吳艷芝 鄧文靜 喬 芳 徐國(guó)衛(wèi) 李海靜 滕軍放(通訊作者)

1)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450042 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

腺苷A1受體對(duì)杏仁核點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷作用機(jī)制

吳艷芝1)鄧文靜2)喬 芳1)徐國(guó)衛(wèi)1)李海靜1)滕軍放2)(通訊作者)

1)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450042 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

目的 探討腺苷A1受體活性對(duì)點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的作用。方法 選擇84只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為正常組、致癇組、致癇+腺苷A1R拮抗劑(8-環(huán)戊-1，3-二丙基黃嘌呤，DPCPX)組、致癇+腺苷A1R激動(dòng)劑(2-氯化腺苷，2-CADO)組，每組21只。致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組采用電刺激點(diǎn)燃癲癇模型。正常組未進(jìn)行手術(shù)和電刺激致癇等處理；致癇組癲癇模型建立成功前后未注射任何藥物；致癇+DPCPX組大鼠癲癇模型建立成功前1 h和成功后1 h尾部靜脈注射0.3 mg/kg DPCPX；致癇+2-CADO組大鼠癲癇模型成功前1 h和成功后1 h尾部靜脈注射0.6 mg/kg 2-CADO。采用蘇木精-伊紅染色法和TUNEL神經(jīng)元凋亡測(cè)定法觀察各組在癲癇模型建立成功后1 d、15 d、30 d時(shí)的海馬CA3區(qū)組織學(xué)病理變化及神經(jīng)元凋亡指數(shù)(AI)變化情況。結(jié)果 致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組動(dòng)物在點(diǎn)燃癲癇后1 d、15 d、30 d均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元細(xì)胞排列松散無(wú)規(guī)則，輪廓模糊，邊緣欠清晰，胞核萎縮，胞漿空泡等神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損害；相同時(shí)間點(diǎn)，致癇+DPCPX組的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損害程度較致癇組加重，致癇+2-CADO組較致癇組減輕。正常組在不同時(shí)間點(diǎn)的AI變化不明顯(P>0.05)，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組的AI隨著癲癇發(fā)作時(shí)間的延長(zhǎng)，AI逐漸增加(P<0.05)；在相同時(shí)間點(diǎn)，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組的AI均明顯高于正常組(P<0.05)，致癇+DPCPX組的AI均明顯高于致癇組(P<0.05)；致癇+2-CADO組的AI明顯低于致癇組和致癇+DPCPX組(P<0.05)。結(jié)論 癲癇發(fā)作會(huì)引起神經(jīng)元損傷和凋亡，其可能與腺苷A1R活性降低，興奮性氨基酸谷氨酸濃度增加有關(guān)，谷氨酸興奮性增加可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，這可能是癲癇發(fā)作后神經(jīng)元損傷的機(jī)制之一。

腺苷A1受體；癲癇；海馬神經(jīng)元

細(xì)胞凋亡是指有核細(xì)胞在某些生理性或病理性因子刺激后，其表面分子結(jié)構(gòu)作出應(yīng)答反應(yīng)，并將信號(hào)傳入胞內(nèi)，激活胞內(nèi)分子機(jī)制，誘發(fā)細(xì)胞死亡的過(guò)程。有研究報(bào)道，癲癇發(fā)作會(huì)影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和細(xì)胞跨膜信息的傳遞，致使神經(jīng)元受損甚至凋亡，最終導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞增生、突觸重建等腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性改變，這種改變會(huì)使癲癇反復(fù)性發(fā)作[1]。故癲癇繼發(fā)性腦損傷的機(jī)制和保護(hù)措施是近年來(lái)難治性癲癇研究的熱點(diǎn)。

腺苷系統(tǒng)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制性保護(hù)作用，其機(jī)制主要是結(jié)合腺苷A1受體(A1R)發(fā)揮作用。大量的研究表明，腺苷A1R對(duì)各種中樞性神經(jīng)系統(tǒng)疾病所致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用[2]，但其對(duì)杏仁核點(diǎn)燃癲癇大鼠各個(gè)時(shí)間段海馬神經(jīng)元的病理組織學(xué)和凋亡的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討腺苷A1R與模型海馬神經(jīng)元損傷的關(guān)系，了解其對(duì)腦神經(jīng)的保護(hù)作用，從而能更深刻地理解腺苷A1R與癲癇的關(guān)系，為癲癇的治療提供參考。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠(200～250 g)84只，均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心，動(dòng)物飼養(yǎng)條件：晝夜交替12 h光照，避噪聲，單籠飼養(yǎng)，溫度18～25 ℃，相對(duì)濕度45%～70%。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為正常組、致癇組、致癇+腺苷A1R拮抗劑(8-環(huán)戊-1，3-二丙基黃嘌呤，DPCPX)組、致癇+腺苷A1R激動(dòng)劑(2-氯化腺苷，2-CADO)組，每組21只。選取點(diǎn)燃癲癇模型成功后的1 d、15 d、30 d作為觀察時(shí)間點(diǎn)，各時(shí)間點(diǎn)選7只大鼠。

1．2 點(diǎn)燃癲癇模型的建立

1．2．1 五芯電極的制作：材料：尖頭鉗、鑷子、剪刀、刀片、電烙鐵、捍錫、松香、打火機(jī)、直徑0.19 mm鎳鉻絲、傳感接頭、微型螺絲(均為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi))；登士柏牙托水、仿生型牙托粉(均購(gòu)自鄭州凱斯特醫(yī)療器械有限公司)、6%水合氯醛(水合氯酸粉劑配制成溶液，并用過(guò)濾器過(guò)濾無(wú)菌)。制作方法：①取鎳鉻絲，剪取長(zhǎng)5 cm 3根，長(zhǎng)3.5 cm 2根；②用打火機(jī)將5根剪裁好的鎳鉻絲兩頭燒紅變黑，用刀片將外面的鍍層去掉；③拔出傳感接頭上的塑料接頭，并在凹槽處依次標(biāo)記1～5；④將去掉鍍層的鎳鉻絲固定在塑料接頭上，標(biāo)記1、4、5位置固定5 cm的鎳鉻絲，標(biāo)記2、3位置固定3.5 cm鎳鉻絲，并用電烙鐵及焊錫加固；⑤將2根3.5 cm鎳鉻絲相互扭轉(zhuǎn)成一直線，并垂直于塑料接頭，尾端位置分叉，但間隙<1 mm；⑥將3根5 cm鎳絡(luò)絲末端擰上螺絲，避免松動(dòng)；⑦調(diào)整牙托粉和牙托水比例，確保電極及塑料接頭固定良好。

1．2．2 手術(shù)及電極植入：動(dòng)物麻醉：取6%水合氯醛麻醉，對(duì)致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠采用腹腔注射方式，每100 g注射量為0.5 mL。用手術(shù)鉗夾大鼠尾巴，其無(wú)反應(yīng)即可判斷麻醉成功，若麻醉不成功，可增加0.3 mL，增加次數(shù)須≤2次。電極植入：①剪去大鼠顱頂部手術(shù)區(qū)被毛，并固定于離體定位儀上，保持頭正中位，其門(mén)牙置于定位儀牙槽孔內(nèi)；常規(guī)消毒模型顱頂部手術(shù)區(qū)皮膚，行一1.5～2 cm的切口，充分顯露術(shù)野。②將已消毒的電極固定在夾持器上，將3、4位置兩根互相擰成直線的鎳絡(luò)絲做成的扎入電極與地面垂直；③調(diào)整三維坐標(biāo)軸，調(diào)整扎入電極尖端定位于前囟點(diǎn)，記錄三維坐標(biāo)刻度值(X/Y/Z)；④參照大鼠腦立體定位圖譜，用牙科鉆在已定位的右側(cè)杏仁外側(cè)核處(BLA)鉆孔，盡可能不傷及腦膜；⑤植入扎入電極約8.5 mm，用牙托粉和牙托水固定電極在入顱處；⑥在1、 2位置的兩個(gè)螺絲固定在前囟點(diǎn)左右作記錄電極，5位置螺絲固定在人字縫后方為參考電極；調(diào)整塑料電極頭使其凹槽處于前方，將電極、微型螺絲、塑料接頭均固定在顱骨表面；⑦將大鼠從立體定位儀上取下，放回籠中。術(shù)后觀察：術(shù)后7 d內(nèi)，每天抓取測(cè)量其體質(zhì)量，自由進(jìn)食水和食物。

1．2．3 模型點(diǎn)燃：①術(shù)后第8天開(kāi)始，所有大鼠接受電刺激，采用BL-420F生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，通道1和通道2設(shè)置為腦電信號(hào)，采用細(xì)電流連續(xù)串刺激模式，電流強(qiáng)度500 mA，延時(shí)100 ms，波寬1 ms，頻率50 Hz，串長(zhǎng)100，每天刺激1次。刺激前后記錄杏仁核后放電及大鼠行為學(xué)變化。②根據(jù)國(guó)際通用的癲癇發(fā)作Racine分級(jí)：0級(jí)：無(wú)行為學(xué)改變；1級(jí)：濕狗樣震顫；2級(jí)：點(diǎn)頭及阻嚼動(dòng)作；3級(jí)：前肢單肢陣攣，未直立；4級(jí)：雙前肢陣攣伴身體直立；5級(jí)：強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴隨直立并背部倒地。大鼠連續(xù)10 d達(dá)到5級(jí)發(fā)作視為模型成功。

1．3 各組的處理方法 正常組未進(jìn)行手術(shù)和電刺激致癇等處理；致癇組大鼠癲癇模型建立成功后未注射任何藥物；致癇+DPCPX組大鼠癲癇模型建立成功前1 h和成功后1 h尾部靜脈注射0.3 mg/kg DPCPX；致癇+2-CADO組大鼠癲癇模型成功前1 h和成功后1 h尾部靜脈注射0.6 mg/kg 2-CADO。其中2-CADO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司、DPCPX購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1．4 石蠟切片制作、HE染色及TUNEL神經(jīng)元凋亡測(cè)定

1．4．1 標(biāo)本采集及石蠟切片制作：取6%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，并將其仰臥固定于解剖板上，從劍突處開(kāi)胸，顯露心臟，用穿刺針摻入心尖部并固定在左心室位置，再在動(dòng)物心臟右心耳剪一小口放血，進(jìn)行主動(dòng)脈灌流，迅速注入生理鹽水100 mL，再灌注200 mL含4%多聚甲醛的緩沖液，切斷動(dòng)物頭部，取出腦組織，4%多聚甲醛固定。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。將模具放在冰上10 min后，將蠟塊取出，置于4 ℃冰箱保存。

1．4．2 HE染色：按照蘇木精-伊紅染色法的步驟操作，其中蘇木素購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司，無(wú)水乙醇購(gòu)自石家莊瑞興化工有限公司，二甲苯購(gòu)自石家莊瑞興化工有限公司，中性樹(shù)膠購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，依次二甲苯脫蠟、酒精浸泡、蘇木素染色、脫水、返藍(lán)、沖洗、伊紅染色、透明、封片。每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行海馬組織切片，隨機(jī)取5個(gè)400倍光鏡視野，計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)，取平均值作為最后結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1．4．3 TUNEL神經(jīng)元凋亡測(cè)定：采用TUNEL法對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行測(cè)定，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京世聯(lián)搏研科技有限公司，首先對(duì)切片脫蠟，滴加蛋白酸K工作液，20～37 ℃作用20～30 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，加50 μL TdT 酶反應(yīng)液，37 ℃避光培育 1 h，加50 mL Strep-tavidin-HRP工作液37 ℃避光培育30 min，以上5個(gè)程序過(guò)后均用PBS洗滌3～5次，5 min/次，然后進(jìn)行顯色、返藍(lán)、脫水、透明、封片，在顯微鏡觀察獲得圖像。神經(jīng)元凋亡細(xì)胞經(jīng)TUNEL染色后細(xì)胞核呈棕色或棕褐色。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)是指每個(gè)視野神經(jīng)元細(xì)胞凋亡細(xì)胞總數(shù)除以每個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)。

2 結(jié)果

2．1 杏仁核點(diǎn)燃大鼠癲癇模型的行為學(xué)及腦電特征觀察 致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠隨著電刺激次數(shù)的增加，杏仁核后放電逐漸升高，電刺激第10天時(shí)達(dá)到穩(wěn)定5級(jí)發(fā)作(圖1)。致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠腦電波在點(diǎn)燃前(未到達(dá)5級(jí)發(fā)作時(shí))未見(jiàn)癇樣放電(圖2)，點(diǎn)燃后模型癲癇發(fā)作時(shí)可見(jiàn)大量高幅棘波發(fā)放，腦電基本頻率正常(圖3)。

圖1 刺激時(shí)間與ADD的關(guān)系

圖2 點(diǎn)燃前腦電圖表現(xiàn)

圖3 點(diǎn)燃后腦電圖表現(xiàn)

2．2 腺苷A1R對(duì)點(diǎn)燃癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷的神經(jīng)保護(hù)作用 4組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷病理組織學(xué)變化情況對(duì)比：(1)正常組1 d、15 d及30 d時(shí)動(dòng)物模型海馬CA3區(qū)HE染色情況見(jiàn)圖4，神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，輪廓清晰，胞核呈圓形或橢圓形，胞漿透明，結(jié)構(gòu)完整。(2)致癇組點(diǎn)燃癲癇后1 d、15 d及30 d時(shí)動(dòng)物模型海馬CA3區(qū)HE染色情況見(jiàn)圖5，點(diǎn)燃癲癇后1 d神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，排列欠整齊，少量神經(jīng)細(xì)胞腫脹、形態(tài)不完整；15 d、30 d時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞排列松散無(wú)規(guī)則，輪廓模糊，邊緣欠清晰，胞核萎縮，胞漿空泡，出現(xiàn)明顯神經(jīng)元變性，死亡等不同程度的結(jié)構(gòu)損害。(3)致癇+DPCPX組點(diǎn)燃癲癇后1 d、15 d及30 d時(shí)動(dòng)物模型海馬CA3區(qū)HE染色情況見(jiàn)圖6，與致癇組相比，相同時(shí)間點(diǎn)致癇+DPCPX組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列更加紊亂，細(xì)胞水腫、胞漿空泡、神經(jīng)元變性壞死等結(jié)構(gòu)損害程度加重。(4)致癇+2-CADO組點(diǎn)燃癲癇后1 d、15 d及30 d時(shí)動(dòng)物模型海馬CA3區(qū)HE染色情況見(jiàn)圖7，與致癇組相比，相同時(shí)間點(diǎn)致癇+2-CADO組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列基本規(guī)整有序，細(xì)胞水腫、胞漿空泡、神經(jīng)元變性壞死等結(jié)構(gòu)損害程度減輕。

1 d 15 d 30 d圖4 正常組大鼠海馬CA3區(qū)1 d、15 d及30 d時(shí)神經(jīng)元HE染色

1 d 15 d 30 d圖5 致癇組點(diǎn)燃癲癇后大鼠海馬CA3區(qū)1 d、15 d及30 d時(shí)神經(jīng)元HE染色

1 d 15 d 30 d圖6 致癇+DPCPX組點(diǎn)燃癲癇后大鼠海馬CA3區(qū)1 d、15 d及30 d時(shí)神經(jīng)元HE染色

1 d 15 d 30 d圖7 致癇+2-CADO組點(diǎn)燃癲癇后大鼠海馬CA3區(qū)1 d、15 d及30 d時(shí)神經(jīng)元HE染色

2．3 4組點(diǎn)燃癲癇后1 d、15 d、30 d海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)(AI)比較情況 正常組在不同時(shí)間點(diǎn)的AI變化不明顯(P>0.05)，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組的AI隨著癲癇發(fā)作時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡指數(shù)逐漸增加(P<0.05)；在相同時(shí)間點(diǎn)，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組的AI均明顯高于正常組(P<0.05)，致癇+DPCPX組的AI均明顯高于致癇組(P<0.05)；致癇+2-CADO組的AI明顯低于致癇組和致癇+DPCPX組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組點(diǎn)燃癲癇后1 d、15 d、30 d海馬CA3區(qū)神經(jīng)元 凋亡指數(shù)(AI)比較情況

注：與正常組比較，aP<0.05；與致癇組比較，bP<0.05；與致癇+DPCPX組比較，cP<0.05

3 討論

癲癇的發(fā)生與多種因素相關(guān)，為了闡明其發(fā)病機(jī)制，癲癇模型的建立起著重要作用。目前，癲癇模型有化學(xué)試劑誘導(dǎo)癲癇模型和電剌激癲癇模型等[3]。電刺激癲癇模型最早由Goddard于1967年提出，這種模型具有以下優(yōu)勢(shì)[4]：(1)動(dòng)物癲癇發(fā)作與腦電圖癇樣放電同步；(2)每天采用低強(qiáng)度電刺激對(duì)腦組織的損傷作用較弱；(3)模型點(diǎn)燃成功后，其自發(fā)性癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間可達(dá)12個(gè)月以上。研究表明，電刺激癲癇模型，在點(diǎn)燃癲癇過(guò)程中并未出現(xiàn)神經(jīng)元缺失和腦組織結(jié)構(gòu)損害[5]。Pak等[6]采用定量體視學(xué)技術(shù)對(duì)電刺激癲癇模型進(jìn)行神經(jīng)元損傷進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)大鼠出現(xiàn)5級(jí)發(fā)作3次后其海馬神經(jīng)元出現(xiàn)部分缺失，隨著5級(jí)發(fā)作次數(shù)的增多，神經(jīng)元缺失逐漸加重。

研究報(bào)道，點(diǎn)燃癲癇發(fā)作可損害海馬，引起海馬神經(jīng)元損傷和凋亡[7-8]。本實(shí)驗(yàn)中，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠經(jīng)過(guò)10次5級(jí)發(fā)作后HE染色可見(jiàn)，與正常組相比，其海馬CA3區(qū)均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元缺失；正常組動(dòng)物海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，輪廓清晰，胞核呈圓形或橢圓形，胞漿透明，結(jié)構(gòu)完整；致癇組動(dòng)物在癲癇發(fā)作第1天時(shí)海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，排列欠規(guī)則，部分細(xì)胞腫脹，癲癇發(fā)作15 d、30 d時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞松散無(wú)序，邊緣模糊，胞核萎縮，胞漿空泡，細(xì)胞間距增大，出現(xiàn)明顯神經(jīng)元變性、壞死，這一結(jié)果提示癲癇發(fā)作會(huì)引起海馬神經(jīng)元損傷；在同一時(shí)間點(diǎn)，致癇+DPCPX組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列更加松散無(wú)序，細(xì)胞水腫、胞漿空泡更加嚴(yán)重，神經(jīng)元變性壞死等結(jié)構(gòu)損害程度較致癇組加重；而與致癇組相比，致癇+2-CADO組海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列較規(guī)整，細(xì)胞水腫、胞漿空泡、神經(jīng)元變性壞死等結(jié)構(gòu)損害均減輕；這提示腺苷A1R活性增強(qiáng)會(huì)減輕海馬神經(jīng)損傷，故提高腺苷A1R活性對(duì)癲癇發(fā)作引起的海馬損傷具有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL神經(jīng)元凋亡測(cè)定不同腺苷A1R活性狀態(tài)下癲癇大鼠模型的海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)，發(fā)現(xiàn)在相同時(shí)間點(diǎn)，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)均明顯高于正常組，說(shuō)明癲癇發(fā)作可誘發(fā)神經(jīng)元死亡；致癇+DPCPX組動(dòng)物的神經(jīng)元凋亡指數(shù)較致癇組顯著增高，提示腺苷A1R活性的降低會(huì)加劇海馬神經(jīng)元的凋亡；致癇+2-CADO組的神經(jīng)元凋亡指數(shù)較致癇組降低，提示腺苷A1R活性的增加會(huì)阻止海馬神經(jīng)元的凋亡，這與上述HE染色發(fā)現(xiàn)的海馬組織學(xué)病理變化相一致，從而證實(shí)了腺苷A1R參與了癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元損傷過(guò)程中對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用，且可抵抗神經(jīng)元調(diào)亡。

綜上所述，癲癇發(fā)作會(huì)引起神經(jīng)元損傷和凋亡，其可能與腺苷A1R活性降低、興奮性氨基酸谷氨酸濃度增加有關(guān)，谷氨酸興奮性增加可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，這可能是癲癇發(fā)作后神經(jīng)元損傷的機(jī)制之一。因此，通過(guò)增加腺苷A1R活性可保護(hù)神經(jīng)元，降低其損傷，可能是終止癲癇發(fā)作的一個(gè)治療方向。

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(收稿2016-11-10)

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