邱美華 盛云峰 崔巖飛 鮑志堅 楊盛婭

白介素-17基因多態(tài)性與肺結核易感性的相關性研究

邱美華 盛云峰 崔巖飛 鮑志堅 楊盛婭

肺結核；白介素-17；基因多態(tài)性；易感性

肺結核是全球死亡率最高的傳染病，全球大約1/3人口感染過結核分枝桿菌（MTB），然而感染者中大約僅有5%～10%發(fā)展為臨床肺結核[1]。由此認為個體在結核分枝桿菌易感性方面存在差異。結核易感性與遺傳、年齡、性別、環(huán)境、營養(yǎng)、吸煙、卡介苗（BCG）接種等高危因素有關。其中遺傳因素是影響結核易感性的重要因素，可以影響宿主與MTB間的平衡關系，導致不同的感染結局[2]。此前國內研究報道HLACw、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型（PTPN22）、白介素（IL）-22等基因多態(tài)性與肺結核易感性存在一定相關性[3-5]。IL-17主要來源于Th17細胞，近年研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在防御MTB方面發(fā)揮重要作用[6]。國內較少有關IL-17基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與肺結核易感性的研究報道。本文著重探討IL-17基因多態(tài)性與肺結核發(fā)病之間的關系，并初步探討IL-17在肺結核發(fā)病中的免疫調節(jié)作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2012年10月—2015年10月在浙江省結核病診療中心就診的肺結核患者（病例組）100例，男61例，女39例，平均年齡（42.8±12.1）歲，平均病程3.8個月。對照組為同期在我院健康體檢者100名，男58名，女42名，平均年齡（43.6±11.8）歲。兩組研究對象的年齡（t=0.473，P=0.636）和性別構成（χ2=0.187，P=0.666）差異均無統(tǒng)計學意義。肺結核診斷標準：中華醫(yī)學會結核病學分會制定的《肺結核診斷和治療指南》關于肺結核的診斷標準[7]，并排除結核性胸膜炎和肺外結核。對照組入組標準：無肺結核臨床表現(xiàn)，無胸部影像學檢查異常。兩組研究對象均為漢族，無合并其他傳染病、慢性病、腫瘤和自身免疫性疾病。所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法通過發(fā)放問卷調查表獲得研究對象的發(fā)病危險因素，問卷調查內容包括：性別、年齡、吸煙史、飲酒史、居住地、肺結核患者接觸史、肺結核疾病家族史、卡介苗接種史等。肺結核患者根據(jù)《肺結核診斷和治療指南》[7]予以“2個月異煙肼-利福平-乙胺丁醇-吡嗪酰胺/4個月異煙肼-利福平-乙胺丁醇”的初治方案。

1.2.1 抽提外周血DNA抽取兩組肘靜脈血液10 mL置于EDTA抗凝靜脈管中，并放置于-80℃冰箱內備用。采用GenEluteTM Blood Genomic DNA Kit（SIGMA，NA2010-1KT）試劑盒，根據(jù)說明書抽提基因組DNA，提取完成的DNA按體積比1：10以TE緩沖液稀釋后作為工作濃度存放于-20℃冰箱備用。

1.2.2 基因多態(tài)性分析PCR反應引物利用Primer Premier 5軟件設計，由上海Invitrogen生物公司合成。IL-17F位點rs763780C/T所用引物為：FP：GCTGAGTGGATATGCACCTCTT，RP：GTTGGAGAAG GTGCTGGTGA，探針為：P-C：FAM-CATCCACCGTG TGCA-MGB，P-T：VIC-CATCCACCATGTGCA-MGB。IL-17A位點rs2275913G/A所用引物為：FP：TAGGA ACATGAATTTCTGCCCT，RP：TCAGGGGTGACACCA TTTTG，探針為：P-G：FAM-TCCTTCAGAAGGAGA G-MGB，P-A：VIC-TCCTTCAGAAGAAGAG-MGB。TaqMan PCR體系為（20μL）：DNA模版1μL、濃度500nmol/L的上下游引物各1μL、DNA酶-free水 6μL、1X qPCR master Mix 10μL，TaqMan探針T/A（250nM）0.5μl，TaqMan探針C/G（250nM）0.5μL（Huirui Biotechnology Co，Ltd，上海，中國）。PCR反應條件為：95℃預變性5min，進入循環(huán)后，95℃變性10s加上60℃退火45s，共40個循環(huán)。DNA酶-free水作為陰性對照。每個樣本做3個重復。

1.2.3 lL-17檢測采用ELISA方法測定，嚴格按照試劑盒說明書操作，以標準品濃度作橫坐標，OD450作縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)樣品的OD450值在標準曲線圖上查出相應樣本的濃度。對每個樣本做3個復孔，取其平均值。分別測定對照組、病例組治療前和治療后6個月的IL-17水平。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組間SNP位點等位基因、基因型頻率比較均采用χ2檢驗，對SNP位點基因型進行Hardy— Weinberg遺傳平衡檢驗。計量資料以表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗。對肺結核發(fā)病危險因素進行Logistic多因素回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 危險因素與肺結核發(fā)病間的多因素分析經(jīng)調查發(fā)現(xiàn)，肺結核家族史、結核接觸史及卡介苗接種史是肺結核患者發(fā)病高危因素（P<0.05），見表1。

表1 危險因素與肺結核發(fā)病的分析（例）

2.2 兩組研究對象IL-17 SNPs等位基因頻率與基因型分布兩組基因型和等位基因的分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P>0.05）。rs763780的T等位基因頻率與C等位基因比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.996，P<0.05）；見表2。兩組rs2275913和rs763780基因型和等位基因分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。

表2 兩組研究對象IL-17 SNPs等位基因頻率[例（%）]

表3 兩組研究對象IL-17 SNPs基因型分布[例（%）]

2.3 兩組研究對象IL-17比較病例組（未治療）血清IL-17水平與對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。抗結核治療6個月后，病例組IL-17水平明顯下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表4。

表4 兩組研究對象IL-17比較（pg/mL）

3 討論

肺結核主要與細胞免疫有關，當MTB侵入機體后，抗原遞呈細胞通過分泌多種細胞因子（包括TNF-α、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22等）調節(jié)巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞等炎性細胞，組成一個復雜的免疫網(wǎng)絡，限制和清除MTB。其中IL-17是由Th17細胞分泌的特征性細胞因子，其中IL-17A、IL-17F是其中重要的組成部分，可參與誘導、調節(jié)局部組織慢性炎癥反應[8]。但IL-17啟動子區(qū)基因多態(tài)性與肺結核間是否具有緊密聯(lián)系，同時是否通過IL-17表達來影響肺結核發(fā)生及治療等均不完全清楚。本研究中，兩組的基本臨床資料無明顯差異，對其環(huán)境因素進行分析后發(fā)現(xiàn)，肺結核家族史、接觸史及卡介苗接種史是肺結核發(fā)病的影響因素，其中肺結核家族史可能與肺結核遺傳易感性相關。

IL-17A rs2275913位點和IL-17F rs763780位點是目前研究IL-17最多的兩個SNP位點，因SNPs基因型受種族和地區(qū)等多種因素影響，所以本次研究均選擇浙江省漢族人群實施研究。本研究發(fā)現(xiàn)rs2275913和rs763780的基因型與肺結核發(fā)病風險無明顯相關性，本研究與Abhimanyu等[9]的結果相一致。但據(jù)其他文獻報道，西班牙人群中IL-17 rs2275913的GG基因型與肺結核高風險存在相關性[10]，Jin等[11]也發(fā)現(xiàn)rs763780的CC基因型增加肺結核發(fā)病的風險。本研究結果顯示，rs763780位點等位基因T顯著高于等位基因C（P<0.05），提示rs763780的等位基因T可能是肺結核發(fā)病的易感基因，增加肺結核發(fā)病風險，與Peng等[12]的研究結果相一致。

IL-17通過CXCL9/10趨化中性粒細胞向感染病灶的部位聚集，并參與結核肉芽腫的形成，還可誘導巨噬細胞吞噬MTB，起到保護作用[13]。本研究顯示治療前病例組IL-17水平顯著高于對照組，表明在MTB負荷下，機體Th17細胞分泌大量IL-17，結果與Cowan等[14]的研究相一致。而治療6個月后IL-17水平顯著降低，說明隨著細菌負荷量的下降，Th17細胞的刺激因素減少，IL-17分泌減少。由此可以推測IL-17可能成為肺結核療效觀察和預后判斷的參考指標。

綜上所述，IL-17基因多態(tài)性在不同地區(qū)、種族中存在不同研究結果。本研究雖得出一定研究數(shù)據(jù)，也可為肺結核疾病防治提供重要參考，但仍存在不足，如研究樣本數(shù)量小，不足以代表整個漢族人群，所以尚需擴大研究樣本。此外，此次研究的基因位點較少，還需增加基因位點以更深入研究，提高研究結果的可靠性。

［1］World Health Organization（WHO）（2015）.Global Tuberculosis Report 2015.WHO/HTM/TB/2015［R］.Geneva.

［2］M觟ller M，Hoal EG.Current findings，challenges and novel approaches in human genetic susceptibility to tuberculosis［J］.Tuberculosis（Edinb），2010，90（2）：71-83.

［3］張念榮，范剛，鄧云峰，等.HLA-Cw基因多態(tài)性與肺結核易感性關系的初步研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2012，35（2）：120-124.

［4］石學香，楊本付，王忠東，等.PTPN22基因多態(tài)性與肺結核易感性關系的病例對照研究［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2014，34（12）：908-912.

［5］丁光貴，張國良，陳心春，等.白細胞介素IL-22基因單核苷酸多態(tài)性與肺結核易感性的相關性研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2012，35（8）：596-600.

［6］Scriba TJ，Kalsdorf B，Abrahams DA，et al.Distinct，specific IL-17 and IL-22-producing CD4+T cell subsets contribute to the human anti-mycobacterial immune response［J］. J Immunol，2008，180（3）：1962-1970.

［7］中華醫(yī)學會結核病學分會.肺結核診斷和治療指南［J］.中華結核和呼吸雜志，2001，24（2）：5-9.

［8］Mills KH.Induction，function and regulation of IL-17 producing T cells［J］.Eur J Immunol，2008，38（10）：2636-2649

［9］Abhimany U，Mangangcha IR，Jha P et al.Differential serum cytokine levels are associated with cytokine gene polymorphisms in north Indians with active pulmonary tuberculosis［J］.Infect.Genet.Evol，2011，11（5）：1015-1022.

［10］Ocejo-Vinyals JG，de Mateo EP，Hoz MA et al.The IL-17 G-152A single nucleotide polymorphism is associated with pulmonary tuberculosis in northern Spain［J］.Cytokine，2013，64（1）：58-61.

［11］Jin Du，Jichang Han，Xiandong Li et al.StIL-17 gene polymorphisms in the development of pulmonary tuberculosis［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：3225-3229.

［12］Peng R，Yue J，Han M et al.The IL-17F sequence variant is associated with susceptibility to tuberculosis［J］. Gene，2013，515（1）：229-232.

［13］Andrea Cruz，Alexandra G Fraga，Jeffrey J，et al.Pathological role of interleukin 17 in mice subjected to repeated BCG vaccination after infection with Mycobacterium tuberculosis［J］.J Exp Med，2010，207（8）：1609-1616.

［14］Cowan J，Pandey S，F(xiàn)ilion LG et al.Comparison of interferon，interleukin（IL）-17-and IL-22-expressing CD4 T cells，IL-22-expressing granulocytes and proinflammatory cytokines during latent and active tuberculosis infection［J］.Clin Exp Immunol，2012，167（2）：317-329.

（收稿：2016-08-21修回：2016-10-27）

杭州市科技發(fā)展計劃項目（No.20120533Q26）

杭州市紅十字會醫(yī)院結核科（浙江省結核病診療中心）（杭州310003）

邱美華，Tel：13073694218；E-mail：louie15@sina.com