梁悅+張光濤+湯曉萌+王迎春+劉玉琴+史君

[摘要] 目的 探討從心血管壓力負(fù)荷增加到心肌肥厚形成的全過程中收縮壓和心重指數(shù)的變化。 方法 選用健康雄性Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為假手術(shù)組與腹主動(dòng)脈縮窄組，每組各40只。兩組大鼠分別隨機(jī)分配到4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后3 d、1周、2周和4周），各10只。參照腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制作壓力負(fù)荷性心肌肥厚大鼠模型，大鼠收縮壓采用無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量，電子天平稱量左心室重和體重，隨后計(jì)算心重指數(shù)（LVW/BW）。 結(jié)果 與假手術(shù)組相比較，腹主動(dòng)脈縮窄組術(shù)后3 d時(shí)，即表現(xiàn)出收縮壓升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；在術(shù)后1周，收縮壓繼續(xù)升高，心重指數(shù)開始增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；術(shù)后2、4周，收縮壓和心重指數(shù)繼續(xù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 大鼠造模1周時(shí)開始出現(xiàn)心肌肥厚，模型在4周時(shí)比較穩(wěn)定，利用腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制作壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠模型成功。

[關(guān)鍵詞] 心肌肥厚；腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)；收縮壓；心重指數(shù)

[中圖分類號(hào)] R542.2；R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）05（b）-0016-04

[Abstract] Objective To discuss the change of systolic pressure and heart weight index （HWI） in the process of cardiovascular pressure overload to myocardial hypertrophy. Methods 80 healthy male Wistar rats were randomly divided into two groups， sham operation group and abdominal aorta group. Each group was randomly separated to 4 time points （3 d， 1 week， 2 weeks， 4 weeks after surgery）. Hypertrophy rats model was made by transverse aortic constriction （TAC）， systolic blood pressure was measured by noninvasive tail arterial blood pressure measurement and analysis system. The weight of the left ventricular and body was measured by an electronic balance， and the HWI was then calculated. Results Compared with sham operation group， 3 d after TAC surgery， systolic pressure of abdominal aorta group rose， the difference was statistically significant （P < 0.05）； 1 week after TAC surgery， systolic pressure of abdominal aorta group rose， HWI increased， the differences were statistically significant （P < 0.05）； 2， 4 weeks after TAC surgery， systolic pressure of abdominal aorta group rose， HWI increased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Rat myocardial hypertrophy model is formed gradually after 1 week and the model is stable in the fourth week. By abdominal TAC， the pressure overload was successfully produced and the myocardial hypertrophy can be induced successfully.

[Key words] Hypertrophy； Transverser aortic constriction； Systolic pressure； Heart heavy index

心肌肥厚是心臟組織負(fù)荷異常增加的一種代償反應(yīng)，以心肌細(xì)胞的體積增大、蛋白質(zhì)的合成增加以及細(xì)胞間質(zhì)改變?yōu)橹饕卣?，是引起心血管疾病病死率顯著升高的危險(xiǎn)因素之一。近年來，不同學(xué)者對(duì)心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制一直進(jìn)行著深入研究，制作合適穩(wěn)定的心肌肥厚模型是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[1]，導(dǎo)致心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的重要因素之一是壓力超負(fù)荷。炎癥及心肌損傷等因素可以通過一些分子和細(xì)胞機(jī)制引起心肌肥厚[2]。除此，一些神經(jīng)體液因素，例如血管緊張素Ⅱ、去甲腎上腺素、β型轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）等也參與調(diào)節(jié)心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展[3-8]。新近研究[9-10]發(fā)現(xiàn)microRNAs（miRNAs）參與心臟的病理生理過程，并且發(fā)揮著重要作用。miRNAs是一類非編碼、內(nèi)源性的小RNA，在基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控等諸多方面起重要作用，可能促進(jìn)心肌細(xì)胞增生異常，參與心臟重塑進(jìn)程及心肌肥厚。本文參照文獻(xiàn)[9]制作大鼠壓力超負(fù)荷致心肌肥厚模型，觀察壓力負(fù)荷異常增加致心肌肥厚形成的全過程中血壓和心重指數(shù)的變化，從而對(duì)該模型制備方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡Wistar大鼠80只，體重約180 g，全部為雄性。由維通利華（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫22～24℃，相對(duì)濕度50%～60%，動(dòng)物房光照時(shí)間為8：00～20：00。按國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和腹主動(dòng)脈縮窄組，每組各40只。大鼠分別隨機(jī)分配到4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后3 d、1周、2周和4周），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各10只。

1.2 動(dòng)物模型制備

參照文獻(xiàn)[9]方法制作壓力負(fù)荷性心肌肥厚大鼠模型。術(shù)前禁食水10 h后，用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，右側(cè)臥位，在左側(cè)肋緣下腰大肌外緣術(shù)野剪毛備皮，3%碘酒消毒，用75%乙醇脫碘，鋪無菌洞巾。沿左側(cè)肋緣下作一個(gè)長約2 cm的斜形切口，依次分離腹膜后軟組織及脂肪組織，于腎動(dòng)脈上方游離一小段腹主動(dòng)脈，穿過一消毒4號(hào)手術(shù)縫線，將去尖的7號(hào)針頭連同腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，然后立即抽出針頭，造成腹主動(dòng)脈狹窄，逐層撒入少量青霉素粉，逐層縫合切口。假手術(shù)組在分離一小段腹主動(dòng)脈后，只穿過一消毒手術(shù)縫線，但不作結(jié)扎。其余手術(shù)步驟同上。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 動(dòng)脈收縮壓（SBP） 置大鼠于固定器內(nèi)，鼠尾暴露至尾根部，烤燈下加熱10 min，充分?jǐn)U張鼠尾動(dòng)脈后，在鼠尾根部固定加壓尾套，將脈搏傳感器與大鼠尾部腹面正中部緊密接觸（無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析儀，Powerlab ML125/R澳大利亞埃德儀器有限公司生產(chǎn)），查看脈搏波形，當(dāng)穩(wěn)定的脈搏波出現(xiàn)時(shí)，開始測(cè)量血壓。大鼠安靜時(shí)，尾套內(nèi)打氣加壓（選擇90～420 BPM），加壓致脈搏波減小至消失時(shí)，開始減壓放氣，當(dāng)鼠套內(nèi)壓力=收縮壓時(shí)，出現(xiàn)脈搏波，此刻血壓值等于動(dòng)脈收縮壓。動(dòng)脈收縮壓取重復(fù)測(cè)量3次的平均值，單位為kPa。測(cè)量時(shí)間點(diǎn)：假手術(shù)組和腹主動(dòng)脈縮窄組大鼠術(shù)后3 d，1、2、4周。

1.3.2 心重指數(shù)（LVW/BW） 用2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，采用電子天平上稱量并記錄體重（BW），稱重后斷頭處死，將完整心臟取出，4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗心臟，清潔濾紙吸干水分，剔除左右心房及右心室，保存左心室與室間隔并置于電子天平上稱重，計(jì)算出LVW/BW（mg/g）。測(cè)量時(shí)間點(diǎn)：假手術(shù)組和腹主動(dòng)脈縮窄組大鼠術(shù)后3 d，1、2、4周。

1.3.3 制作HE染色切片 取左心室垂直于長軸切取厚約3 mm心肌組織放入10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，制作HE染色的常規(guī)切片。具體步驟如下：將采用切片機(jī)切好的切片恢復(fù)至室溫；兩個(gè)二甲苯缸各反應(yīng)10 min；梯度酒精下行（100%Ⅱ～100%Ⅰ～95%～90%～80%～70%），各反應(yīng)5 min，自來水沖洗3次；蘇木精染色3 min，自來水沖洗；鹽酸酒精數(shù)秒，自來水反藍(lán)15 min；伊紅染色30 min，自來水沖洗浮色；梯度酒精（上行）各反應(yīng)數(shù)秒；二甲苯上行各反應(yīng)5 min；中性樹膠封片上鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列較齊整，細(xì)胞核為卵圓形，居中位置。手術(shù)1周后，心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹，出現(xiàn)少量間質(zhì)增生，部分細(xì)胞的細(xì)胞核消失；腹主動(dòng)脈部分縮窄2周后心肌細(xì)胞排列擁擠，間質(zhì)大量增生；4周后心肌纖維化明顯。見圖1～4。

2.2 SBP和LVW/BW的變化

手術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠血壓和心重指數(shù)的變化，與假手術(shù)組相比較，腹主動(dòng)脈部分縮窄3 d后SBP升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），LVW/BW無明顯的變化（P > 0.05）；腹主動(dòng)脈部分縮窄1周后，SBP繼續(xù)升高，LVW/BW開始增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；術(shù)后2、4周，SBP和LVW/BW繼續(xù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

3 討論

心肌肥厚指心肌細(xì)胞體積增大，心肌纖維增生，或者心室重量增加[11]。實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)[9]方法制做大鼠壓力超負(fù)荷致心肌肥厚模型，選取不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察。與假手術(shù)組相比較，腹主動(dòng)脈部分縮窄組3 d時(shí)血壓水平升高；1周時(shí)血壓和心重指數(shù)增加，心肌細(xì)胞直徑增大，排列不整齊，開始初步形成心肌肥厚；2周時(shí)血壓和心重指數(shù)增加明顯，心肌細(xì)胞排列較紊亂，體積增加，間質(zhì)纖維化；4周時(shí)血壓和心重指數(shù)增加顯著，心肌細(xì)胞排列更加紊亂，間質(zhì)纖維化明顯，形成穩(wěn)定的大鼠心肌肥厚模型。

近些年，研究者采用物理的、化學(xué)的及生物學(xué)等多種方法[12-14]制做動(dòng)物心肌肥厚模型。嚴(yán)思敏等[15]利用腹主動(dòng)脈縮窄法制做壓力超負(fù)荷心肌肥厚大鼠模型，分別于術(shù)后2周和4周檢測(cè)心臟指數(shù)、左心室指數(shù)，4周后模型組這兩項(xiàng)指標(biāo)較假手術(shù)組顯著升高；丁同斌等[16]通過腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)制做大鼠心肌肥厚模型，4周后測(cè)定心臟指數(shù)升高，模型組心肌明顯肥厚。這些研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。王婷等[17]采用腹主動(dòng)脈縮窄法制做大鼠壓力超負(fù)荷模型，分別于6周和12周后制作大鼠心肌組織切片，結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，模型組大鼠在第6周出現(xiàn)明顯心肌肥厚，而本實(shí)驗(yàn)是在第4周形成穩(wěn)定的心肌肥厚模型，可能與王婷等[17]研究者沒有設(shè)置4周觀察點(diǎn)有關(guān)，本研究將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中增加6周時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察比較。同時(shí)由于實(shí)驗(yàn)條件所限，本研究沒有采用心臟超聲評(píng)價(jià)心肌肥厚程度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)行改進(jìn)。郭志坤等[18]利用背部皮內(nèi)注射異丙腎上腺素4 mg/（kg·d）制做SD大鼠心肌肥厚模型，注射1、4、8周，測(cè)定大鼠體重、心臟重和左室重；制作心肌組織冷凍切片，利用圖像分析軟件測(cè)定心肌細(xì)胞橫徑和橫截面積，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)心肌組織的Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)。結(jié)果顯示，異丙腎上腺素注射1周后，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯著增多，4周后趨于穩(wěn)定?；瘜W(xué)造模方法簡(jiǎn)單，成功率高，死亡率低，但卻不能完全模擬臨床病理變化過程。黃穎等[19]觀察到8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠SHR血壓升高但沒有出現(xiàn)心肌肥厚，17周齡雄性SHR左心室心肌細(xì)胞肥大，心肌間質(zhì)增多，心臟重、左室重及左心室心肌細(xì)胞橫徑增大。陳柏榮等[20]對(duì)20周齡雄性SHR干預(yù)4周后，通過測(cè)定尾動(dòng)脈血壓、左室質(zhì)量指數(shù)和超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心肌肥厚程度。大量文獻(xiàn)[19-20]研究表明選取SHR制作心肌肥厚模型時(shí)，大鼠需要培育到20周齡左右，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長，成本高。就造模周期而言，本研究選取Wistar大鼠制作心肌肥厚模型較為經(jīng)濟(jì)。

綜上所述，腹主動(dòng)脈部分縮窄術(shù)這種經(jīng)典的造模方法目前使用較廣，是研究心肌肥厚較為理想的模型。

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（收稿日期：2016-12-23 本文編輯：蘇 暢）