胡加誼，羅志文，何 凡，李向宏，胡福初，范鴻雁，劉志昕，張治禮

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院 熱帶果樹研究所，農(nóng)業(yè)部海口熱帶果樹科學觀測實驗站，海南省熱帶果樹生物學重點實驗室，海南 ?？?571100；2.黃埔出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510730；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

同步檢測PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

胡加誼1，2，羅志文1，何 凡1，李向宏1，胡福初1，范鴻雁1，劉志昕3，張治禮1

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院 熱帶果樹研究所，農(nóng)業(yè)部海口熱帶果樹科學觀測實驗站，海南省熱帶果樹生物學重點實驗室，海南 海口 571100；2.黃埔出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510730；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101)

目前我國菠蘿產(chǎn)區(qū)已相繼報道3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3)。通過建立這3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒實時熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)同步定量檢測方法，為菠蘿凋萎病毒的定性定量研究提供技術(shù)手段。根據(jù)這3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒的外殼蛋白基因序列分別設(shè)計特異性引物和TaqMan水解探針，在優(yōu)化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR反應體系后，以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3CP基因目的片段的重組質(zhì)粒為標準品繪制標準曲線，初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR檢測方法。其中PMWaV-1標準曲線為y=-3.283logx+39.02，其擴增效率達101.7%，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999；PMWaV-2標準曲線為y=-3.393logx+37.53，其擴增效率為97.1%，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998；PMWaV-3標準曲線為y=-3.171 logx+38.48，其擴增效率為106.7%，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.996；這表明3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒質(zhì)粒標準品在同一反應體系中可穩(wěn)定擴增，且線性關(guān)系表現(xiàn)良好，可用于后續(xù)試驗。靈敏度試驗數(shù)據(jù)表明，該方法對PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低檢測線分別為99，98，868拷貝；重復性試驗表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR擴增曲線的標準差小于0.267，變異系數(shù)小于1.44%。這表明建立的三重RT-qPCR檢測方法可快速、準確、穩(wěn)定地定量檢測PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3種病毒，為PMWaV的定性定量研究和復合侵染機制的探索提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

菠蘿凋萎病；檢測方法；實時熒光定量RT-PCR；PMWaV；TaqMan探針

菠蘿凋萎病是世界上主要菠蘿產(chǎn)區(qū)最為嚴重的病害之一，也是中國最嚴重的菠蘿病害之一，調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國海南、廣東、廣西等菠蘿主產(chǎn)區(qū)均有MWP發(fā)生，在發(fā)病嚴重的菠蘿園中，植株發(fā)病率可達60%，造成25%～30%的經(jīng)濟損失。菠蘿凋萎相關(guān)病毒(Pineapplemealybugwiltassociatedvirus，PMWaV)為菠蘿凋萎病的主要致病因子，屬于長線形病毒科(Closteroviridae)葡萄卷葉病毒屬(Ampelovirus)[1-2]。目前，世界各地學者已從菠蘿植株中發(fā)現(xiàn)了5種PMWaV[3]，李運河等和吳麗亭等[4-5]在對廣東、廣西和海南等地的菠蘿樣品檢測中僅發(fā)現(xiàn)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3，而PMWaV-4 和PMWaV-5僅分別報道于夏威夷、澳大利亞[6-7]。澳大利亞的Gambley等[7]的研究發(fā)現(xiàn)PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3與菠蘿凋萎病均存在一定的相關(guān)性，且PMWaV-3與菠蘿凋萎病的相關(guān)性明顯高于PMWaV-1和PMWaV-2，而PMWaV-2早已被證明是MWP的病原之一，它與菠蘿粉蚧共同作用引起菠蘿凋萎病[8]；此外，有研究表明，PMWaV-1陽性菠蘿植株的平均單果重明顯降低、早熟果比率上升，嚴重時可導致30%的田間損失[9]。由此可見，PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3對MWP發(fā)生和危害均有著重要影響，果樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究室對海南田間的菠蘿樣品檢測結(jié)果表明MWP樣品存在明顯的復合侵染現(xiàn)象。目前，基于單一PMWaV檢測方法的建立與應用屢見報道，包括免疫電鏡、血清學方法、普通RT-PCR[6]方法和實時熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法[10-12]；也有一些學者針對幾種不同PMWaV建立起可同步檢測幾種PMWaV的方法，羅志文[13]也建立了可以同步檢測PMWaV-1、PMWaV-2和PBCoV的三重RT-PCR檢測技術(shù)。然而，可同時檢測并定量多種PMWaV的檢測方法在國內(nèi)外還未見報道，鑒于菠蘿凋萎病對我國菠蘿產(chǎn)業(yè)造成較大損失和病毒的快速定量檢測對無毒種苗篩選過程的重要性，本研究針對目前在我國屢見報道的PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3，并以海南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶果樹研究所基地的菠蘿凋萎病陽性樣品作為研究對象，針對病毒CP基因序列設(shè)計引物和探針，通過制備重組質(zhì)粒作為標準品，構(gòu)建標準曲線，初步建立并優(yōu)化了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的三重RT-qPCR檢測方法，以期為菠蘿無毒種苗繁育產(chǎn)業(yè)發(fā)展和菠蘿凋萎病毒復合侵染作用機制的揭示打下扎實的技術(shù)鋪墊。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2013年5月-2014年6月在海南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶果樹研究所和中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所進行。

1.1.1 病毒材料 試驗中用于建立PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的三重RT-qPCR檢測方法所用的PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3陽性菠蘿植株材料均由海南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶果樹研究所提供。

1.1.2 主要試劑 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(Bioteke公司)、反轉(zhuǎn)錄酶(TransGen公司)、Trans5αCell(TransGen 公司)；pMD18-T 載體(TaKaRa公司)、TaqDNA 聚合酶(TaKaRa公司)、Real Master Mix(Prob)(TaKaRa 公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(AXYGEN)、質(zhì)粒提取試劑盒(AXYGEN公司)。

1.1.3 主要設(shè)備 TP600 PCR 儀(TaKaRa公司)；MX3005 熒光PCR 儀(Stratagene公司)；NanoDrop ND-2000C 微量紫外分光光度計(Thermo公司)。

1.2 特異性引物和TaqMan探針的設(shè)計合成

根據(jù)GenBank中登錄的PMWaV-1CP基因序列的保守區(qū)域(登錄號為：HE983617、EU769114、JN995532、JN995531)、PMWaV-2CP基因序列的保守區(qū)域(登錄號為：HE983618、EU769116、JN995535、JN995534、DQ225114、JX645775、JN995533)和PMWaV-3CP基因序列的保守區(qū)域(登錄號為：JN995536、FJ209048)，分別設(shè)計擴增3種病毒CP的特異性引物和TaqMan 水解探針，用于建立PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的三重RT-qPCR檢測方法。引物和探針均由上海生工合成。引物和探針序列見表1。

表1 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3實時熒光定量RT-PCR引物和探針

1.3 三重RT-qPCR標準品的制備

參考百泰克公司多糖多酚植物總RNA 快速提取試劑盒(離心柱型)的說明書提取PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3陽性菠蘿葉RNA和PMWaV-free菠蘿葉RNA，并參照康為世紀有限公司的TransScript Ⅱ Reverse Transcriptase說明書反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，置于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。以PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3陽性的cDNA為PCR擴增模板，利用表1所列引物分別進行PCR擴增。20 μL PCR擴增反應體系包含Trangen Taq(5 U/μL)0.2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1 μL，10 × PCR Buffer(含Mg2+)2 μL，上游引物(10 μm/μL)和下游引物(10 μm/μL)各0.5 μL，cDNA 1 μL和ddH2O 14.8 μL。PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸20 s，循環(huán)35次；72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。

DNA凝膠回收試劑盒回收PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3CP基因的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物連接pMD18-T 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α Cell，然后根據(jù)3種病毒分別隨機挑取3個重組克隆，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，參照說明書提取質(zhì)粒，菌液送上海Invitrogen公司測序，并經(jīng)DNAMAN分析鑒定。利用核酸蛋白測定儀測定陽性重組質(zhì)粒的濃度，并根據(jù)公式C=A/B×6.02×1014(其中C代表質(zhì)粒濃度(單位為拷貝/μL)，A代表以O(shè)D260分析得到的濃度(單位為ng/μL)，B為質(zhì)粒DNA 的分子量)計算重組質(zhì)粒濃度的拷貝數(shù)，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 三重RT-qPCR反應體系的優(yōu)化

這個我很有體會。上周因為支氣管炎輸液，我插著針管還在用平板敲字，旁人看來一定覺得這個人真是自律啊，帶病還堅持工作。其實，我能堅持很大部分原因是寫作真的是我非常渴望非常熱愛做的事。相比而言，我在減肥上的自控力就差很多了，剛剛發(fā)完毒誓要戒甜食，轉(zhuǎn)身就安慰自己，算了，吃飽了才有力氣減……

將分別含PMWaV-1，PMWaV-2和PMWaV-3CP基因目的片段的重組質(zhì)粒稀釋相同倍數(shù)，等比例混勻為混合質(zhì)粒標準品，并以此作為三重RT-qPCR反應體系優(yōu)化的模板。根據(jù)單因子變量的原則，分別優(yōu)化三重實時RT-qPCR反應體系中的探針濃度、引物濃度和緩沖液比例。反應體系優(yōu)化設(shè)置見表2，選取三重RT-qPCR中擴增曲線Ct值最小、熒光信號最強的使用濃度作為優(yōu)化結(jié)果。

表2 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR檢測方法反應體系優(yōu)化

1.5 構(gòu)建三重RT-qPCR標準曲線

將3種病毒目的基因的重組質(zhì)粒(其中，PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3濃度分別為0.990×109，0.980×108，0.868×108拷貝/μL)等比例混成三重質(zhì)粒模板，并用超純水以10倍的梯度，稀釋三重質(zhì)粒模板，按照1.4優(yōu)化后的三重RT-qPCR反應體系進行檢測，得出檢測3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒的三重RT-qPCR標準曲線。

1.6 三重RT-qPCR檢測方法的測評

1.6.1 抗干擾測評試驗 將三重RT-qPCR擴增體系按模板成分不同分為4組，第1組的模板為PMWaV-1CP目標片段的重組質(zhì)粒(濃度：0.99×105拷貝/μL)，第2組的模板為PMWaV-2CP目標片段的重組質(zhì)粒(濃度：0.98×105拷貝/μL)，第3組的模板為PMWaV-3CP目標片段的重組質(zhì)粒(濃度：0.868×105拷貝/μL)，第4組的模板為混合質(zhì)粒標準品(105倍稀釋的重組質(zhì)粒等比例混合)，按照1.4優(yōu)化的三重RT-qPCR反應體系進行擴增試驗。

1.6.2 靈敏度測評試驗 按照1.5所述步驟制備10倍梯度稀釋的三重質(zhì)粒模板，并按照1.4優(yōu)化后的三重RT-qPCR反應體系在Mx3005熒光定量PCR儀上檢測，得出三重RT-qPCR對PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低檢測限。

1.6.3 重復性測評試驗 利用1.5所述制備三重質(zhì)粒模板，并根據(jù)1.4優(yōu)化的反應體系進行RT-qPCR檢測，每個梯度的濃度均設(shè)置3個重復，并根據(jù)各個RT-qPCR擴增曲線的Ct值計算平均Ct值、標準差(SD)和變異系數(shù)(CV)。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通RT-PCR檢測與重組質(zhì)粒測序

M.Marker DL2000；1.PMWaV-1 外殼蛋白擴增片段；2.PMWaV-1 外殼蛋白擴增陰性對照；3.PMWaV-1 外殼蛋白擴增空白對照；4.PMWaV-2 外殼蛋白擴增片段；5.PMWaV-2 外殼蛋白擴增陰性對照；6.PMWaV-2 外殼蛋白擴增空白對照；7.PMWaV-3 外殼蛋白擴增片段；8.PMWaV-3 外殼蛋白擴增陰性對照；9.PMWaV-3 外殼蛋白擴增空白對照。M.Marker DL2000；1.PMWaV-1CPgene fragment；2.PMWaV-1 negative control；3.PMWaV-1 blank control；4.PMWaV-2CPgene fragment；5.PMWaV-2 negative control；6.PMWaV-2 blank control；7.PMWaV-3CPgene fragment；8.PMWaV-3 negative control；9.PMWaV-3 blank control.

圖1 PCR擴增PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 目的片段

Fig.1 Target fragment ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3amplificated by PCR

2.2 三重RT-qPCR反應條件優(yōu)化結(jié)果

三重RT-qPCR檢測方法的優(yōu)化是為保證在同一反應體系中可同時穩(wěn)定地擴增3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒CP基因的靶標片段，從而實現(xiàn)同步、定量檢測3種菠蘿凋萎相關(guān)病毒。三重RT-qPCR反應體系的優(yōu)化結(jié)果表明，在25 μL的三重RT-qPCR反應體系中，當Premix Ex Taq(2×)為13.0 μL，PMWaV-1 目的基因上下游各360 nmol/L，PMWaV-2目的基因上下游各440 nmol/L，PMWaV-3目的基因上下游各360 nmol/L，PMWaV-1、PMWaV-2 和PMWaV-3目的基因擴增所用探針分別為320，360，320 nmol/L時，3種病毒的CP基因目的片段均可穩(wěn)定擴增(圖2)。

圖2 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重實時熒光定量RT-PCR反應體系優(yōu)化結(jié)果

2.3 三重RT-qPCR標準曲線

以質(zhì)粒標準品濃度的log值為橫坐標，實時熒光定量RT-PCR擴增曲線Ct值作為縱坐標，以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標準品作為模板進行三重RT-qPCR檢測，根據(jù)不同的擴增曲線構(gòu)建3種PMWaVs的標準曲線(圖3)。其中，PMWaV-1擴增的標準曲線是y=-3.283logx+39.02，擴增效率和線性擴增的標準曲線是y=-3.393logx+37.53，相關(guān)系數(shù)(R2)分別是101.7%和0.999；PMWaV-2擴增效率和線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別是97.1%和0.998；PMWaV-3擴增的標準曲線是y=-3.171logx+38.48，擴增效率和線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別是106.7%和0.996。試驗數(shù)據(jù)表明PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的CP基因目的片段均可在同一反應體系中穩(wěn)定擴增，且線性相關(guān)系數(shù)表現(xiàn)良好，可信度較高，可用于進一步的相關(guān)試驗。

圖3 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR標準曲線構(gòu)建

2.4 三重RT-qPCR檢測方法的測評結(jié)果

2.4.1 抗干擾性測評結(jié)果 三重RT-qPCR抗干擾試驗結(jié)果表明，在三重實時熒光定量RT-PCR反應體系中只加入單一病毒目的基因的重組質(zhì)粒模板和同時加入3種病毒目的基因的重組質(zhì)粒模板進行檢測，相同病毒在不同反應體系下的擴增曲線都較為接近(圖4)，而Ct值差距均在1.48之內(nèi)(表3)。

2.4.2 靈敏度測評結(jié)果 實時熒光定量研究中，當Ct值大于35時，定量檢測結(jié)果不準確，可視為陰性14-15，所以，由圖5可以看出，三重RT-qPCR檢測方法對PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的最低檢測限分別為99，98，868拷貝/μL(圖5)。這表明本研究初步建立的三重實時熒光定量RT-PCR檢測方法對PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3都具有良好的靈敏度。

圖4 實時熒光定量RT-PCR檢測方法抗干擾試驗

表3 三重RT-qPCR檢測方法抗干擾試驗數(shù)據(jù)

Tab.3 The anti-interference test data of triple RT-qPCR

試驗模板 Template Ct值(PMWaV-1檢測)CtofdetectingPMWaV-1Ct值(PMWaV-2檢測)CtofdetectingPMWaV-2Ct值(PMWaV-3檢測)CtofdetectingPMWaV-3pMDTM-18T-PMWaV-1-CP19.41--pMDTM-18T-PMWaV-2-CP-17.71-pMDTM-18T-PMWaV-3-CP--20.28混合質(zhì)粒模板(3種病毒)19.5418.5318.80Mixedplasmidtemplate(3PMWaVs)

圖5 三重RT-qPCR檢測方法的靈敏度試驗

2.4.3 重復性 三重RT-qPCR檢測方法重復性試驗的結(jié)果表明，試驗設(shè)置的3個濃度梯度，每個濃度的3次重復中，含PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3目的片段的三重混合質(zhì)粒模板均能獲得穩(wěn)定擴增。由表4可見，RT-qPCR擴增曲線Ct值的分析結(jié)果表明，三重實時熒光定量RT-PCR擴增曲線的Ct值標準差(SD)都在0.267以內(nèi)，變異系數(shù)(CV)都在1.44%以內(nèi)，這說明本研究建立的三重實時熒光定量檢測方法穩(wěn)定性良好。

3 討論與結(jié)論

3.1 PMWaV檢測技術(shù)

PMWaV是菠蘿凋萎病的主要病原物之一，為減少菠蘿凋萎病造成的田間損失，專家學者們針對PMWaV研發(fā)出一系列檢測手段，包括免疫電鏡檢測[16]、酶聯(lián)免疫吸附[17]、組織免疫印記[18]和RT-PCR等方法。相對于前人的研究只專注于病毒的定性分析和單一病毒的定量分析，本研究建立的三重實時熒光定量RT-PCR方法不僅可在同一反應體系中同時定性檢測PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3，還可根據(jù)構(gòu)建的標準曲線對3種病毒進行定量分析。根據(jù)文獻檢索結(jié)果，本研究首次報道同步定量檢測PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-PCR方法，為PMWaV的定性定量分析提供技術(shù)基礎(chǔ)，也豐富了PMWaV的檢測技術(shù)體系。

表4 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重實時熒光定量RT-PCR檢測方法重復性試驗統(tǒng)計結(jié)果

3.2 多重RT-qPCR反應體系優(yōu)化

多重實時熒光定量RT-PCR技術(shù)是指可在同一反應體系中同時擴增數(shù)個不同的片段，從而實現(xiàn)對不同種類的植物病毒進行同步定性定量分析。反應體系的優(yōu)化是多重實時熒光定量PCR檢測方法建立的關(guān)鍵技術(shù)之一，因為在同一個反應體系里同時擴增不同的靶標片段，這一反應體系里不僅需要常規(guī)PCR中的反應因子(如DNA聚合酶、緩沖液、dNTPs等)，還需要在這一反應體系中具有不同目標基因片段的不同模板，還有針對各個靶標基因的引物和探針等。同一反應體系中多個引物和探針形成二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)的概率明顯增高，而多重RT-qPCR的擴增效率也易被影響。郭立新等[19]在試驗中優(yōu)化了實時熒光定量PCR的模板、Mg2+、引物和探針等因子的使用濃度，使其更有效的應用于蘋果莖溝病毒的定量、定性檢測。Henegariu等[20]通過多個試驗研究PCR反應因子(包括使用濃度、退火溫度等)對多重PCR的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物的濃度、緩沖液用量和退火溫度等因子均對多重PCR的反應效率有影響。Johnson等[21]在建立同步定量檢測番茄細菌性潰瘍病病原菌和鳳果花葉病毒的雙重qPCR技術(shù)時，發(fā)現(xiàn)引物和探針使用濃度比例對目標基因的擴增效率影響較大，而探針濃度對目標片段的擴增效率沒有影響，但是探針與引物濃度的比率對擴增效率影響很大。參照前人的研究策略，本研究在建立PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR檢測方法的過程中，著重優(yōu)化了三重RT-qPCR反應體系中的探針濃度、緩沖液濃度和引物濃度。優(yōu)化后的三重RT-qPCR反應體系可穩(wěn)定地擴增目標病毒的靶標片段，且3種病毒目標片段的擴增效率均符合Arezi等[22]提出的合理擴增效率(80%～115%)，可用于同步定量檢測PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3。

本研究根據(jù)PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的CP基因分別設(shè)計引物和TaqMan探針(攜帶不同熒光標記)，通過制備重組質(zhì)粒標準品和優(yōu)化反應體系，初步建立PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR檢測方法，可用于PMWaV-1、PMWaV-2，PMWaV-3 3種病毒快速同步定量檢測。本方法的初步建立可為菠蘿無毒種苗生產(chǎn)過程中的病毒快速定性定量檢測技術(shù)的進一步研發(fā)和改進提供試驗基礎(chǔ)，也可為菠蘿凋萎病毒復合侵染作用機制的進一步研究提供技術(shù)支持。

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Establishment of a Triple RT-qPCR Method for the Simultaneous Detecting ofPMWaV-1，PMWaV-2 andPMWaV-3

HU Jiayi1，2，LUO Zhiwen1，HE Fan1，LI Xianghong1，HU Fuchu1，F(xiàn)AN Hongyan1，LIU Zhixin3，ZHANG Zhili1

(1.Institute of Tropical Fruit Trees in Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees in Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology of Hainan Province，Haikou 571100，China；2.Huangpu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureua，Guangzhou 510730，China；3.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China)

The objective of this paper was to provide a technique for quantitative and quanlitative studies of PMWaV by establishing the method of Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR(RT-qPCR)for simultaneous quantitative detection ofPMWaV-1，PMWaV-2 andPMWaV-3.Primers and probes were designed and synthesized according to theCPgene ofPMWaV-1，PMWaV-2 andPMWaV-3，respectively.After optimized the reaction system of triple RT-qPCR，the standard curves were generated by purified DNA of the recombined plasmid ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 coat protein gene，respectively.And the method of RT-qPCR for the simultaneous detection ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 had been improved.The amplification efficiency ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 in the RT-qPCR method was up to 101.7%，97.1%，106.7%，respectively.Meanwhile ，with theR2between 0.996 and 0.999.The sensibility test of triple RT-qPCR syetem showed the detection limit of quantification forPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 was 99，98 and 868 copies，respectively.Moreover，repeats experiment datas showed that standard deviation was below 0.26 and variable coefficient was below 1.44%.This study indicated that the method for simultaneous detection and quantification ofPMWaV-1，PMWaV-2，PMWaV-3 was a fast，sably and sensitive reaction system，which could be the technological base for quantitative and quanlitative studies ofPMWaV.

Mealybug Wilt of Pineapple；Dctection method；RT-qPCR；PMWaV；TaqMan probe

2017-01-20

海南省重點研發(fā)項目(ZDYF2016035)； 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201203021)；國家自然科學基金項目(31260460)

胡加誼(1988-)，男，廣東梅州人，研究實習員，碩士，主要從事果樹植物病理學研究。

張治禮(1970-)，男，安徽臨泉人，研究員, 博士，主要從事果樹生理與分子生物學研究。

S432.4；Q78

A

1000-7091(2017)02-0038-07

10.7668/hbnxb.2017.02.003