(PMA)、離子霉素(ionomycin)均購自美國EB公司，小鼠淋巴細胞分離液購自中科院天津所，Trizol購于TaKaRa公司。RT-PCR試劑盒、DNA標記購于北京天根生化科技公司。

實驗儀器：小動物呼吸機(哈佛683，美國)，血氣分析儀(i-State，美國)，石蠟切片機(Leika超薄切片機，德國)，PCR儀(Bio-Rad MJ PTC-100TM，美國)，半干式轉膜儀(Bio-Rad 170-3940，美國)，酶標儀(Bio-Rad 680，美國)。

1.2 模型制備

本研究采用OVA建立小鼠AR模型。除空白對照組外，其余各組小鼠在第1、5、14和21天以含卵清蛋白(OVA)25 μg、氫氧化鋁凝膠1 mg、生理鹽水0.5 mL的混懸液0.5 mL行小鼠腹腔注射進行基礎致敏；基礎致敏后，于第28天開始以500 μg OVA加20 μL生理鹽水給予小鼠雙側鼻腔滴注，連續(xù)進行10 d局部激發(fā)[4]。

模型成功判定方法參照文獻[5]。末次激發(fā)30 min內觀察小鼠撓鼻、噴嚏及流涕行為。撓鼻：輕搔鼻1～2次為1分，劇烈抓撓鼻面不止記3分，介于二者之間為2分；噴嚏：1～3個為1分，4～10個為2分，≥11個為3分；流涕：流至前鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。以上各項指標計分疊加，總分>5分表示模型制備成功。

1.3 實驗分組及干預

選取C57BL/6雄性小鼠60只，采用隨機數(shù)字法將實驗小鼠隨機分成4組：空白對照組、模型對照組、金銀花治療組、陽性對照組，每組15只。

空白對照組與模型對照組以等體積生理鹽水1 mL灌胃，金銀花治療組與陽性對照組分別以金銀花提取物或枸地氯雷他定灌胃。金銀花提取物配成濃度為0.06 g生藥/mL，每次0.5 mL/只，每天1次灌胃，連續(xù)10 d。枸地氯雷他定按0.6 mg/kg灌胃，連續(xù)10 d。同時隔天以OVA滴鼻以維持過敏狀態(tài)。

1.4 癥狀評分

于最后1次給藥0.5 h后OVA滴鼻激發(fā)，觀察30 min內小鼠撓鼻、噴嚏及流涕情況，采取積分法記錄上述癥狀程度，與給藥前的癥狀積分比較。

1.5 ELISA法檢測各組小鼠血清中sIgE、IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ水平

各組小鼠最后1次激發(fā)24 h后，用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，暴露其腹主動脈，用注射器抽取腹主動脈血1 mL，注入抗凝管中，3 000 r/min離心15 min，分離血清，采用ELISA法檢測各組小鼠血清中sIgE水平和免疫細胞因子IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表達情況，操作按試劑盒說明書進行。

1.6 光鏡下嗜酸性粒細胞(EOS)計數(shù)

各組小鼠經放血處死后，剖開鼻腔，取其中一側部分鼻中隔黏膜，10%甲醛固定，石蠟包埋后行組織切片(層厚5 μm)，行蘇木精-伊紅染色。光鏡下觀察嗜酸性粒細胞(EOS)并計數(shù)。每張切片觀察5個高倍視野(×400)，取其平均值。

1.7 流式細胞儀分析IL-17來源

取模型組小鼠部分鼻中隔黏膜放入RPMI 1640無菌培養(yǎng)液中用注射器反復沖洗，再用無菌PBS沖洗3遍，直至呈現(xiàn)白色。后將其置400目鋼網(wǎng)上，剪成約1 mm3的小塊反復研磨。然后將收集到的5 mL細胞懸液渦旋振蕩后沿管壁緩慢加入含有5 mL Ficoll的離心管中，重懸離心吸取中間層細胞。無菌PBS 1 500 r/min離心5 min，沖洗2遍，以1640培養(yǎng)液重懸細胞。計數(shù)后接種至96孔板，加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)待用。在分離細胞中加入PMA、離子霉素及高爾基阻斷劑，在200 μL體系終濃度分別為50、500 ng/mL和2 μg/mL，共同孵育4 h。1 800 r/min離心5 min收集細胞，以染色緩沖液重懸洗滌細胞棄去上清，再次以50 μL重懸，每孔細胞加入0.25 μL的APC-anti-mouse-CD45、APC-anti-mouse-IL-17A室溫避光保存30 min。以PBS洗2遍后加入100 μL固定液4℃避光孵育15 min，離心棄上清。加入破膜液，1 800 r/min離心5 min棄上清。用50 μL小鼠血清封閉10 min，PBS洗2次分2管，分別加入APC-anti-mouse-γδTCR、APC-anti-mouse-NK1.1、APC-anti-mouse-Th17和APC-anti-mouse-neutrophil 0.25 μL，室溫避光30 min，通透洗液洗2遍，以200 μL PBS重懸細胞后，上機檢測。

1.8 RT-PCR法檢測IL-17 mRNA的表達

取另一側鼻中隔黏膜，Trizol一步法提取細胞總RNA后合成cDNA。內參照β-actin引物序列為：上游引物5′-CTAGGCACCAGGGTGTGATG-3′，下游引物5′-GGGGTACTTCAGGGTCAGGA-3′；IL-17引物序列為：上游引物5′-CCCTCAGACTACCTCAACCG-3′，下游引物5′-CAGCTTTCCCTCCGCATT-3′。PCR反應條件：94 ℃(1 min)、57 ℃(1 min)、72 ℃(45 s)，30個循環(huán)，末次延伸為72 ℃(10 min)。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，采用美國Bio-Rad公司凝膠圖像分析儀進行定量分析，以與內參的吸光度比值反映目的基因的相對表達量。

1.9 Western blot法檢測IL-17蛋白表達水平

采用細胞裂解液Buffer A提取鼻中隔黏膜細胞蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度后，取5 μg蛋白上樣、電泳轉膜、封閉后一抗過夜，膜漂洗后二抗雜交，ECL化學發(fā)光法顯影。采用美國Bio-Rad公司圖像分析儀進行定量分析，以目的條帶與內參條帶的吸光度比值反映目的蛋白的相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠癥狀評分

除空白對照組外，造模后各組小鼠均出現(xiàn)不同程度撓鼻、噴嚏及流涕癥狀，癥狀評分均大于5分，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，表示造模成功。經過干預措施治療后，金銀花治療組、陽性對照組小鼠撓鼻、噴嚏及流涕情況較模型對照組有明顯減輕，其差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。見表1。

組別治療前治療后空白對照組4.15±0.464.03±0.57模型對照組7.99±0.38#7.76±0.72#金銀花治療組7.91±0.41#4.31±0.55*陽性對照組7.98±0.45#4.23±0.47*

與空白對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.01

2.2 小鼠鼻中隔黏膜嗜酸性粒細胞計數(shù)

蘇木精-伊紅染色后，每張切片隨機選取5個高倍視野，觀察分析實驗小鼠鼻中隔黏膜組織內EOS浸潤情況。結果顯示：空白對照組小鼠鼻中隔黏膜組織內無明顯EOS浸潤，平均每個高倍視野中EOS計數(shù)為(2.03±0.67)個。模型對照組小鼠鼻中隔黏膜部分纖毛結構脫落，小血管擴張，組織水腫，腺體增生，黏膜上皮下固有層伴有大量EOS等炎性細胞浸潤，平均每個高倍視野中EOS計數(shù)為(47.79±0.94)個，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；金銀花治療組和陽性對照組小鼠鼻中隔黏膜纖毛結構基本完整，黏膜結構基本正常，上皮細胞排列較整齊，少見EOS浸潤，平均每個高倍視野中EOS計數(shù)分別為(7.71±1.41)、(8.48±0.95)個，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。見圖1。

A：正常對照組，可見鼻中隔黏膜無明顯EOS浸潤；B：模型對照組，鼻中隔黏膜有大量EOS浸潤；C、D：金銀花治療組和枸地氯雷他定治療的陽性對照組，鼻中隔黏膜EOS浸潤明顯減少；紅色箭頭所示為EOS 圖1 4組小鼠鼻中隔黏膜蘇木精-伊紅染色(×400)Fig.1 HE staining of nasal septal mucosa in 4 groups of mice(×400)

2.3 小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、sIgE的表達

從表2可見，模型對照組小鼠血清IL-4、IL-17、sIgE水平均較空白對照組上升，而血清IL-2、IFN-γ水平均較空白對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。金銀花治療組、陽性對照組小鼠血清IL-4、IL-17、sIgE水平均較模型對照組均降低，而血清IL-2、IFN-γ水平均較模型對照組上升，其差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

組別IL-2IL-4IL-17IFN-γsIgE空白對照組15.59±2.3612.13±2.03201.37±12.5724.05±6.2320.58±2.33模型對照組5.35±1.93#35.49±3.28#649.76±11.72#10.97±5.34#48.46±2.74#金銀花治療組12.12±1.21*19.71±3.10*228.90±12.95*21.72±5.40*22.36±2.25*陽性對照組11.13±1.73*13.88±3.11*226.73±13.27*22.63±6.26*24.54±2.66*

與空白對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.01

2.4 小鼠鼻中隔黏膜細胞中IL-17的來源

從圖2可見，通過對造模成功的小鼠鼻中隔黏膜細胞進行流式細胞技術分析，CD45+IL-17A+細胞中γδTCR+占76.2%，Th17+占15.6%，NK1.1+占3.8%，neutrophil+占4.4%。可見鼻中隔黏膜細胞中IL-17主要來源于γδT細胞(P<0.05)。

與γδTCR+比較，*P<0.05圖2 流式細胞儀分析IL-17來源Fig.2 Flow cytometric analysis of IL-17 sources

2.5 小鼠鼻中隔黏膜細胞IL-17 mRNA的表達水平

RT-PCR檢測結果顯示：模型對照組IL-17 mRNA的表達水平較空白對照組顯著增高(P<0.01)；金銀花治療組、陽性對照組IL-17 mRNA的表達水平較模型對照組均顯著降低(均P<0.01)。見表3、圖3。

2.6 小鼠鼻中隔黏膜細胞IL-17蛋白的水平

Western blot法檢測結果顯示：模型對照組IL-17蛋白水平較空白對照組顯著增高(P<0.01)；金銀花治療組、陽性對照組IL-17蛋白水平均較模型對照組顯著降低(均P<0.01)。見表3、圖4。

組別IL-17mRNAIL-17蛋白空白對照組0.615±0.0460.303±0.057模型對照組1.790±0.038#0.967±0.072#金銀花治療組0.910±0.041*0.431±0.055*陽性對照組0.880±0.045*0.423±0.047*

與空白對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.01

A：空白對照組；B：模型對照組；C：金銀花治療組；D：陽性對照組圖4 Western blot檢測各組IL-17蛋白的表達Fig.4 Detection of IL-17 protein in each group by Western blotting

3 討論

金銀花是我國中醫(yī)藥寶庫中重要而常用的品種，近年來國內外學者運用現(xiàn)代藥理理論和技術對金銀花進行了較全面的分析和研究，從科學的角度證實了金銀花具有調節(jié)免疫、廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤及解熱抗炎、保肝、利膽、降脂、抗生育、止血、抗?jié)兊榷喾N藥理作用。有研究表明，金銀花具有促進白細胞和炎性細胞吞噬的作用，還能降低豚鼠T細胞a-醋酸萘酯酶(ANAE)百分率，降低中性粒細胞(PMN)的體外分泌，具有恢復巨噬細胞功能，調理淋巴細胞功能，上調IL-2水平等作用[6]。金銀花提取物可通過降低特異性IgE水平而發(fā)揮抗過敏作用，但受濃度影響較大；通過減少抗卵清蛋白特異性IgE抗體的產生而對抗Ⅰ型變態(tài)反應；還能抑制肥大細胞的組織胺釋放，在一定程度上抑制過敏反應的發(fā)生[7]。還有實驗表明金銀花35%乙醇提取物的水溶液具有顯著的預防過敏的作用[8]。

AR的發(fā)病機制有多種因素參與，首先是特應型個體學說與衛(wèi)生假說。特應型個體又稱為過敏性體質，是指患者體質異常，對環(huán)境中的某些刺激物特別敏感，引起高Th2應答反應?！靶l(wèi)生假說”[9]的核心是機體內抗感染免疫反應與變態(tài)反應之間存在一定的拮抗關系，家庭衛(wèi)生條件的改善和抗生素的大量應用減少了細菌、病毒和寄生蟲等的感染，Th1反應降低而Th2反應增強。其次是Th1與Th2平衡機制，從基本Th1 /Th2細胞因子免疫平衡到Th/Toll樣受體調節(jié)的Th1 /Th2免疫應答的平衡[10-13]。此外還涉及IgE及其受體，肥大細胞、嗜堿性粒細胞及相關炎癥介質等。而以上都不能解釋過敏性疾病發(fā)生的全部機制。其中Th1 /Th2平衡機制具有重要意義。T細胞是免疫系統(tǒng)的基本組成，并且在免疫應答的過程中發(fā)揮重要作用，既參與對感染的適當免疫反應又參與對過敏原的超敏反應[14]。傳統(tǒng)觀點認為，根據(jù)分泌因子的不同可將CD4+T細胞分為Th1和Th2兩個亞群[15]。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ、TGF-β和TNF等，參與抗感染的細胞免疫應答；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等，參與變態(tài)反應的體液免疫應答。而過敏性疾病的發(fā)生則主要是由Th2細胞驅動的，AR患者Th1細胞數(shù)量下降，Th2水平明顯升高，Th1 /Th2平衡失調。鼻腔黏膜大量表達Th2細胞因子的輔助性T細胞、EOS的浸潤，同時產生大量的炎性介質，進而引發(fā)鼻腔黏膜的炎癥反應。

近年來隨著Th17的發(fā)現(xiàn)，又將CD4+T淋巴細胞分為Th1、Th2、調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)和Th17等4大亞群[16]，其中Th17細胞的主要效應因子是IL-17。IL-17是一種主要由活化的T細胞產生的致炎細胞因子，可以通過促進釋放促炎細胞因子來放大炎癥反應，從而誘發(fā)自身免疫性疾病及慢性過敏性疾病。有大量研究發(fā)現(xiàn)γδT細胞也是IL-17的重要來源，在多種疾病的小鼠模型中，γδT細胞的某些亞群能通過早期產生大量IL-17，在感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[17]。這些新發(fā)現(xiàn)和新概念對于推動T細胞免疫和變態(tài)反應以及相關疾病的免疫學機制的研究有著深遠的意義。

本研究造模成功后，CD45+IL-17A+細胞中γδT細胞占比高于Th17細胞，即在AR炎癥初期，IL-17主要來源于γδT細胞，而并非有些文章中提到的Th17細胞。在模型組小鼠中，IL-17、IL-4的水平高于空白對照組，而IL-2、IFN-γ低于空白對照組，說明在變應性鼻炎超敏反應中，除了與大多數(shù)關于變應性鼻炎Th1 /Th2細胞因子免疫平衡機制的研究一致(即Th2類細胞增生)以外，IL-17分化亦占優(yōu)勢，而Th1類細胞受到抑制。在經過金銀花治療后，IL-4、IL-17、sIgE水平均較模型對照組降低，而IL-2、IFN-γ水平較模型對照組上升，提示金銀花提取物參與了OVA致敏的變應性鼻炎小鼠細胞因子的調節(jié)，并在變應性鼻炎的治療中發(fā)揮了重要的免疫調節(jié)作用。

變應性鼻炎因其機制復雜，治療上多采用抗過敏藥物治療、脫敏治療乃至手術治療，抗過敏藥物多為抗組胺及激素類藥物，副作用較大，脫敏治療的效果亦不甚滿意，而手術治療的風險高，遠期療效亦不確切。中藥口服治療變應性鼻炎，其效果顯著，副作用小，但其治療變應性鼻炎的作用較西藥作用緩慢，而且很多療效的評價缺乏實驗室指標等統(tǒng)一標準。中藥復方的藥效機制研究是中藥現(xiàn)代化重要戰(zhàn)略之一。目前治療變應性鼻炎的中成藥中尚未見以金銀花為主要成份的藥物，但根據(jù)對金銀花相關免疫調節(jié)作用的研究，我們期望以此在變應性鼻炎的中藥治療上提供一種新的思路。

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(2017-02-06 收稿)

Effect of Honeysuckle Extract on Expression of Cytokines in Mice with Allergic Rhinitis

Jian Lei，Xiao Caiwen，He Qingwenetal

DepartmentofOtorhinolaryngology，AffiliatedHospitalofJianghanUniversity，Wuhan430015，China

Objective To establish a mouse model of allergic rhinitis (AR)，and to observe effect of Honeysuckle extract on inflammatory factors in AR mice.Methods Sixty healthy male C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups：blank control group，model control group，treatment group and control group.AR mouse model was established by using ovalbumin(OVA).AR symptom severity was graded by score.Nasal mucosa of the mice was harvested.IL-17 source was analyzed by flow cytometry.Expression levels of IL-2，IL-4，IL-17，IFN-γ and sIgE in serum were detected by ELISA.Eosinophilic granulocytes were counted in nasal mucosa section of the mice.Expression of IL-17 mRNA was detected by RT-PCR.Western blotting was used to detect the expression level of IL-17 protein.Results Symptoms of scratching nose，sneezing and runny nose were significantly alleviated in the Honeysuckle treatment group and positive control group as compared with the control group.The flow cytometry results showed that IL-17 was mainly derived from γδT cells.Eosinophilic granulocyte count，serum IL-4，IL-7 and sIgE，tissue IL-17 mRNA and protein were significantly decreased，while IL-2 and IFN-γ significantly increased in the Honeysuckle treatment group and positive control group as compared with the control group (allP<0.01).Conclusion The extract of Honeysuckle extract can regulate expression of inflammatory factors in OVA sensitized AR mice，and exert immunomodulatory effect on AR.

Honeysuckle extract； mice； allergic rhinitis； interleukin 17； γδT cells

*武漢市衛(wèi)生計生委2017年度臨床醫(yī)學科研項目(No.WZ17D14)；湖北省科技廳科技條件資源開發(fā)項目(No.2015BCE099)

R765.213

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.009

簡 雷，男，1979年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，E-mail：jianyutian@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：wb000326@whu.edu.cn