賀飛燕，閆建俊，白云鳳，馮瑞云，張維鋒

(1.山西大學(xué) 生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031)

籽粒莧C4關(guān)鍵酶丙酮酸磷酸雙激酶基因的原核表達(dá)及酶活性測(cè)定

賀飛燕1，閆建俊2，白云鳳2，馮瑞云2，張維鋒2

(1.山西大學(xué) 生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031)

為了進(jìn)一步探究籽粒莧丙酮酸磷酸雙激酶(AhPPDK)蛋白的作用機(jī)制，構(gòu)建了AhPPDK基因的原核表達(dá)載體，通過(guò)堿裂解提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，選擇正確表達(dá)的陽(yáng)性重組子，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK轉(zhuǎn)化菌株Transetta(DE3)；利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。SDS-PAGE凝膠電泳分析表明，重組AhPPDK能在大腸桿菌Transset(DE3)中高效表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)分子量約為108 kDa，與預(yù)期分子量相符，且為可溶性蛋白。利用紫外分光光度法測(cè)量結(jié)果表明，原核表達(dá)的AhPPDK具有酶活性，且上清粗酶液活性高于沉淀粗酶液。研究結(jié)果可為進(jìn)一步探明AhPPDK蛋白的作用機(jī)制和轉(zhuǎn)基因利用奠定基礎(chǔ)。

籽粒莧；AhPPDK；原核表達(dá)；酶活測(cè)定

在細(xì)菌、原生動(dòng)物和植物中均存在丙酮酸磷酸雙激酶(Pyruvate phosphate dikinase，PPDK)，該酶催化“丙酮酸+ATP+Pi?磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)+ AMP+PPi+2H+”可逆反應(yīng)[1]。在細(xì)菌和原生動(dòng)物中，PPDK主要起丙酮酸激酶的作用，催化PEP生成ATP和丙酮酸。在植物中，受基質(zhì)中高活性的焦磷酸酶和基質(zhì)本身pH值等生理?xiàng)l件的影響，PPDK催化主要向生成PEP的方向進(jìn)行。

植物PPDK可分為葉綠體PPDK(chPPDK)和胞質(zhì)型PPDK(cyPPDK)。其中，chPPDK分布在細(xì)胞葉綠體中，分子量較大，N末端含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，主要在C4植物的光合組織如葉片中大量表達(dá)，在其他部位如莖、花等組織中表達(dá)量很低[2-3]，也稱之為C4型PPDK；cyPPDK主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，分子量較小，N末端不含葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，主要在植物的非光合組織如根、種子及黃化葉片中表達(dá)[4-5]。有些植物，如玉米的PPDK基因具有雙啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，即同一個(gè)基因可通過(guò)2個(gè)啟動(dòng)子分別從2個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄，從第1個(gè)外顯子開始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生chPPDK，從第2個(gè)外顯子開始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生 cyPPDK，第1個(gè)外顯子編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽[6]。

PPDK是C4植物光合途徑重要的限速酶，催化生成的PEP作為初始CO2受體，在 NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-malate dehydrogenase，NADP-MDH)的作用下進(jìn)一步生成蘋果酸。蘋果酸進(jìn)入維管束鞘細(xì)胞，在NADP-蘋果酸酶(NADP-malate enzyme，NADP-ME)作用下釋放的CO2被Rubisco固定進(jìn)入三羧酸循環(huán)[7]，生成的丙酮酸進(jìn)入葉肉細(xì)胞被PPDK重新利用。C3植物的PPDK表達(dá)水平低，參與了氮循環(huán)調(diào)控[8]、逆境脅迫應(yīng)答等反應(yīng)[4]，催化生成的PEP為氨基酸合成提供了碳骨架[9]。

將C4植物的PPDK基因在C3植物中過(guò)表達(dá)，以期提高C3植物的光合效率，成為作物遺傳改良的熱點(diǎn)之一。籽粒莧(A.hypochondriacus)又名千穗谷、西粘谷、莧菜等，為雙子葉C4植物[10-16]，生長(zhǎng)快、抗性強(qiáng)、光合效率高[17-18]。迄今為止，對(duì)于籽粒莧C4光合基因的研究、利用的報(bào)道甚少。

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所植物轉(zhuǎn)基因課題組已經(jīng)克隆了籽粒莧PPDK(AhPPDK)基因(GenBank注冊(cè)號(hào)：JF907701)，獲得了原核重組蛋白，測(cè)定了酶活性，以期為進(jìn)一步探明該蛋白的作用機(jī)制和轉(zhuǎn)基因利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株和質(zhì)粒 質(zhì)粒PUC18-AhPPDK由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室保存。原核表達(dá)載體pEASY-E1，Trans1-T1和Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 本試驗(yàn)所用的LATaqDNA聚合酶、dNTP，限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ，PstⅠ，EcoR Ⅰ等購(gòu)自TaKaRa(大連寶生物公司)。瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購(gòu)自北京艾德來(lái)生物科技有限公司。DNA Marker、Premixed Protein Marker、IPTG均購(gòu)自TaKaRa公司，考馬斯亮藍(lán)G-250為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品。氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司。LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、PBS緩沖液、30%(m/V)Acrylamide、10%過(guò)硫酸銨、5×Tris-Glycine Buffer以及5×SDS-PAGE Loading Buffer等配制所需的藥品和試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)外公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 以山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室保存的PUC18-AhPPDK為模板，對(duì)AhPPDK基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物為5′-ATGATGGCTTCAGCTTATAA-3′，下游引物為5′-CGGTAACCTCACACAGCAACTTGAGCAGC-3′。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，57 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將目的基因與pEASY-E1載體連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1，挑單菌落過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)堿裂解提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，選擇正確表達(dá)的陽(yáng)性重組子，送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2AhPPDK基因的原核表達(dá) 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK轉(zhuǎn)化菌株Transetta(DE3)，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，在超凈工作臺(tái)上，用提前滅菌牙簽挑取白色單菌落，并接種于5 mL含有氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為200 r/min，37 ℃過(guò)夜搖菌活化培養(yǎng)；取活化菌液1 mL并在100 mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基中(含Amp+)中繼代培養(yǎng)(37 ℃，200 r/min)，振蕩培養(yǎng)約3～4 h后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度。當(dāng)菌液濃度OD600值為0.4～0.6時(shí)，加入1 mmol/L的IPTG，37 ℃下分別誘導(dǎo)2，4，6 h。反應(yīng)結(jié)束后，各取菌液2 mL，14 000 r/min離心1 min，收集菌體，用1 mL的PBS緩沖液懸浮菌體(pH值7.4)，25 μL體系中各取20 μL的菌液加入5 μL的5×SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴5～10 min，14 000 r/min離心1 min，立刻冰浴5 min，取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色后，經(jīng)過(guò)夜并用蒸餾水進(jìn)行脫色3～4次來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 丙酮酸磷酸雙激酶的酶活測(cè)定 在丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)的催化下，PEP、AMP和焦磷酸可形成丙酮酸，丙酮酸在過(guò)量的乳酸脫氫酶作用下形成乳酸，同時(shí)可使還原型輔酶Ⅰ(NADH)氧化。根據(jù)340 nm下OD值的變化可計(jì)算NADH的量，由NADH的量即可推算出PPDK的酶活力[19]。

將原核表達(dá)的培養(yǎng)物離心收集菌體，用PBS懸浮洗滌，離心后重懸于PBS液(加入溶菌酶100 μg/mL，0.1%的Triton X-100)，室溫消化30 min，-20 ℃凍融30 min，然后反復(fù)3次破碎細(xì)胞，再利用超聲波破碎儀在功率為200 W的條件下，工作3 s，停5 s，20個(gè)循環(huán)，離心前的酶液即為全菌液，離心得到的上清即為上清粗酶液，沉淀用PBS懸浮即為沉淀粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆?。按?配制2 mL的反應(yīng)體系，將配好的反應(yīng)體系搖勻，置于比色杯中，以蒸餾水為空白對(duì)照，在340 nm測(cè)定OD值，作為零點(diǎn)值；再將0.067 mL 30 mmol/L焦磷酸鈉加入比色杯內(nèi)，反應(yīng)立即開始，用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，每20 s測(cè)定一次OD值，并記錄，以1 min內(nèi)的光密度變化計(jì)算酶活力。

表1 AhPPDK酶活測(cè)定的反應(yīng)體系

酶活力=(ΔOD×Vt)/(6.22×d×Δt×Vs)，式中：ΔOD表示反應(yīng)最初1 min內(nèi)340 nm處OD值變化的絕對(duì)值；6.22表示每毫摩爾NADH在340 nm處的光密度；d為比色杯光程(cm)，Δt表示測(cè)定時(shí)間為1 min；Vt為酶液總量(mL)；Vs為反應(yīng)液體積(mL)；酶活力單位為μmol/(min·mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建

以克隆載體pUC-AhPPDK為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆AhPPDK基因，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，可見(jiàn)大約3 kb的片段(圖1)。將該片段回收，與pEASY-E1表達(dá)載體連接，構(gòu)建形成重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)，用EcoRⅠ、XbaⅠ和SacⅠ分別單酶切檢測(cè)(圖2)，結(jié)果顯示，經(jīng)EcoRⅠ單酶切得到1 196，1 320 bp共2個(gè)片段，XbaⅠ單酶切得到909 bp，SacⅠ單酶切得到2 128 bp，與預(yù)期相符。選擇正確表達(dá)的陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明(圖3)，連入表達(dá)載體pEASY-E1中的基因序列與原載體上的AhPPDK序列一致。

在重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK上，AhPPDK序列上游為6-His序列標(biāo)簽(圖3下劃線所示)。測(cè)序結(jié)果表明，6-His-AhPPDK不會(huì)出現(xiàn)移碼突變，表明pEASY-E1-AhPPDK原核表達(dá)載體構(gòu)建正確，然后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Transetta(DE3)中，進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)。

M.DL5000 DNA Marker；1～3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M.DL5000 DNA Marker；1-3.PCR amplification products.

M.DL5000 DNA Marker；1～3.EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Sac Ⅰ分別單酶切。M.DL5000 DNA Marker；1-3.The single cleavage map of EcoR Ⅰ,Xba Ⅰ,Sac Ⅰ.

2.2 原核表達(dá)和SDS-PAGE凝膠電泳

將重組質(zhì)粒pEASY-E1-AhPPDK轉(zhuǎn)入菌株Transetta(DE3)后，用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑分別誘導(dǎo)2，4，6 h，用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分析，結(jié)果表明，重組AhPPDK得到高效表達(dá)，蛋白分子量約為108 kDa(圖4中右面箭頭所示)，與預(yù)期相符。從電泳結(jié)果還可以看出，蛋白的表達(dá)量在6 h時(shí)達(dá)到最高。將誘導(dǎo)6 h的大腸桿菌的菌液超聲波破碎后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)上清和沉淀表明，目的蛋白主要在上清中表達(dá)，是可溶性蛋白(圖5)。

圖3 重組原核表達(dá)載體pEASY-E1-AhPPDK部分序列

M.蛋白Marker 44.3～200 kDa；1，2，3分別為AhPPDK基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6，4，2 h；4.AhPPDK基因未誘導(dǎo)。M.Protein Marker 44.3-200 kDa；1，2，3 were AhPPDK genes induced by 6，4，2 h，IPTG；4.AhPPDK gene was not induced.

2.3 丙酮酸磷酸雙激酶的酶活測(cè)定

對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌的菌液超聲波破碎，收集上清和沉淀，采用分光光度法測(cè)定AhPPDK的活性，結(jié)果表明，該酶具有活性，全菌粗酶液的活性為0.5 μmol/(min·mL)，上清粗酶液的活性為0.4 μmol/(min·mL)，沉淀粗酶液的活性為0.08 μmol/(min·mL)，說(shuō)明丙酮酸磷酸雙激酶主要以可溶性形式存在(表2)。

M.蛋白Marker 44.3～200 kDa；1，2分別為pEASY-E1-AhPPDK誘導(dǎo)6 h的沉淀和上清的粗酶液。M.Protein Marker 44.3-200 kDa；1，2 were precipitated and supernatantof the crude enzyme solution of pEASY-E1-AhPPDK induced for 6 h.

表2 各樣品中AhPPDK酶活力

Tab.2 The enzyme activity of AhPPDK in each sample

樣品SampleAhPPDK酶活力/(μmol/(min·mL))AhPPDKenzymeactivity全菌粗酶液Totalbacterialcrudeenzymesolution0.50上清粗酶液Supernatantcrudeenzymesolution0.40沉淀粗酶液Precipitatedcrudeenzymesolution0.08

3 討論

丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK)是植物C4途徑的關(guān)鍵酶之一，在植物光合作用中催化ATP和丙酮酸再生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。一些常見(jiàn)的主要農(nóng)作物如水稻、小麥、馬鈴薯、甜菜等均為C3作物，光合效率不高是限制這些作物產(chǎn)量進(jìn)一步提高的重要內(nèi)在因素之一。通過(guò)基因工程技術(shù)，將PPDK基因從C4植物中克隆出來(lái)，然后導(dǎo)入C3植物，有可能提高C3植物的光合效率，從而提高作物產(chǎn)量。山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室先前克隆了籽粒莧C4型丙酮酸磷酸雙激酶基因AhPPDK，本研究通過(guò)原核表達(dá)獲得了AhPPDK蛋白，結(jié)果表明，該蛋白具有酶活性，為下一步轉(zhuǎn)基因利用奠定了基礎(chǔ)。

在原核表達(dá)系統(tǒng)中，目標(biāo)蛋白以可溶性形式存在，可為后期功能驗(yàn)證等研究提供便利。原核表達(dá)的蛋白能否以可溶性形式進(jìn)行表達(dá)，與原核表達(dá)質(zhì)粒、大腸桿菌菌株、誘導(dǎo)劑濃度大小以及誘導(dǎo)時(shí)間和溫度等多方面因素的影響有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)表達(dá)溫度為37 ℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度控制在0.5 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為2～6 h時(shí)，有利于促進(jìn)AhPPDK蛋白可溶性表達(dá)，且在6 h達(dá)到最高；另外，降低轉(zhuǎn)速也可提高AhPPDK蛋白可溶性表達(dá)量。

不同生物對(duì)密碼子的偏好性會(huì)影響蛋白質(zhì)表達(dá)效率。山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所植物轉(zhuǎn)基因課題組先前分析了AhPPDK的密碼子偏好性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與酵母菌的差異小于大腸桿菌[20]。但由于大腸桿菌表達(dá)所需時(shí)間較短、成本較為低廉，本研究先采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)出了AhPPDK蛋白，并探明其具有酶活性，下一步擬采用酵母系統(tǒng)表達(dá)AhPPDK，以進(jìn)一步探明其作用機(jī)制。

[1] 姜奇彥，牛風(fēng)娟，胡 正，等. 植物丙酮酸磷酸雙激酶研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2015，5(4)：272-278.

[2] Matsuoka M.The gene for pyruvate orthophosphate dikinase in C4plants：structure regulation and evolution[J].Plant Cell Physiol，1995，36(6)：937-943.

[3] Parsley K，Hibberd J M.TheArabidopsisPPDKgene is transcribed from two promoters to produce differentially expressed transcripts responsible for cytosolic and plastidic proteins [J]. Plant Mol Biol，2006，62(3)：339-349.

[4] Moons A，Valcke R，van Montagu M.Low-oxygen stress and water deficit induce cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase(PPDK)expression in roots of rice a C3plant[J].Plant J，1998，15(1)：89-98.

[5] Kang H G，Park S，Matsuoka M，et al.White-core endosperm floury endosperm-4 in rice is generated by knockout mutations in the C4-type pyruvate orthophosphate dikinase gene(OsPPDKB)[J].Plant J，2005，42(6)：901-911.

[6] Glackin C A，Grula J W.Organ-specific transcripts of different size and abundance derive from the same pyruvate，orthophosphate dikinase gene in maize[J].Proc Natl Acad Sci USA，1990，87(8)：3004-3008.

[7] Leegood R C.Strategies for engineering C4photosynthesis[J].J Plant Physiol，2013，170(4)：378-388.

[8] Taylor L，Nunes-Nesi A，Parsley K，et al.Cytosolic pyruvate，orthophosphate dikinase functions in nitrogen remobilization during leaf senescence and limits individual seed growth and nitrogen content[J].Plant J，2010，62(4)：641-652.

[9] Doubnerová V，Ry?lavá H.What can enzymes of C4photosynthesis do for C3plants under stress [J].Plant Sci，2011，180(4)：575-583.

[10] Raina A，Datta A.Molecular cloning of a gene encoding a seed-specific protein with nutritionally balanced amino acid composition fromAmaranthus[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1992，89(24)：11774-11778.

[11] 張錫州，李廷軒，王昌金.富鉀植物籽粒莧研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21(4)：230-235.

[12] 賀飛燕，施俊鳳，閆建俊，等.籽粒莧優(yōu)異性狀相關(guān)基因的發(fā)掘利用研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31(27)：177-182.

[13] Bello-Pérez LA，Paredes-López O.Starches of some food crops，changes during processing and their nutraceutical potential[J].Food Engineering Reviews，2009，1(1)：50-65.

[14] Gimplinger D M，Dobos G，Schoenlechner R，et al.Yield and quality of grain amaranth(Amaranthusspp.)in Eastern Austria[J].Plant Soil and Environment，2007，53(3)：105-112.

[15] 賀飛燕，閆建俊，張忠梁，等.籽粒莧光合特性與環(huán)境因子的相關(guān)和通徑分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(3)：303-305，352.

[16] 王淑芬.美國(guó)粒用莧營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1992，7(1)：89-93.

[17] Venskutonis P R, Kraujalis P. Nutritional components of amaranth seeds and vegetables: a review on composition, properties, and uses[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2013, 12(4):381-412.

[18] 王 淼，王旭靜，唐巧玲，等.籽粒莧中PPDK基因的克隆及表達(dá)特性分析[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2011，1(1)：50-55.

[19] 李榮生，尹天光，許煌燦，等.華南地區(qū)3個(gè)棕櫚藤種光合途徑的判別[J].植物學(xué)報(bào):英文版，2004，46(5)：560-564.

[20] 聶江婷，白云鳳，賀飛燕，等.籽粒莧丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的密碼子偏好性[J].植物學(xué)報(bào)，2014，49(6)：672-681.

Prokaryotic Expression and Enzyme Activity Determination of C4Key Enzyme Pyruvate Phosphate Dikinase Gene inAmaranthhypochondriacus

HE Feiyan1，YAN Jianjun2，BAI Yunfeng2，F(xiàn)ENG Ruiyun2，ZHANG Weifeng2

(1.College of Bioengineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute of Crop Science，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Shanxi Province Key Laboratory of Crop Genetics and Molecular Improvement，Key Laboratory of Loess Plateau Crop Gene Resources and Germplasm Creation，Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031，China)

To further explore the mechanism of action of AhPPDK protein，the prokaryotic expression vector ofAhPPDKgene was constructed.The plasmid was extracted by alkaline lysis，digested with restriction endonuclease，detected with 1.0% Agarose gel.The correct recombinant plasmid pEASY-E1-AhPPDKwas transformed intoE.coliTransset(DE3)，and the recombinant protein was induced by IPTG.SDS-PAGE analysis showed that recombinant AhPPDK could be highly expressed inE.coliTransset(DE3).The expressed recombinant protein had a molecular weight of 108 kDa，which was consistent with the expected molecular weight and was soluble protein.Pyruvate formed by pyruvate phosphodiesterase(PPDK)catalyzes the formation of lactate by excess lactate dehydrogenase and oxidizes reduced coenzyme I(NADH).Using ultraviolet spectrophotometry，the amount of NADH could be calculated according to the change of OD value at 340 nm，and then the activity of PPDK could be deduced.Spectrophotometric method showed that the prokaryotic expression of AhPPDK had the activity of enzyme.These results provide a basis for the further study on the mechanism of action of AhPPDK and the use of transgenes.

Amaranthhypochondriacus；AhPPDK；Prokaryotic expression；Enzyme activity determination

2017-02-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30971838)；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201601D011075)

賀飛燕(1991-)，女，山西臨汾人，在讀碩士，主要從事植物分子育種研究。

白云鳳(1957-)，女，山西呂梁人，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物分子遺傳和改良研究。

S330；Q78

A

1000-7091(2017)02-0061-05

10.7668/hbnxb.2017.02.010