趙雪飛 張晶鈺 金煜

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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優(yōu)化高效液相色譜法對天然麝香的鑒別1)

趙雪飛 張晶鈺 金煜

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

將已有高效液相色譜(HPLC)法的樣品處理過程進行優(yōu)化改良；采用正交分解法設(shè)計實驗的色譜條件，確定甲醇與水體積比為90∶10的比例為最優(yōu)化分離方案；使用改良優(yōu)化過的HPLC方法分析天然麝香和摻偽麝香的指紋圖譜，然后以標(biāo)準品的數(shù)據(jù)為參考確認其中是否摻有人工合成麝香酮。結(jié)果表明：使用優(yōu)化后的方法可對天然麝香中是否摻有人工合成麝香酮進行鑒定，并可在一定程度上提高鑒定的準確性、速度與精度。

天然麝香；麝香酮；高效液相色譜法

天然麝香是麝科動物林麝(Moschusberezovskii)、馬麝(M．sifanicus)和原麝(M．moschiferus)等成熟雄性個體香腺囊中的干燥分泌物，是重要的天然香料和中醫(yī)藥原料。麝香酮(3-甲基環(huán)十五烷酮)是天然麝香中最重要的藥用有效成分和致香物質(zhì)[1]，自1926年Ruzicka對其化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究獲得突破性進展以來[2]，人工合成麝香酮的技術(shù)不斷改進，合成質(zhì)量也不斷提高，但人工合成的麝香酮與天然麝香中存在的麝香酮是有差異的，且主要是手性上的差異。天然麝香酮為(L)型[3]，而人工合成麝香酮則多為(DL)[4]型或(R)型、(S)型和外消旋型[5](見圖1)。

目前，高效液相色譜(HPLC)在中藥成分分析及質(zhì)量控制中的應(yīng)用越來越廣泛、深入[6]，張萍等曾利用HPLC法對北京聯(lián)馨藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的10批次人工麝香進行質(zhì)量檢測，其中標(biāo)準物質(zhì)Ⅲ雖經(jīng)過衍生化存在順反異構(gòu)互變，但卻得到有效分離而形成兩個色譜峰，證明HPLC法在手性拆分中的應(yīng)用價值[7]。本文將其對樣品的處理方法進行了改良優(yōu)化，并將該法應(yīng)用于檢測天然麝香樣品中是否含有人工麝香酮，以此作為天然麝香品質(zhì)鑒別的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Waters 600E；超聲波萃取儀。(L)-麝香酮(標(biāo)準品Ⅰ)，大連兆羿生物酮有限公司產(chǎn)品，批號151013171012，純度98.00%；(DL)-麝香酮(標(biāo)準品Ⅱ)，大連兆羿生物酮有限公司產(chǎn)品，批號150819170818，純度99.00%；16份天然麝香樣品，采自多個藥材公司；甲醇(色譜純)，美國J.T.Baker公司產(chǎn)品；其余試劑為分析純，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。

色譜條件：采用BOJIN系列的Launch C18H色譜柱(4.6 mm×250 mm)；以甲醇-水體積比90∶10為流動相，柱溫為25 ℃，檢測波長為254 nm。

1.2 溶液的制備

標(biāo)準品溶液：精密稱取標(biāo)準品Ⅰ、標(biāo)準品Ⅱ各50 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，再用針孔式微孔濾膜過濾，即配制成5 g·L-1的標(biāo)準品貯備液。

供試品溶液：精密稱取麝香樣品0.5 g，研磨均勻置于10 mL容量瓶中，分別加入4 mL無水乙醇和1 g無水硫酸鈉，室溫密塞浸泡過夜。用超聲波萃取儀萃取3次，每次30 min，靜置至室溫后取上清。SPE C18固相萃取柱用3 mL乙醇活化后加入上清萃取液，再加3 mL去離子水淋洗，然后加2 mL無水乙醇得純化產(chǎn)物，再將純化產(chǎn)物用針孔式微孔濾膜過濾，即得樣品貯備液。

圖1 麝香酮的同分異構(gòu)體分子結(jié)構(gòu)式

1.3 儀器方法學(xué)試驗

流動相：選用體積比為95∶5、90∶10、85∶15、83∶17的甲醇-水為流動相進行實驗。結(jié)果顯示，當(dāng)甲醇-水比例為85∶15和83∶17時，標(biāo)準品Ⅱ可完全分離，但所有色譜峰完全出峰時間延長至20 min左右；當(dāng)甲醇-水為95∶5時，標(biāo)準品Ⅱ分離不完全；當(dāng)甲醇-水為90∶10時，標(biāo)準品Ⅱ的分離度較好，且運行時間最佳。因此選擇流動相為90∶10的甲醇-水。

流速：選用流速0.5、1.0 mL/min進行試驗。結(jié)果顯示，兩者均可將標(biāo)準品Ⅱ完全分離，但當(dāng)流速為0.5 mL/min時，出峰時間增加約1倍，因此選擇流速為1.0 mL/min。

系統(tǒng)適用性試驗：取麝香酮標(biāo)準品Ⅱ貯備液，連續(xù)進樣5次。結(jié)果可得(D)-麝香酮和(L)-麝香酮的分離度大于1.5，其中(D)-麝香酮峰面積占總峰面積的比例平均值為69.418%、(L)-麝香酮峰面積占總峰面積的比例平均值為30.582%，且兩者峰面積比例較為穩(wěn)定，系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

方法專屬性試驗：取標(biāo)準品溶液、供試品溶液與空白溶液(無水乙醇和空針)分別進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶液對測定無干擾，表明該方法專屬性強。

1.4 樣品含量測定

精密稱取麝香樣品0.5 g制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定。根據(jù)樣品中(L)-麝香酮出峰位置和是否有(D)-麝香酮峰的存在，進行判定麝香樣品中除(L)-麝香酮外，是否有人工麝香酮摻入。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準品特征圖譜

進樣可知：標(biāo)準品Ⅰ的(L)-型麝香酮在13 min左右有1個明顯峰；標(biāo)準品Ⅱ的(DL)-型麝香酮在11 min和13 min左右有2個明顯峰，與標(biāo)準品Ⅰ的色譜圖對比可知，13 min左右峰為(L)-麝香酮，11 min左右的峰為(D)-麝香酮。

分別配制1、2、4、8倍的標(biāo)準品Ⅰ、Ⅱ溶液進樣，可見標(biāo)準品Ⅰ在11 min左右的峰和標(biāo)準品Ⅱ在11 min和13 min左右的2個峰面積，均隨濃度增加而增大，峰形穩(wěn)定，說明該方法可以拆分(DL)-麝香酮中的(D)-型結(jié)構(gòu)、(L)-型結(jié)構(gòu)。

2.2 天然麝香特征圖譜

圖2為天然麝香樣品。由圖2可見，圖中11～16 min內(nèi)僅在11、13 min左右有2個峰為天然麝香中成分。

圖2 天然麝香樣品

圖3為在圖2樣品中人為加入1倍濃度標(biāo)準品Ⅱ的麝香樣品。對比可見，圖3中11～16 min內(nèi)明顯多出2個峰。結(jié)合標(biāo)準品Ⅱ(DL)-型麝香酮的色譜圖中2個峰出峰時間和峰面積比，可以判斷圖3中12、15 min左右多出的峰，即為標(biāo)準品Ⅱ中(D)-型結(jié)構(gòu)、(L)-型結(jié)構(gòu)的麝香酮。

圖3 加入標(biāo)準品Ⅱ的天然麝香樣品

將圖2與圖3比較可見：圖2在15 min左右并無明顯峰，基線平穩(wěn)，可以判斷該麝香樣品內(nèi)不含有天然麝香酮，或酮含量很少已低至檢測限以下。進一步比較可看出，圖2在12 min左右也無明顯峰，基線平穩(wěn)，進而可以判斷，該麝香樣品中并未添加(DL)-型或(D)-型人工合成麝香酮，并可在一定程度上判斷該麝香樣品中所含天然麝香酮的純度。

3 討論

該方法在實際應(yīng)用中仍存在需要繼續(xù)優(yōu)化之處，如，處理好的標(biāo)準品和供試品溶液的保存。由于樣品處理所用溶劑為乙醇，揮發(fā)性較強，因此在保存上需要特別注意，最好能做到即用即配，減少揮發(fā)損失，使得對麝香中天然麝香酮純度的判斷更加準確，進樣效果更好。另外，在處理樣品之前，應(yīng)盡量將樣品研磨均勻，防止提取時不充分，影響實驗結(jié)果。麝香成分復(fù)雜，摻偽方式也經(jīng)常變化，因此，在圖譜中目標(biāo)時間內(nèi)可能出現(xiàn)雜峰，需謹慎辨別，不能輕易下結(jié)論。

實驗證明，該方法可有效拆分(DL)-麝香酮中的(D)-型結(jié)構(gòu)、(L)-型結(jié)構(gòu)，并對天然麝香中是否存在外源性人工合成麝香酮作出判定，并在一定程度上判定天然麝香中所含天然麝香酮的純度。天然麝香成分非常復(fù)雜，麝香酮含量一直是衡量其品質(zhì)優(yōu)劣的指標(biāo)性物質(zhì)，含有麝香的中成藥制劑也多以測定麝香酮的含量多少控制質(zhì)量[8]。麝香酮的工業(yè)化生產(chǎn)，不但給天然麝香的質(zhì)量控制增加了難度，也為藥品的安全帶來了不穩(wěn)定因素，所以在研究證明天然麝香酮的手性體的使用對人體無害之前，提高對天然麝香入藥檢測的標(biāo)準是十分必要的[9]。本研究中建立的天然麝香酮的測定方法樣品分離效果良好，測定時溶劑無干擾，專一性強，可作為輔助鑒定麝香品質(zhì)的方法之一。

[1] 樊放.麝香鑒定之不足[J].新疆中醫(yī)藥，2005，23(5)：51-52.

[2] 馬麗鋒，陳韶蕊，申鳳娟，等.麝香酮的合成進展[J].煤炭與化工，2014，37(6)：31-34，87.

[3] 鄭鴻.麝香酮“手性技術(shù)”難題被破解[N].大連日報，2008-01-23(A05).

[4] 朱海軍，古昆，劉志華，等.光學(xué)活性麝香酮的合成研究進展[J].云南化工，2003，30(5)：32-35.

[5] 吳恒，陳禮明，張善堂.高效液相色譜在中藥研究中的應(yīng)用[J].安徽醫(yī)藥，2009，13(8)：863-866.

[6] 林慶芳，沈霞，李暉.柱層析法分離DL-麝香酮及其同分異構(gòu)體方法的研究[J].山東醫(yī)藥工業(yè)，2000，19(4)：14-15.

[7] 張萍，肖宣，張南平，等.人工麝香高效液相色譜特征圖譜分析[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2014，36(6)：587-590.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010．

[9] 張芳，張霞，劉春美，等.手性GC法測定麝香中麝香酮的含量[J].中國藥房，2011，22(43)：4089-4091.

Optimized HPLC Method to Identify the Natural Musk//

Zhao Xuefei, Zhang Jingyu, Jin Yu
(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(6)：93-95.

Natural musk; Musk ketone; HPLC

1)國家林業(yè)局“象牙、羚羊角、麝香等庫存資源動態(tài)監(jiān)測”項目。

趙雪飛，女，1992年6月生，東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，碩士研究生。E-mail：1017936168@qq.com。

張晶鈺，東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，工程師。E-mail：zhangjingyu@foxmail.com。金煜，東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，研究員。E-mail：947657808@qq.com。

2017年2月5日。

Q956；R284.0

The experiment was conducted to optimize the sample processing of existing HPLC method, orthogonal decomposition method was used to design chromatographic condition, to determine the optimal separation scheme of methanol/water (90∶10 in volumn). The optimized HPLC was used to identify the fingerprints of natural musk and adulteration musk, with standard data as reference to confirm whether laced with synthetic musk ketone. The optimized method can identify natural musk laced with synthetic musk ketone with good performance in identification accuracy, speed and precision.