（東莞理工學院城市學院，廣東 東莞 523419）

一、引言

隨著現(xiàn)代工業(yè)化的快速發(fā)展，油類產(chǎn)品運用越來越廣泛。但在人們開采和使用油的過程中，若稍有不慎就會帶給自然生態(tài)環(huán)境帶來巨大的危害。由于油自身的密度比水的密度要低，所以油層覆蓋在水面上，阻止空氣中的氧氣向水中擴散，隔絕了水與氧氣的接觸，進而使得水體自凈能力下降。水體中由于溶解氧含量減少，水中生態(tài)環(huán)境遭到破壞，使藻類難以進行光合作用，影響水生生物的正常生長，甚至使水體變臭，破壞水體的生態(tài)環(huán)境[1]。

人工濕地主要由填料、水生植物和微生物三部分組成[2]。人工濕地在物理、化學及生物共同作用下，具有凈化效果好、去除氮磷能力強、工藝設備簡單、運行費用低、生態(tài)環(huán)境效益顯著等優(yōu)點。不同填料的孔隙率對廢水的處理效果有所不同，薛鈞尹對不同人工濕地填料對含油廢水的吸附研究說明沸石、蛭石、陶?？勺鳛槿斯竦靥幚砗蛷U水的優(yōu)選填料[3]。

現(xiàn)階段國內(nèi)外的專家學者篩選出的高效降解油脂的微生物主要有細菌、酵母、真菌中的需氧性的種類，這些菌種大多都可以分泌出胞外脂肪酶，它們能有效降解油脂。賈彩云[4]在受石油污染的土壤中篩選出蠟狀芽孢桿菌，該菌的石油降解率為70%～80%。倪娜[5]也曾在污泥中找到奧默畢赤酵母，其柴油降解率最大為30.7%。

因此，本研究擬選擇多種不同的水生植物，構建多組人工濕地模型，通過測定含油廢水處理前后的水質特征，來比較人工濕地模型處理含油廢水的效果，找到最佳的組合，并從濕地土壤中篩選出高效降油菌，為人工濕地的建設提供可行性參考。

二、材料和方法

（一）人工濕地反應器的構造

如圖1所示，在塑料桶上方和下方各開一個直徑為2cm的圓口，作為進水口和出水口。隨后在桶里鋪設不同類型的填料，制作三組填料組合分別為：泥土+陶粒+紅磚顆粒+麥飯石、泥土+陶粒+水泥磚顆粒+麥飯石、土壤+陶粒+石英砂+麥飯石模擬人工濕地，填料層厚均為10cm。最后在人工濕地模型泥土上分別種上美人蕉和蘆葦。

圖1 人工濕地反應器構造圖

（二）實驗方法

1.人工濕地對含油廢水的處理效果研究

將含油量濃度為1000mg/L的含油廢水作為進水，進入到人工濕地模型中，探究相同植物不同填料組合和不同植物相同填料組合的條件下，監(jiān)測處理前后含油廢水中COD、總磷和油濃度的變化情況。水中COD、總磷和油濃度的測定參考水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）[6]。

2.含油微生物的篩選及其降解率的研究

（1）配制無機鹽培養(yǎng)基（硫酸銨0.5g，二氯化鈣0.1g，磷酸二氫鈉1.0g，硝酸鈉0.5g，七水硫酸鎂0.25g，磷酸二氫鉀1.0g，蒸餾水1000mL，用氫氧化鈉調節(jié)pH值至7.0）、柴油無機鹽培養(yǎng)基（在上述無機鹽培養(yǎng)基中加入1000mg/L柴油）、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，用氫氧化鈉調節(jié)pH值至7.0）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨10g，牛肉浸出粉5.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂12.0g，蒸餾水1000mL）

（2）稱取2g人工濕地模型土壤，放入裝有100mL無機鹽培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，在培養(yǎng)基中加入含量為500mg/L的柴油作為微生物唯一碳源，在30℃下以200r/min轉速震蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基明顯混濁，靜置2～3min。以10%的接種量取上層液接入裝有50mL無機鹽培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，隨后放入恒溫搖床。此后每隔2天轉接一次，不斷重復該過程并逐步提高柴油的濃度至1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L，通過觀察柴油的油脂層是否消失判斷石油的降解程度，連續(xù)馴化傳代后，取少量菌株富集液在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，在30℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24～48h，當平板上出現(xiàn)細菌菌落時，挑選單菌落平板劃線。為得到更加純化的菌株，反復用平板培養(yǎng)基轉接分離多次，直到分離完全。與此同時，對單個菌株也進行純化處理。菌種的富集選取平板培養(yǎng)基上生長狀況良好的單菌落，根據(jù)菌落的大小、形狀、表面光澤、隆起程度、透明程度、邊緣形狀、菌落顏色的不同，最終挑取在培養(yǎng)基中生長快、菌落規(guī)則、傳代穩(wěn)定的目的單菌落。

（3）篩選出單一純種柴油降解菌后，對其進行革蘭氏染色并在光學顯微鏡下觀察其形態(tài)。

（4）將已經(jīng)確定出具有降解柴油能力的菌種接種至無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)中后一段時間內(nèi)的OD600變化，并研究其生理特性。

耐溫性：各取一環(huán)降解菌接入無機鹽培養(yǎng)基中，分別于15～45℃培養(yǎng)48小時后于600nm處，測培養(yǎng)液的OD600值，以確定菌株生長的最適生長溫度。

耐酸性：各取一環(huán)降解菌接入pH為5～10為無機鹽培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48小時后于600nm處，測培養(yǎng)液的OD600值，以確定菌株生長的最適生長pH值。

（5）通過菌株的生長特性研究判斷出菌株生長活性最強條件后，菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，放到30℃溫度下的恒溫搖床，以200r/min轉速震蕩培育到活性最強的時期，取2mL將菌株的培養(yǎng)液接入裝配有100mL無機鹽培養(yǎng)基和1mL柴油的250mL錐形瓶內(nèi)，30℃溫度下200r/min轉速的恒溫搖床下震蕩培養(yǎng)。此后，每隔24h測定一次菌株對柴油的降解率。

三、結果與分析

（一）處理效果

1.不同填料對含油廢水的處理結果

表1 不同填料組合模型對含油廢水COD、總磷和柴油的去除率

圖2 不同填料組合模型對含油廢水COD、總磷和柴油的去除率圖

3種不同類型的填料組合中，陶粒+水泥磚+麥飯石的組合對含油廢水中的COD去除率最高，達到67.1%；陶粒+水泥磚+麥飯石的組合對含油廢水中的總磷去除率最高，達到48.9%；陶粒+水泥磚+麥飯石的組合對含油廢水中的油脂去除率最高，效果最好，達到89.1%。

2.不同植物對含油廢水的處理

在相同的填料組合陶粒+水泥磚+麥飯石的人工濕地模型中，種植兩種不同植物，考查對含油廢水的處理效果。

表2 不植物類型對含油廢水的含油去除率

圖3 不植物類型對含油廢水的含油去除率圖

由圖3可知，種植美人蕉的模型COD和油脂去除率都比種植蘆葦?shù)哪Ｐ透?，達到67.1%和89.1%。而種植蘆葦模型廢水中的總磷比種植美人蕉模型的去除率要出1.4%。這可能與兩種植物的根系生長情況不同有關。

（二）柴油降解菌生長特性研究

1.柴油降解菌的篩選與鑒定

從樣品土壤的篩選與分離得到2株形態(tài)各異的降解菌,編號為A1,B1。對這2株降解菌的形態(tài)特征進行描述，結果見表3。

表3 菌株的形態(tài)特征描述表

通過對分離出來的A1、B1這兩種菌株進行革蘭氏染色，將其涂片放到100倍物鏡的光學顯微鏡下鏡檢，觀察菌株的細胞形態(tài)結構。

A1在顯微鏡下觀察呈卵圓形狀，體型較小，結合倪娜對降解柴油酵母菌的分離純化及性質研究和康燕莉對高效油脂降解菌株的篩選及在含油廢水處理中的應用[1]，初步確定A1屬于酵母菌。

圖4 顯微鏡下A1菌株形態(tài)圖

B1在顯微鏡下觀察呈桿狀，以單一細菌形態(tài)排列，革蘭氏染色呈紫色，屬于革蘭氏陽性菌。結合劉婕對除油菌的篩選鑒定及油脂廢水的處理研究和康燕莉對高效油脂降解菌株的篩選及在含油廢水處理中的應用研究[1]，初步確定B1屬于桿菌。

圖5 顯微鏡下B1菌株形態(tài)圖

2.柴油降解菌生長特性及降解率研究

將菌株A1、B1分別接種于無機鹽液體培養(yǎng)基中，在其培養(yǎng)過程中，每隔4小時取發(fā)酵液測定光密度值OD600，分析A1的生長狀況，根據(jù)所得結果繪制菌株A1的生長曲線。

從菌株的生長曲線可以看出，A1和B1都是培養(yǎng)6h后進入對數(shù)生長期，到24h左右達到對數(shù)生長后期。因此，后續(xù)實驗應選取培養(yǎng)24h后的菌液作為種子液。

圖6 菌株生長曲線

3.溫度對柴油降解菌生長的影響

為了得到A1和B1的最佳生長條件，改變柴油降解菌常規(guī)生長溫度探究培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響。由圖7可知，隨著溫度升高，菌株A1和B1的數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，30℃為最適生長溫度；溫度低于25℃或高于35℃時，菌株的生長會受到抑制，這可能是由于溫度的變化造成菌株細胞內(nèi)酶活性降低，新陳代謝活動減慢。

圖7 溫度對菌株生長的影響

4. pH值對柴油降解菌生長的影響

利用HCl和NaOH溶液調節(jié)種子液培養(yǎng)基的pH值，在30℃環(huán)境下培養(yǎng)48h，探究pH值對兩株柴油降解菌生長的影響。從圖8可以看出，pH值對A1和B1兩株柴油降解菌生長的影響相似，適應于偏中性的環(huán)境。pH值6.0至8.0時生長良好，pH值為5.0和10.0時，生長受到明顯抑制。利用HCl和NaOH溶液調節(jié)種子液培養(yǎng)基的pH值，在30℃環(huán)境下培養(yǎng)48h，探究pH值對兩株柴油降解菌生長的影響。從圖3-5可以看出，pH值對A1和B1兩株柴油降解菌生長的影響相似，適應于偏中性的環(huán)境。pH值6.0至8.0時生長良好，pH值為5.0和10.0時，生長受到明顯抑制。

圖8 pH值對菌株生長的影響

（三）菌株的降解率

根據(jù)圖6、7和8得出的菌株最佳生長條件，將兩種菌株分別加入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到生長活性較強時，取2ml培養(yǎng)液加入柴油濃度為1000mg/L的無機鹽培養(yǎng)基液體中，在30℃溫度下的恒溫搖床，200r/min轉速震蕩培養(yǎng)24小時、48小時、72小時、96小時和120小時后，測定A1、B1兩種菌株的降解率。

通過數(shù)據(jù)我們得知A1在5天內(nèi)對柴油最大的降解率為43.3%，B1在5天內(nèi)對柴油最大的降解率為41.5%，兩種微生物對柴油的最大降解率均為40%左右。根據(jù)武金裝等[7]從油污土壤中分離出石油降解菌對1000mg /L柴油的最大降解率約為80%。王世杰等[8]研究表明高濃度柴油能夠抑制菌株生長，降低降解率，其分離出的石油降解菌對濃度為1%的柴油降解率為58.6%對濃度為10%的柴油降解率僅為18.2%。本實驗中的A1和B1菌株與以往結果相比具有較好的降解潛力。

從圖9還能看出降解前3天兩株菌的降解率都不斷提高，當降解天數(shù)到第3天時，其降解率幾乎達到最高值。若此后再繼續(xù)降解，兩種菌株的降解率不會再有明顯的提高，這一現(xiàn)象與何愛翠[9]、劉海華等[10]實驗結果相似。因此，在實際應用中，應該注意微生物的降解時長，長時間的降解未必能提高降解率，反而會影響處理效率。

圖9 菌株的降解率

四、實驗研究結果分析

通過對比不同填料組合和不同植物對人工濕地去除含油廢水的效果，最終得到以下結論：

1.不同填料組合對于含油廢水中COD的去除效除率高低順序為：“陶粒+水泥磚+麥飯石”>“陶粒+紅磚+麥飯石”>“陶粒+石英砂+麥飯石”；總磷去除率高低順序為：“陶粒+水泥磚+麥飯石”>“陶粒+石英砂+麥飯石”>“陶粒+紅磚+麥飯石”；對柴油去除作用強弱的順序為：“陶粒+水泥磚+麥飯石”>“陶粒+紅磚+麥飯石”>“陶粒+石英砂+麥飯石”。這與不同填料之間比表面積和填料間的空隙大小有關。

對于不同植物在同一填料組合的人工濕地模型，美人蕉的對含油廢水中COD、總磷和油脂的凈化能力均比蘆葦要強，因此美人蕉更加適合種植在凈化含油廢水的人工濕地中。

總得來說，填料組合為“陶粒+水泥磚+麥飯石”，種植美人蕉的人工濕地模型的凈化效果最好。

2.從濕地模型泥土中篩選分離后得到兩株降解菌，命名為A1和B1。通過革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，初步確定這兩種微生物A1系酵母菌，B1系桿菌。

從生長曲線分析，A 1和B 1適宜菌齡為24h～48h，可生長溫度為25℃～35℃，最適應生長溫度為30℃；適應于中性環(huán)境生長，在pH值為6.0～8.0的范圍內(nèi)生長活性較高。

對這兩種微生物的馴化培養(yǎng)后，將其分別接種到柴油濃度為1000mg/L的液體中，通過恒溫搖床震蕩培養(yǎng)測定了這兩種微生物的5天內(nèi)對柴油的降解率。A1 在5天內(nèi)對柴油最大的降解率為43.3%，B1在5天內(nèi)對柴油最大的降解率為41.5%，數(shù)據(jù)說明這兩種微生物對柴油均有一定的降解能力。通過圖9還可以看出微生物降解時間不易過長，降解時間約為3天較為合適，即使長時間降解，降解率亦沒有明顯提高,反而會影響處理效率。

五、結論

實驗設計的三個不同的人工濕地模型中，“陶粒+水泥磚+麥飯石”的填料組合對含油廢水中COD、總磷和柴油的去除率均高于其他兩種填料組合。對于相同填料組合的人工濕地模型，種植美人蕉對含油廢水中COD、總磷和油脂的凈化強于種植蘆葦，推斷美人蕉更加適合種植在凈化含油廢水的人工濕地中。在模型土壤中篩選兩株降解菌株初步確定為酵母菌和桿菌,其在5天內(nèi)對1000mg/L石油降解率分別達到43.3%和41.5%。

實驗測定油脂含量的方法為重量法。該方法只能對10mg/L的含油樣品進行測定；而且操作復雜，靈敏度低，對操作人的操作要求較高。若實驗室條件許可，可使用紅外分光光度法或非分散紅外光度法對油脂含量進行測定。至于降解菌的鑒別，因為現(xiàn)實條件的不允許，只能通過光學顯微鏡觀察，再結合微生物菌落的生長形態(tài)特征與其他研究文獻比較進行簡單的初步判斷，不能最終確定出微生物的種類。

實驗篩選出來的這兩種菌株應為土著微生物，其降解能力肯定不如一直生在被含油廢水污染環(huán)境下的微生物，但后續(xù)可以對其進行基因誘變或誘導，使得微生轉變成基因工程菌，增強其在含油廢水環(huán)境下的生長能力以及對油的降解能力，為處理含油廢水等其他一系列油脂污染問題提供更為高效合理的治理方法。

[1]康燕莉.高效油脂降解菌株的篩選及在含油廢水處理中的應用[D].蘭州：蘭州交通大學,2013.

[2]薛鈞尹,肖昕.垂直潛流人工濕地對含油廢水凈化效果的研究[J].工業(yè)水處理,2014,34(11)：21-24.

[3]薛鈞尹,肖昕.不同人工濕地填料對含油廢水的吸附性能[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2013,41(12)：350-353.

[4]賈彩云.石油降解菌的分離鑒定和降解條件研究[D].長沙：湖南大學,2008.

[5]倪娜.降解柴油酵母菌的分離純化及性質研究[D].曲阜：曲阜師范大學,2011.

[6]國家環(huán)境保護總局編.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4版.北京：中國環(huán)境科學出版社,2002.

[7]武金裝,劉紅玉,曾光明等.柴油降解菌的篩選及其降解特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2008,27(5)：1742-1746.

[8]王世杰,王翔,盧桂蘭等.柴油降解菌的篩選鑒定及其降解特性研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報,2011,30(1)：49-54.

[9]何愛翠.微生物降解法處理工業(yè)含油廢水的研究[D].長沙：中南大學，2007.

[10]劉海華,吳奇.適用于柴油降解的微生物菌種降解能力研究[J].環(huán)境科學與管理,2008,33(5)：53-56.