郭秋芳 趙康路 郭意男 葉衛(wèi)江?

土茯苓組方對急性肝衰竭大鼠保護作用的實驗研究

郭秋芳 趙康路 郭意男 葉衛(wèi)江?

目的 觀察土茯苓組方對急性肝衰竭（ALF）大鼠Bcl-2和Caspase-3蛋白及細胞炎癥因子表達的影響，驗證其確切療效及防治急性肝衰竭的作用機制。方法 40只Wistar雄性大鼠隨機分為正常組、模型組、土茯苓組及乙酰半胱氨酸組。土茯苓和乙酰半胱氨酸組造模前3d分別予土茯苓水煎液5ml/（kg·d）及乙酰半胱氨酸50mg/（kg·d）灌胃（土茯苓水煎液含生藥濃度2g/ml，乙酰半胱氨酸溶液濃度為1mg/ml），采用D-氨基半乳糖（D-GalN）/內(nèi)毒素脂多糖（LPS）腹腔注射造成大鼠ALF模型。造模6h后，取血檢測血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）含量，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測TNF-α、IL-6、IL-10，并開腹取大鼠肝組織，應用Western Blot實驗方法分別檢測肝組織中Bcl-2和Caspase-3蛋白表達情況。結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達均明顯升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，土茯苓組和乙酰半胱氨酸組血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達顯著下降（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達明顯顯著升高（P＜0.05）；與乙酰半胱氨酸比較，土茯苓組血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達略高（P＞0.05），Bcl-2蛋白表達略低（P＞0.05）。結(jié)論 土茯苓可明顯減輕急性肝衰竭大鼠肝臟損傷，其作用機制可能與上調(diào)Bcl-2蛋白、下調(diào)Caspase-3蛋白，從而抑制細胞凋亡，以及干預促炎因子及抗炎因子有關。

急性肝衰竭 細胞凋亡 炎癥因子 土茯苓 大鼠

急性肝衰竭（ALF）是由多種因素引起的肝臟嚴重損害，未經(jīng)肝臟移植者病死率＞90%［1-3］。肝細胞凋亡的發(fā)生受Fas/FasL、Bcl-2和Caspase-3蛋白家族等多因素的調(diào)節(jié)［4］。另外，促炎因子TNF-α、IL-6及抗炎因子IL-10在肝衰竭中同樣發(fā)揮重要作用［5-6］。臨床研究發(fā)現(xiàn)土茯苓組方可以明顯改善肝衰竭患者的癥狀及預后，但其作用機制尚不明確［7］。2015年5月至2016年6月作者通過實驗研究，觀察土茯苓對急性肝衰竭大鼠Bcl-2和Caspase-3蛋白及細胞炎癥因子表達的影響，探討其防治急性肝衰竭的作用機制，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠40只，體重（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。1.2 試劑和藥品 D-GalN購自美國Sigma公司；LPS購于美國Sigma-Aldrich公司；AST、ALT、TBIL檢測試劑盒、TNF-α、IL-6、IL-10試劑盒、Bcl-2 和Caspase-3試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司；土茯苓組方水煎濃縮含生藥濃度為2g/ml，土茯苓水煎液，置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物分組和給藥 Wistar大鼠40只，采用數(shù)字表法隨機分為正常對照組10只，模型組10只，土茯苓組10只，乙酰半胱氨酸組10只。土茯苓組大鼠造模前3d予土茯苓水煎液5ml/（kg·d）灌胃，乙酰半胱氨酸組造模前3d予乙酰半胱氨酸50mg/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予等量生理鹽水，1次/d。

1.4 造模方法 末次給藥1h后，模型組、土茯苓組及乙酰半胱氨酸組均予D-氨基半乳糖（D-GalN）

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比較 與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT和TBIL含量明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比較，土茯苓組和乙酰半胱氨酸組大鼠血清AST、ALT和TBIL含量均明顯下降（均P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比較（x±s）

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比較 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，土茯苓組和乙酰半胱氨酸組大鼠TNF-α、IL-6、IL-10均值均明顯降低，但土茯苓組與模型組大鼠TNF-α差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），余均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比較（x±s）

2.3 各組大鼠肝組織Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的比較 與正常組比較，模型組大鼠肝組織Bcl-2蛋白表達明顯下降，Caspase-3蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，土茯苓組和乙酰半胱氨酸組Caspase-3蛋白表達均明顯下調(diào)，Bcl-2蛋白表達明顯上調(diào)（均P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠肝組織Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的比較

3 討論

研究表明，肝細胞凋亡在肝衰竭過程中發(fā)揮著重要作用，是肝衰竭過程中重要環(huán)節(jié)［8］，抑制肝細胞凋亡成為防治急性肝衰竭的重方法之一，同時強調(diào)細胞因子在ALF病理過程中的作用［9］，檢測其血清水平有助于判斷疾病嚴重程度及預后轉(zhuǎn)歸。Caspase是一組天門冬氨酸特異性的半胱酸蛋白酶，其活化是細胞凋亡的最終執(zhí)行，在凋亡級聯(lián)激活中處于核心地位［10］。而Caspase-3的激活在肝細胞凋亡中起重要作用，Bcl-2可通過抑制Caspase-3的活性抑制細胞凋亡［11］。TNF-α、IL-6、 IL-10是ALF發(fā)病過程由肝臟內(nèi)外的單核-巨釋系統(tǒng)釋放的細胞因子。其中TNF-α、IL-6可激活炎癥級聯(lián)反應，介導細胞損傷，是肝細胞急性炎癥反應的主要參與者，能較好的反映急性肝損傷的程度，而IL-10具有較強的抗炎及免疫抑制活性，在ALF中起著一定的保護作用［12］。D-GalN聯(lián)合LPS腹腔注射造成大鼠急性肝衰竭模型被國內(nèi)外學者普遍認可及使用，造模6h后可見大量肝細胞凋亡，與臨床急性肝衰竭的發(fā)生機制相似，是研究急性肝衰竭細胞凋亡機制及細胞因子產(chǎn)生較理想模型［13］。

中醫(yī)無ALF的類似病名，根據(jù)身黃目黃伴神志昏蒙的癥狀，多納入“急黃”、“瘟黃”、“疫黃”及“肝厥”等范疇，對于肝衰竭病因的探討主要集中在毒、濕、熱、瘀、虛，病位于肝，橫連于膽，克伐脾胃，對于病機，急性和亞急性肝衰竭主要是疫毒熾盛、熱入營血、上擾心神，慢加急性肝衰竭主要為濕熱內(nèi)蘊、脾氣虧虛、氣虛血瘀［14］；治療上以清熱、祛濕、解毒、開竅、健脾為普遍共識［15］。土茯苓組方（以土茯苓和玄參均100g以上為君藥的中藥組方）具有“祛濕通腑，排毒清肝”的功效。其中土茯苓主要功效為清熱利濕、解毒鎮(zhèn)痛，可選擇性地抑制細胞免疫［16］，玄參為“清熱解毒”常用藥，可明顯抑制肝細胞凋亡，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Fas/FasL表達［17］。

本資料結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠血清Caspase-3蛋白表達均明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯下降，表明Bcl-2蛋白表達與肝細胞凋亡呈負相關，Caspase-3蛋白表達與肝細胞凋亡呈正相關。土茯苓組AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達顯著下降，Bcl-2蛋白表達明顯顯著升高，提示土茯苓組方可減輕急性肝衰竭大鼠肝損害及抑制細胞凋亡，其機制可能與上調(diào)Bcl-2蛋白表達和下調(diào)Caspase-3蛋白表達有關。與乙酰半胱氨酸比較，土茯苓組血清AST、ALT、TBIL、TNF-α、IL-6、IL-10含量和Caspase-3蛋白表達略高（P＞0.05），Bcl-2蛋白表達略低（P＞0.05），進一步證實土茯苓組方可減輕急性肝衰竭大鼠肝損害及抑制細胞凋亡。

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Objective To observer the effects of smilax prescription on expressions of Bcl-2，Caspase-3 and cytokines in rats with acute liver failure and to verify its exact effect and the possible mechanism. Methods Forty Wistar rats were divided into normal group，model group，smilax prescription group and acetylcysteine group. The smilax prescription group was given smilax prescription solution 10mg/（kg·d），the acetylcysteine group was given acetylcysteine 50mg/（kg·d），and 3 days consecutively. 1 hour after the last time，the acute liver failure model was reproduced in rats by peritoneal injection of D-Galactosamine（D-GalN）and lipopolysaccharide（LPS）. After 6 hours，the liver tissue of rats were taken out for Western Blot assay of Bcl-2 and Caspase-3 protein expressions，and TNF-α，IL-6，IL-10 in serum were detected by immunohistochemistry. Result Compared with the normal group，Bcl-2 protein expressions were signif i cantly decreased in the liver tissue of model group，and Caspase-3 protein expressions were significantly increased，the TNF-α、IL-6、IL-10 in serum were same to（P＜0.05）. Compared with the model group，Caspase-3 protein expressions and TNF-α，IL-6，IL-10 in the group of smilax prescription and acetylcysteine were signif i cantly down-regulated，while Bcl-2 protein expressions were signif i cantly up-regulated（P＜0.05）. Compared with the acetylcysteine group，Caspase-3 protein expressions and TNF-α，IL-6，IL-10 in the group of smilax prescription were slightly up-regulated，Bcl-2 protein expressions were slightly down-regulated（P＞0.05）.Conclusion Smilax prescription has protective effect on the apoptosis of rats with acute liver failure，and its possible mechanism may be related to up-regulated of Bcl-2 protein expressions，downregulated of Caspase-3 protein expressions to and intervention proinf l ammatory cytokines and anti-inf l ammatory cytokines.

Acute liver failure Apoptosis Smilax prescription Inf l ammatory cytokines Rat

310053 浙江中醫(yī)藥大學（郭秋芳 郭意男）322000 浙江大學醫(yī)學院附屬第四醫(yī)院（趙康路）310018 浙江省中醫(yī)院（葉衛(wèi)江）

*通信作者800mg/kg，肉毒素脂多糖（LPS）10μg/kg腹腔注射，一次性造成大鼠ALF模型。

1.5 標本采集 造模6h后，所有大鼠10%水合氯醛3.0ml/kg腹腔注射麻醉，迅速心臟采血。采血后立即處死大鼠，沿腹中線剪開取大鼠肝左葉相同部位組織，部分用等滲冰生理鹽水沖洗后錫紙包裹放入-80℃冰箱中保存，以便制備肝組織均漿；部分用10%福爾馬林溶液固定后進行石蠟包埋、切片。

1.6 標本檢測 （1）血清生化指標及促炎因子：心臟采血2ml，離心取血清，采用全自動生化分析儀器檢測血清AST、ALT和TBIL含量；采用ELISA法檢測檢測TNF-α、IL-6、IL-10含量，操作步驟按試劑盒說明。（2）肝組織Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的檢測：肝臟組織冰上降溫，均漿器制備，離心取上清液，采用Western Blot實驗方法提取Bcl-2和Caspase-3蛋白，操作步驟按試劑盒說明。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。