甕巧云，黃聰聰，王 娜，梁晨曦，劉高然，郝叢叢，邢繼紅，董金皋

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000)

擬南芥抗灰霉病基因T1N6-22互作蛋白的篩選與分析

甕巧云1，2，黃聰聰1，王 娜1，梁晨曦1，劉高然1，郝叢叢1，邢繼紅1，董金皋1

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001；2.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000)

前期研究中從擬南芥突變體庫(kù)中篩選獲得一株對(duì)灰霉病菌侵染表現(xiàn)為感病的突變體。利用TAIL-PCR等技術(shù)克隆獲得擬南芥抗灰霉病基因T1N6_22。為了進(jìn)一步明確T1N6_22在擬南芥抗灰霉病過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制，利用酵母雙雜交技術(shù)(Y2H)，以構(gòu)建成功的pAS1/T1N6_22蛋白為誘餌，篩選擬南芥的cDNA文庫(kù)。通過(guò)酵母雙雜交篩選，共獲得28個(gè)酵母克隆。利用T1N6_2基因特異性引物鑒定酵母陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行測(cè)序。共獲得了4個(gè)可能與T1N6_22互作的蛋白AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400。Blast分析發(fā)現(xiàn)，AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400分別為核小體裝配蛋白、功能未知蛋白、假定的泛酸還原酶和硫胺二磷酸鹽結(jié)合折疊超家族蛋白，分別參與到核糖體裝配、泛酸鹽合成、植物代謝等過(guò)程中。研究結(jié)果為確定T1N6_22蛋白的互作蛋白，闡明其調(diào)控?cái)M南芥抗灰霉病的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

擬南芥；T1N6_22；酵母雙雜交；互作蛋白

灰霉病是一種菌物性病害，其病原為有絲分裂真菌的葡萄孢屬灰葡萄孢(Botrytiscinerea)。該病發(fā)生和流行時(shí)能夠降低植物的產(chǎn)量及品質(zhì)，影響農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入[1-3]。利用化學(xué)防治是目前生產(chǎn)中控制灰霉病的主要措施。然而隨著長(zhǎng)期、大量、頻繁使用化學(xué)藥劑不僅在環(huán)境、植物產(chǎn)品中引起農(nóng)藥殘留現(xiàn)象，污染大氣和土壤環(huán)境，危害人類(lèi)健康，而且灰葡萄孢極易發(fā)生變異，導(dǎo)致病菌的抗藥性增強(qiáng)[4]。因此，發(fā)掘抗灰霉病基因，培育抗灰霉病植物是目前防治灰霉病的最經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的方法。

關(guān)于抗灰霉病基因的克隆及功能分析在擬南芥中研究的較為深入。迄今為止，已經(jīng)獲得了ERF1、MYB30、BOS1等20多個(gè)擬南芥抗灰霉病相關(guān)基因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已克隆擬南芥抗灰霉病相關(guān)基因調(diào)控?cái)M南芥的抗病性多數(shù)是通過(guò)激活水楊酸(SA)或茉莉酸/乙烯(JA/ET)信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。如擬南芥ERF1位于ET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游，能夠調(diào)控防衛(wèi)反應(yīng)基因b-CHI、PDF1.2等的表達(dá)[5]；擬南芥R2R3-MYB類(lèi)型轉(zhuǎn)錄因子AtMYB30位于SA調(diào)控途徑的下游。該基因表達(dá)能夠促進(jìn)水楊酸合成、積累，從而激發(fā)植物產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)[6-7]；擬南芥突變體bos1對(duì)灰葡萄孢侵染更加敏感，但對(duì)丁香假單胞桿菌抗性增強(qiáng)。功能研究表明BOS1基因參與JA誘導(dǎo)的抗病途徑[8]；擬南芥bos2、bos3和bos4是3個(gè)對(duì)灰霉病菌侵染表現(xiàn)感病的突變體。3個(gè)突變體受灰霉病菌侵染后，PDF1_2基因(JA/ET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑標(biāo)志基因)的表達(dá)均受到明顯的影響。功能互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果表明BOS2、BOS3和BOS4基因的表達(dá)能夠調(diào)控植株體內(nèi)植保素合成，進(jìn)而影響擬南芥對(duì)灰葡萄孢的抗病性[9]；BIK1基因(Botrytis-induced kinase1)定位于膜上，受灰葡萄孢侵染后誘導(dǎo)表達(dá)。接種灰霉病菌后，bik1植株表現(xiàn)為嚴(yán)重感病癥狀，但對(duì)丁香假單孢桿菌番茄致病變種無(wú)毒菌株的侵染卻表現(xiàn)為抗性增強(qiáng)。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，bik1突變體中PDF1.2基因表達(dá)受到抑制[10]。

真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期研究中，克隆獲得一個(gè)新的擬南芥抗灰霉病基因T1N6_22。T1N6_22編碼蛋白屬于短鏈脫氫/還原酶家族蛋白(Short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)，含有NADB_Rossmann保守結(jié)構(gòu)域。利用功能互補(bǔ)試驗(yàn)已明確在灰葡萄孢侵染擬南芥過(guò)程中，T1N6_22基因起正調(diào)控作用。同時(shí)SA處理擬南芥后，能夠誘導(dǎo)T1N6_22基因的表達(dá)[11]。為了進(jìn)一步研究T1N6_22基因在擬南芥抗灰霉病過(guò)程中的作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了T1N6_22基因的酵母誘餌表達(dá)載體pAS1/T1N6_22，利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選擬南芥cDNA文庫(kù)，以期獲得能夠與擬南芥抗灰霉病基因T1N6_22互作的蛋白，為確定T1N6_22蛋白的互作蛋白及其調(diào)控?cái)M南芥對(duì)灰霉病菌侵染的抗性機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥野生型Columbia(Col-0)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；擬南芥cDNA文庫(kù)CD4-22、酵母菌株Y190、E.coli菌株LE392和BNN132購(gòu)于擬南芥種質(zhì)資源中心(ArabidopsisBiological Resource Center，ABRC)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1T1N6_22基因誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建 利用Primer 5.0軟件，根據(jù)擬南芥抗灰霉病基因T1N6_22的CDS序列和pAS1的載體序列設(shè)計(jì)基因特異性引物。引物序列為F：5′-CCCGGGTTTGAGATTTGCAGGCAACTAG-3′(下劃線：SmaⅠ的酶切位點(diǎn))和R：5′-GTCGACTTTAGGGACCAAAGCCAGTTTC-3′(下劃線：SalⅠ的酶切位點(diǎn))。以擬南芥野生型Col-0的第一鏈cDNA為模板，克隆T1N6_22的CDS序列。將測(cè)序正確的T1N6_22基因序列與pAS1載體連接，構(gòu)建誘餌表達(dá)載體pAS1/T1N6_22。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化 將pAS1/T1N6_22誘餌載體與pAS1空載體通過(guò)PEG/LiAC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，分別轉(zhuǎn)入Y190菌株中，涂布SD/-Trp培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)。利用基因的特異性引物，通過(guò)PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3T1N6_22基因誘餌表達(dá)載體的自激活檢測(cè) 利用含有3-AT的二缺培養(yǎng)基(SD/-Trp-His)，進(jìn)行誘餌載體的自激活檢測(cè)。選取直徑為2～3 mm的酵母單克隆，用20 μL無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋后，吸取1.5 μL菌液滴加到3-AT濃度分別為0，5，10，50，100，200 mmol/L的二缺培養(yǎng)基上(SD/-Trp-His)，30 ℃培養(yǎng)條件下，倒置培養(yǎng)3 d。通過(guò)觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)，從而確定載體的自激活活性。

1.2.4 擬南芥cDNA文庫(kù)的擴(kuò)繁和制備 將含有擬南芥cDNA文庫(kù)的噬菌體(100 μL)加入到300 μL的LE392中，混勻后37 ℃靜置15 min，加入6 mL 0.7%的瓊脂糖，混勻后倒入LB固體培養(yǎng)基(含0.2%麥芽糖)上，37 ℃倒置培養(yǎng)6～8 h，即有噬菌斑產(chǎn)生。將噬菌體(108pfu)加到E.coliBNN132菌株感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)30 min；然后再加入2 mL LB液體培養(yǎng)基，置于30 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)(220 r/min)1 h；涂布于LB固體培養(yǎng)基上(含50 μg/mL Amp和0.2%葡萄糖)，37 ℃過(guò)夜；選取陽(yáng)性的單一克隆，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取擬南芥cDNA文庫(kù)的質(zhì)粒。

1.2.5 T1N6_22蛋白的互作蛋白篩選與分析 將cDNA文庫(kù)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化含pAS1/T1N6_22的酵母Y190中，涂于SD/-Trp-His-Leu培養(yǎng)基(含100 mmol/L 3-AT)上，置于30 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。選取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA。利用pACT質(zhì)粒引物pACT-F(5′-CTATCTATTCGATGATGAAG-3′)及pACT-R(5′-ACAGTTGAAGTGAACTTGCG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定陽(yáng)性克隆?；厥贞?yáng)性克隆，進(jìn)行轉(zhuǎn)化和測(cè)序(上海生工)。利用生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)所獲得的序列進(jìn)行分析，明確基因類(lèi)型及其功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 T1N6_22基因誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建

以擬南芥野生型Col-0第一鏈cDNA為模板，利用T1N6-22基因的特異引物擴(kuò)增基因的CDS序列。圖1-A為檢測(cè)結(jié)果，表明擴(kuò)增獲得條帶與目的片段大小(786 bp)一致。將目的條帶進(jìn)行回收，進(jìn)行克隆和測(cè)序。用SmaⅠ和SalⅠ對(duì)測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒和pAS1質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，分別回收目的條帶。圖1-B、C為雙酶切鑒定結(jié)果，可以看出經(jīng)雙酶切后均獲得2個(gè)條帶，條帶大小分別與T1N6-22基因和載體大小一致。表明pAS1/T1N6_22載體構(gòu)建成功。

A.目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；B.雙酶切(Sma Ⅰ和Sal Ⅰ)驗(yàn)證結(jié)果；C.pAS1/T1N6_22載體圖譜。A.Gene amplification；B.Enzyme digestion analysis；C.Map of vector pAS1/T1N6_22.

2.2 誘餌表達(dá)載體的酵母轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建成功誘餌表達(dá)質(zhì)粒pAS1/T1N6_22通過(guò)醋酸鋰(LiAc)小量轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母菌Y190。以陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA為模板，利用T1N6_22基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)化子。圖2為檢測(cè)結(jié)果，表明pAS1/T1N6_22質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。

M.DNA Marker；1,2.pAS1/T1N6_22轉(zhuǎn)化子；3.pAS1轉(zhuǎn)化子。M.DNA Marker；1，2.pAS1/T1N6_22 transformants；3.pAS1 transformant.

2.3 pAS1/T1N6_22載體的自激活活性檢測(cè)

將含pAS1/T1N6_22質(zhì)粒載體的Y190酵母菌株接種到含不同濃度3-AT的二缺培養(yǎng)基上(SD/-Trp-His)，于30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。圖3為培養(yǎng)結(jié)果，酵母Y190(pAS1/T1N6_22)在含有100 mmol/L的3-AT的培養(yǎng)基能夠正常生長(zhǎng)，而在250 mmol/L的3-AT培養(yǎng)基上酵母菌Y190(pAS1/T1N6_22)生長(zhǎng)受到明顯抑制。表明擬南芥T1N6_22蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性很強(qiáng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)培養(yǎng)基中添加3-AT的濃度高于100 mmol/L時(shí)對(duì)酵母菌株具有毒性，因此，在本試驗(yàn)中培養(yǎng)基中添加3-AT濃度均為100 mmol/L。

圖3 pAS1/T1N6_22的自激活活性檢測(cè)結(jié)果

2.4 T1N6_22蛋白的互作蛋白篩選

通過(guò)篩選擬南芥cDNA文庫(kù)，在SD/-Trp-His-Leu培養(yǎng)基上(含100 mmol/L 3-AT)共獲得了28個(gè)酵母克隆(圖4-A)。將陽(yáng)性克隆挑于三缺液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)2 d。以提取的酵母質(zhì)粒DNA為模板，利用基因特異性引物pACT-F和pACF-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖4-B為擴(kuò)增結(jié)果，分別將目的條帶進(jìn)行回收、轉(zhuǎn)化和測(cè)序。

A.篩選文庫(kù)所獲得的陽(yáng)性克??；B.陽(yáng)性克隆的PCR鑒定。A.Positive clones screened from the cDNA library；B.PCR identification of the positive clones.

2.5 T1N6_22蛋白互作蛋白的功能分析

利用Blast軟件，將篩選獲得的互作蛋白序列與NCBI中的已知蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析。表1為分析結(jié)果。根據(jù)分析結(jié)果初步推測(cè)4個(gè)蛋白(基因ID分別為AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400)可能與T1N6_22蛋白具有相互作用。AT2G19480基因編碼核小體裝配蛋白，具有DNA修復(fù)、核糖體裝配、參與鎘離子信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程等功能[12]；AT1G06050基因編碼功能未知的蛋白；AT5G34780基因編碼泛酸還原酶，定位于線粒體，具有氧化還原酶活性，參與泛酸鹽合成過(guò)程[13]；AT1G21400基因編碼硫胺二磷酸鹽結(jié)合折疊超家族蛋白，具有氧化還原酶活性、作用于受體的醛基或氧基等功能，參與到植物代謝途徑中[14-15]。

表1 T1N6_22蛋白互作蛋白的功能分析

3 討論

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用構(gòu)成了細(xì)胞生化反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，促使蛋白質(zhì)分子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song首次建立，利用該方法可以從cDNA文庫(kù)中直接篩選到與已知蛋白質(zhì)具有相互作用的蛋白質(zhì)。目前該方法已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)互作研究中。如在水稻抗病蛋白篩選中，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選獲得了Pita的互作蛋白為Avr-Pita蛋白，Pita通過(guò)與Avr-Pita蛋白LRR區(qū)域結(jié)合進(jìn)而發(fā)生相互作用[16]；擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtMYB73參與調(diào)控?cái)M南芥響應(yīng)干旱、低溫和鹽脅迫過(guò)程中[17]。樊錦濤等[18]構(gòu)建了AtMYB73的酵母誘餌表達(dá)載體，從擬南芥cDNA文庫(kù)中篩選獲得了與MYB73互作的蛋白F12F1.4；王加峰等[19]以水稻抗稻瘟病基因Pik-h的2個(gè)緊密連鎖且功能獨(dú)立的 Pikh-1 和Pikh-2 蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)從水稻葉片靶標(biāo)cDNA文庫(kù)中獲得18個(gè)與 Pikh-1、Pikh-2具有互作的蛋白。孫海桃等[20]利用酵母雙雜交技術(shù)從小麥cDNA文庫(kù)中篩選獲得了TaDREB6的互作蛋白，功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明TaDREB6可能參與了多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在抗逆境調(diào)控中具有重要作用；Vander等[21-22]通過(guò)酵母雙雜交分析，明確了EIL3蛋白與MYB72具有相互作用，MYB72蛋白在ET介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用。本研究以構(gòu)建成功的載體pAS1/T1N6_22為誘餌，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選擬南芥cDNA文庫(kù)。共獲得4個(gè)可能與T1N6_22具有相互作用的蛋白(編碼基因分別為AT2G19480、AT1G06050、AT5G34780和AT1G21400)。功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，篩選獲得的互作蛋白分別參與到核糖體裝配、泛酸鹽合成、植物代謝等多種過(guò)程中，推測(cè)T1N6_22基因是通過(guò)參與多種過(guò)程調(diào)控?cái)M南芥的抗病性核糖體蛋白是蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中的重要分子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗病、抵抗逆境脅迫等過(guò)程起著重要作用。Wu等[23]研究已證實(shí)核糖體RPL15和RPL4基因參與花生抗青枯病菌侵染過(guò)程中；王立豐等[24]從巴西橡膠樹(shù)中克隆獲得了核糖體HbRPL14基因。利用熒光定量分析技術(shù)證實(shí)了核糖體HbRPL14基因可以受逆境調(diào)控。在干旱、機(jī)械傷害和白粉菌侵染過(guò)程中，該基因的表達(dá)量顯著增加。核糖體HbRPL14基因表達(dá)后通過(guò)增加植株體內(nèi)核糖體蛋白的含量來(lái)調(diào)控橡膠樹(shù)對(duì)干旱等逆境的響應(yīng)；曹廣英等[25]采用熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)發(fā)現(xiàn)花生核糖體基因RPL29-1在青枯菌脅迫0.5 h表達(dá)量增加并達(dá)到最大值，從而表明該基因在花生抗青枯病過(guò)程中發(fā)揮作用；Kim等[26]在經(jīng)低溫處理3 d后的大豆中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)表達(dá)量增加的核糖體基因GmRPS13、GmRPS6和GmRPL373。推測(cè)3個(gè)核糖體基因表達(dá)量增加能夠促進(jìn)蛋白翻譯過(guò)程或協(xié)助核糖體功能正常發(fā)揮，從而提高了大豆抗低溫脅迫能力。本研究中獲得的與T1N6_22蛋白互作的AT2G19480編碼核小體裝配蛋白，參與核糖體裝配過(guò)程。由此可以推測(cè)擬南芥T1N6_22與AT2G19480互作通過(guò)促進(jìn)核糖體蛋白的合成來(lái)調(diào)控?cái)M南芥對(duì)灰霉病菌的抗性，但這還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

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Screening and Analysis of Interacting Proteins ofT1N6_22 Gene fromArabidopsisAgainstBotrytiscinerea

WENG Qiaoyun1，2，HUANG Congcong1，WANG Na1，LIANG Chenxi1，LIU Gaoran1，HAO Congcong1，XING Jihong1，DONG Jingao1

(1.Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China；2.College of Agriculture and Forestry Science and Technology，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China)

Botrytissusceptible mutant namedT1N6_22 was achieved fromArabidopsismutant library.Through the method of TAIL-PCR，resistance-related geneT1N6_22 ofArabidopsisthalianaagainstBotrytiscinereainfection was cloned.In order to further clarify the regulation mechanism ofT1N6_22 gene inArabidopsisthalianaagainstBotrytiscinereainfection，vector pAS1/T1N6_22 ofT1N6_22 gene was constructed.Taking pAS1/T1N6_22 fusion protein as bait，ArabidopsiscDNA library were screened by the method of yeast two-hybrid system.A total of 28 yeast clones were obtained by yeast two hybrid screening.The positive clones were identified byT1N6_22 gene specific primers and sequenced.Four interacting proteins(AT2G19480，AT1G06050，AT5G34780 and AT1G21400)were obtained by screeningArabidopsiscDNA library.Blast analysis showed that four interacting proteins encoded nucleosome assembly protein，function unknown protein，putative ketopantoate reductase，and oxidoreductase，respectively.These interacting proteins were related to process，biosynthesis of pantothenate，and plant metabolic process.These results would provide foundation for identifying interacting protein of T1N6_22 and clarifying the regulation mechanism ofT1N6_22 gene inArabidopsisresistance.

Arabidopsis；T1N6_22；Yeast two-hybrid；Interacting protein

2017-01-15

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2014405010)

甕巧云(1979-)，女，河北張家口人，副教授，博士，主要從事植物抗逆機(jī)制研究。甕巧云、黃聰聰為同等貢獻(xiàn)作者。

邢繼紅(1977-)，女，河北東光人，教授，博士，主要從事分子植物病理學(xué)研究。 董金皋(1963-)，男，河北平鄉(xiāng)人，教授，博士，主要從事植物病理學(xué)研究。

Q78；S432

A

1000-7091(2017)02-0045-05

10.7668/hbnxb.2017.02.007