周 勇趙 瑋

涼膈散對內(nèi)毒素致急性肺損傷大鼠肺組織病理學(xué)及血中性粒細(xì)胞凋亡的影響

周 勇1趙 瑋2

目的觀察涼膈散對內(nèi)毒素（LPS）致急性肺損傷（ALI）大鼠肺組織病理學(xué)及血中性粒細(xì)胞（PMN）凋亡的影響。方法健康雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為正常對照組、ALI模型組、涼膈散大、中、小劑量組和強(qiáng)的松治療組，每組12只。LPS（2mg/kg）氣管內(nèi)滴注復(fù)制急性肺損傷模型。各組大鼠分別以生理鹽水、涼膈散不同劑量、強(qiáng)的松灌胃。計(jì)算各組大鼠肺組織病理學(xué)積分，流式細(xì)胞儀檢測PMN的凋亡改變。結(jié)果病理學(xué)炎癥積分：12h模型組高于正常對照組[（2.08±0.12）分比（0.33± 0.03）分，P<0.01]，12h涼膈散大、中、小劑量組均低于模型組[（0.83±0.09）分、（1.00±0.09）分、（1.17± 0.08）分比[（2.08±0.12）分，P<0.01或P<0.05]，24h模型組高于正常對照組[（2.25±0.11）分比（0.41± 0.04）分，P<0.01]，涼膈散大、中、小劑量組均低于模型組[（0.67±0.05）分、（1.17±0.07）分、（1.33±0.06）分比（2.25±0.11）分，P<0.01或P<0.05]。中性粒細(xì)胞凋亡指數(shù)：12h模型組低于正常對照組[（51.36± 3.99）%比（71.71±4.13）%，P<0.01]，12h涼膈散大、中劑量組高于模型組[（66.37±4.25）%、（61.6± 5.02）%比（51.36±3.99）%，P<0.05]，24h模型組低于正常對照組[（63.04±4.89）%比（80.82±5.19）%，P<0.01]，涼膈散大劑量組高于模型組[（71.32±5.32）%比（63.04±4.89）%，P<0.05]。結(jié)論涼膈散可誘導(dǎo)急性肺損傷時(shí)中性粒細(xì)胞凋亡，抑制中性粒細(xì)胞發(fā)揮活性作用，從而減輕急性肺損傷肺部炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

大鼠；急性肺損傷；涼膈散；病理學(xué)；中性粒細(xì)胞；凋亡

急性肺損傷（ALI）是由非心源性的各種肺內(nèi)、外致病因素如嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、彌漫性血管內(nèi)凝血、休克等原發(fā)疾病引起，臨床主要表現(xiàn)為急性進(jìn)行性加重的呼吸困難和難治性低氧血癥，進(jìn)一步發(fā)展可演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征（ARDS）[1]。目前認(rèn)為過度失調(diào)的炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。在ALI患者肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞（PMN）是主要的炎性細(xì)胞，它一方面可以釋放多種如蛋白酶、花生四烯酸、活性氧族等細(xì)胞毒性產(chǎn)物導(dǎo)致肺組織損傷；另一方面，它還可以釋放一些促炎分子如生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子等促進(jìn)炎性反應(yīng)[2-3]。

涼隔散載于宋《太平惠民和劑局方》，其功效為瀉火解毒，清上泄下。文獻(xiàn)報(bào)道，涼隔散治療ALI、ARDS獲得一定的效果[4-5]，能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）表達(dá)的增強(qiáng)，同時(shí)還能抑制炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)，減輕肺組織損傷[6]。本課題研究涼膈散對急性肺損傷模型大鼠主要炎性細(xì)胞——中性粒細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用，探討涼膈散治療急性肺損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物雄性清潔級SD大鼠72只，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物涼膈散（大黃、樸硝、甘草、梔子各9g，薄荷、黃芩各6g，連翹18g）購自杭州市紅十字會醫(yī)院中藥房，水煎濃縮至4g生藥/mL；強(qiáng)的松片（浙江仙居制藥股份有限公司，批號131089），生理鹽水溶至1mg/mL。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器膜聯(lián)蛋白-異氰酸熒光素（Annexin V-FITC）凋亡檢測試劑盒（美國Sigma公司），流式細(xì)胞儀（美國FACS Calibur公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組和造模SD大鼠72只，隨機(jī)分為正常對照組、ALI模型組、涼膈散大、中、小劑量組和強(qiáng)的松治療組，每組12只。除正常對照組外，均采用內(nèi)毒素（LPS）溶液（2mg/kg）氣管內(nèi)滴注復(fù)制急性肺損傷模型[7]，1天1次，連續(xù)2天。

1.4.2 藥物干預(yù)從第2次氣管內(nèi)滴注LPS 1h后予藥物，每天2次，連續(xù)給藥3天。正常對照組、ALI模型組每次胃飼生理鹽水1mL/100g；強(qiáng)的松治療組每次胃飼強(qiáng)的松10mg/kg；涼膈散大、中、小劑量組分別予涼膈散11.88g/kg、5.94g/kg、2.97g/kg，加生理鹽水稀釋至4mL，分2次灌胃。

1.4.3 標(biāo)本采集造模后12、24h每組各處死6只大鼠，麻醉后剖開腹腔暴露下腔靜脈收集血液，血標(biāo)本離心制備血清，注入加有肝素（濃度500U/mL）0.4mL的試管中以提取PMN。取肺組織，右肺中葉肺組織置于PBS配置的10%甲醛溶液中固定。余肺置－70℃保存。

1.4.4 病理組織學(xué)檢查右肺中葉肺組織在以PBS配置的10%甲醛溶液中固定24h后，矢狀切面右肺門處斜切肺門緣，取厚約5mm肺組織，脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，分別行HE染色。根據(jù)光鏡下肺組織炎癥細(xì)胞浸潤和上皮脫落的程度分為4級[8]：“－”未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；“+”少量炎癥細(xì)胞浸潤，氣管結(jié)構(gòu)完整；“+++”見大量炎癥細(xì)胞浸潤，并可見管壁破壞及（或）上皮脫落；“++”界于“+”和“+++”之間。分別記為0、1、2、3分。

1.4.5 提純PMN高速低溫離心機(jī)離心l0min（4℃，2000rpm），取白細(xì)胞層及部分血漿與等量D-Hanks液混勻。將稀釋血漿、白細(xì)胞層沿管壁緩慢疊加于分層液表面，形成清晰界面。離心30min（20℃，2000rpm）。吸棄上清液及薄膜層，沉淀物即為PMN。用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。離心，棄上清。用D-Hanks液清洗細(xì)胞×3次，洗后離心，末次離心后棄上清，加入RMP I-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞待測。

1.4.6 Annexin V和碘化丙啶（PI）雙標(biāo)法測定中性粒細(xì)胞凋亡分離純化后的PMN懸浮于孵育緩沖液中，加Annexin V-FLUOS和PI，室溫下孵育15min，流式細(xì)胞儀雙通道檢測5000個(gè)細(xì)胞，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長515nm和610nm。Annexin V陽性為凋亡早期細(xì)胞，PI陽性為壞死細(xì)胞，Annexin V、PI雙陽性為凋亡晚期/壞死細(xì)胞。以Annexin V+/PI-細(xì)胞（右下象限）占所有細(xì)胞的百分比表示PMN的凋亡指數(shù)[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用One-Way ANOVA分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠病理學(xué)炎癥積分比較各時(shí)相模型組病理學(xué)炎癥積分均高于正常對照組（P均<0.01），12h涼膈散中、小劑量組高于正常對照組（P<0.05）；12h和24h涼膈散大、中、小劑量組、強(qiáng)的松組均低于模型組（P<0.05或P<0.01），各治療組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），見表1。

表1 各組大鼠病理學(xué)炎癥積分比較

表1 各組大鼠病理學(xué)炎癥積分比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P< 0.05，△△P<0.01

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2.2 各組大鼠中性粒細(xì)胞凋亡指數(shù)比較12h、24h模型組中性粒細(xì)胞凋亡指數(shù)均低于正常對照組（P< 0.01）；12h、24h強(qiáng)的松組均高于模型組（P<0.01或P<0.05），12h涼膈散大、中劑量組高于模型組（P< 0.05），涼膈散小劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），涼膈散小劑量組低于強(qiáng)的松組（P< 0.05）。24h涼膈散大劑量組高于模型組（P<0.05），中、小劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠中性粒細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

表2 各組大鼠中性粒細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

注：與正常對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與強(qiáng)的松組比較，▲P<0.05

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3 討論

PMN在各種炎性因子如LPS、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL-1）的作用下，聚集于肺微血管內(nèi)皮并被激活，再由肺血管進(jìn)入肺組織并持續(xù)活化，釋放一系列損傷介質(zhì)，引起彌漫性肺泡損害；還通過激活NF-κB從而誘導(dǎo)IL-1β、IL-8、TNF-α等釋放引起炎癥級聯(lián)瀑布效應(yīng)，繼而導(dǎo)致ALI[2，9]。凋亡PMN的脫顆粒、呼吸爆發(fā)等致炎能力下降，并更容易被吞噬細(xì)胞識別、吞噬。吞噬細(xì)胞吞噬大量凋亡PMN后，其產(chǎn)生和釋放促炎介質(zhì)的功能受到抑制[10]。炎癥反應(yīng)時(shí)，通過快速凋亡機(jī)制清除炎癥局部的PMN，達(dá)到促進(jìn)炎癥消散從而限制肺損傷的目的。但是研究[3]表明，ALI時(shí)滲出到肺組織的PMN存在凋亡延遲，存活時(shí)間延長，持續(xù)釋放毒性內(nèi)容物，造成肺組織的損傷。本研究結(jié)果顯示，12h、24h模型組中性粒細(xì)胞凋亡指數(shù)均低于正常對照組（P<0.01），也證明急性肺損傷中存在中性粒細(xì)胞凋亡延遲。

中醫(yī)認(rèn)為，肺主氣，司呼吸，開竅于鼻，肺為嬌臟，易感外邪。肺損傷發(fā)病多因感受外邪（如邪毒六淫、癘氣等），屬溫病范疇，熱迫血瘀，瘀熱互結(jié)于肺，氣機(jī)不通，肺通調(diào)水道功能失司，水液內(nèi)停，而致肺水腫；影響氣機(jī)升降，導(dǎo)致肺氣上逆而喘。肺與大腸相表里，肺部邪熱下移于大腸，與陽明積滯搏結(jié)，大便不通，極易使邪毒淤積腸道，損傷黏膜，進(jìn)入血液循環(huán)，從而加劇膿毒血癥，加重肺組織的炎癥反應(yīng)。早期運(yùn)用清熱解毒藥，可阻止邪毒入里陷內(nèi)。涼隔散方中連翹輕清透散，清熱解毒，清透上焦之熱；薄荷清利頭目、利咽；黃芩清透上焦之熱，清透胸膈之熱；梔子清利三焦之熱；竹葉通利小便，引火下行；大黃、梔子瀉下通便；整方具有清上通下功效。

本研究結(jié)果顯示,光鏡下涼膈散各干預(yù)組肺泡結(jié)構(gòu)破壞或?qū)嵶?、肺泡隔增厚、肺泡腔?nèi)、細(xì)動脈周圍和細(xì)支氣管壁炎癥細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞滲出情況均較模型組有較大程度的改善。病理學(xué)積分顯著降低。提示涼膈散對肺部炎癥有抑制作用。

本研究結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞凋亡指數(shù)12h涼膈散大、中劑量組高于模型組（P<0.05），24h涼膈散大劑量組高于模型組（P<0.05）。說明急性肺損傷時(shí)涼膈散能誘導(dǎo)PMN凋亡。既往有研究報(bào)道涼膈散抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠p38MAPK、NF-κB表達(dá)的增強(qiáng)[6，11]，此二者與中性粒細(xì)胞凋亡有關(guān)?？v觀目前關(guān)于中性粒細(xì)胞凋亡的信號通路，主要包括[12]：（1）抑制PMN凋亡的通路：NF-κB存活蛋白通路、ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、PI3 K-Akt通路；（2）促進(jìn)PMN凋亡的通路：Fas/Fast通路，p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中NF-κB調(diào)控多種參與早期免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)的因子，包括腫瘤壞死因子、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)加氧酶2、趨化因子、黏附分子、集落刺激因子等。研究[13]發(fā)現(xiàn)，多種核因子κB抑制劑能促進(jìn)體外培養(yǎng)人血中性粒細(xì)胞的自發(fā)性凋亡，且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性和劑量依賴性，而對腫瘤壞死因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡具有協(xié)同效應(yīng)。由此推論，涼膈散可能通過抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠NF-κB表達(dá)的增強(qiáng)，抵抗NF-κB對中性粒細(xì)胞凋亡的抑制作用，從而起到誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡的作用，但其具體機(jī)制及涼膈散對中性粒細(xì)胞凋亡的其他信號通路有無影響，尚有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿：2016-11-20修回：2016-12-19）

Effect of Lianggesan on Histopathology of Lung Tissue and the Apoptosis of Polymorphonuclear Granulo－cytes in a Rat Model of Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury

ZHOU Yong1,ZHAO Wei21 Department of Leader Health,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou(310003),China;2 Research Center of Respiration Physiological Functions,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Lianggesan on the histopathology accumulated points of lung tis sue and the apoptosis of polymorphonuclear granulocytes（PMN）in blood from rats with lipopolysaccharide（LPS）in duced acute lung injury.MethodsSeventy-two healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups（n=12）: control group,model group,prednisone group and the Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups.The LPS solution（2mg/kg）was instilled into the trachea to prepare rat acute lung injury model except control group,once a day for two days.Each treatment group completed the second infusion 1 hour after LPS solution.The drugwas intragastric administration twice a day.After each group were instilled 12h,24h,6 rats were put to death to collect the required samples.The apoptosis of PMN was detected with flow cytometer.ResultsAt 12h after instilled,the pathology accumulated points in model groupwas higher than that in control group（2.08±0.12 vs 0.33±0.03,P<0.01）),that in Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups were lower than that in model group（0.83±0.09,1.00±0.09, 1.17±0.08 vs 2.08±0.12,P<0.01 or P<0.05）;at 24h after instilled,the points in model group was higher than that in control group（2.25±0.11 vs 0.41±0.04,P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-,middle-and low-dose groups were lower than that in model group（0.67±0.05,1.17±0.07,1.33±0.06 vs 2.25±0.11,P<0.01 or P<0.05）.The apoptosisof PMN at 12h after instilled in model group was lower than that in control group（51.36%±3.99%vs 71.71%±4.13%, P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-and middle-dose groups were higher than that in model group（66.37%± 4.25%,61.6%±5.02%vs 51.36%±3.99%,P<0.05）;the apoptosis at 24h after instilled in the model groupwas lower than that in control group（63.04%±4.89%vs 80.82%±5.19%,P<0.01）,that in Lianggesan decoction high-dose groupwas higher than that in model group（71.32%±5.32%vs 63.04%±4.89%,P<0.05）.ConclusionLianggesan can induce the apoptosis of PMN,lighten the inflammatory reaction of lung tissue in acute lung injury.The underlying mechanism may be related to suppressing the expression of NF-κB.

rats;acute lung injury;Lianggesan;pathology;polymorphonuclear granulocytes;apoptosis

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011ZA083）

1杭州市紅十字會醫(yī)院干部保健科（杭州310003）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸生理研究中心（杭州310006）

周勇，Tel：0571-56109768