杜兵耀，文芳，臧長江，邵偉，李昊，張養(yǎng)東，楊開倫，余雄，姜金斗，鞏軍

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（哈爾濱），哈爾濱150090)

氯霉素ELISA可視化微陣列芯片檢測試劑盒評價(jià)研究

杜兵耀1,2，文芳2，臧長江1，邵偉1，李昊1，張養(yǎng)東2，楊開倫1，余雄1，姜金斗3，鞏軍3

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193；3.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（哈爾濱），哈爾濱150090)

為了了解氯霉素ELISA可視化微陣列芯片檢測試劑盒的有效性和可靠性，從靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、可重復(fù)性、檢出限、耐變性、批間變異等方面進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明該試劑盒在測試范圍內(nèi)線性回歸良好，相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0.9943，與結(jié)構(gòu)相似的甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反應(yīng)率均小于1%，批間變異系數(shù)小于20%，牛奶中的平均回收率為108.5%，檢出限為0.067 μg/L，該試劑盒有較好的準(zhǔn)確性、特異性與重復(fù)性，耐變性與批間變異均在可接受范圍內(nèi)，可用于牛奶樣品中氯霉素的殘留檢測。

氯霉素；ELISA；試劑盒；評價(jià)

0 引言

氯霉素(Chloramphenicol,CAP)是廣泛應(yīng)用的廣譜抗菌劑，具有良好的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性能，且價(jià)格低廉，常用于治療傳染性動(dòng)物疾病。但由于氯霉素存在嚴(yán)重的副作用，能導(dǎo)致嚴(yán)重的慢性毒性反應(yīng)、骨髓抑制、再生障礙性貧血等疾病，得到廣泛的關(guān)注，世界各國已明令禁止使用[1-5]。因此，快速、靈敏的方法用以檢測牛奶中的氯霉素殘留是極其重要的。傳統(tǒng)的儀器分析方法費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜、前處理過程繁瑣[6]。相反，ELISA檢測方法由于操作簡單、快速、便攜、成本低而得到廣泛的應(yīng)用。因此氯霉素的ELISA試劑盒的質(zhì)量保障顯得尤其重要。鑒于國家試劑盒的生產(chǎn)者、使用者、監(jiān)管者對試劑盒評價(jià)的迫切需要，選擇了與食品質(zhì)量安全息息相關(guān)的試劑盒進(jìn)行檢測指標(biāo)的評價(jià)研究，依托商品化食品檢測試劑盒評價(jià)方法驗(yàn)證指南[7]，并參照農(nóng)業(yè)部關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測試劑（盒）管理的通知等[8-9]，從檢出限、選擇性、回收率與準(zhǔn)確度、耐變性、批間差異與穩(wěn)定性等方面進(jìn)行評價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

天平（XS205，AL204），芯片掃描儀（MRS-4800QA），渦旋振蕩器（Vortex-Genie2），恒溫震蕩孵育器（MTS-2）,超低溫冰箱（BCD-649WADV）,ELISA可視化微陣列芯片檢測試劑盒。

氯霉素，甲砜霉素，氟甲砜霉素，恩諾沙星，四環(huán)素，鏈霉素，林可霉素，頭孢氨芐，紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品。乙酸乙酯、正己烷（均為分析純），氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，終止液，復(fù)溶工作液，洗滌工作液。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

稱取1.00 g±0.05 g均質(zhì)樣品至15 mL聚苯乙烯離心管中，加入6 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩混勻，在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。移取3 mL上層的乙酸乙酯至10 mL干凈干燥的玻璃試管中，于50℃條件下氮?dú)獯蹈?。然后加? mL正己烷，渦旋震蕩1 min，再加入0.5 mL復(fù)溶工作液，渦旋震蕩3 min后，在10 000 r/min條件下離心5 min，除去上層有機(jī)相，取下層水相25 μL，待檢。

1.2.2 檢測步驟

依次加入25 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和25 μL抗體工作液到各自的微孔中，輕輕混勻，25℃（600 r/min）條件下反應(yīng)45 min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μL/孔，充分洗滌3次，每次間隔10 s。加入二抗工作液50 μL/孔，輕輕混勻，37℃(600 r/min）條件下反應(yīng)30 min。顯色液A和B按照1∶1的比例混勻，每孔加入混合的顯色液50 μL，37℃（600 r/min）避光的條件下反應(yīng)12 min。將顯色后的芯片放入芯片分析儀中獲取圖像，用芯片專用軟件進(jìn)行自動(dòng)化分析，自動(dòng)生成結(jié)果報(bào)告。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

精密稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇將其溶解得1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存，用緩沖液將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，使氯霉素的質(zhì)量濃度為0，0.03，0.10，0.30，0.90，2.70 μg/L；按步驟1.2.2進(jìn)行檢測。每種質(zhì)量濃度做2個(gè)平行，6個(gè)平行分3 d進(jìn)行，對照組為不加任何藥物的樣品稀釋液。

1.2.4 選擇性的測定

用不含氯霉素的牛奶按1.2.1步驟進(jìn)行樣品前處理，所得溶液分別用以配制氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對照組為不加任何藥物的空白溶液分別配制的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，氯霉素的質(zhì)量濃度水平分別為0.03，0.1，0.3，0.9，2.7 μg/L；并按1.2.2步驟測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線和IC50值。分別配制氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度水平分別為0.03，0.1，0.3，0.9，2.7 μg/L；甲砜霉素、氟甲砜霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度水平為0，1，3，9，27，81 μg/L；質(zhì)量濃度水平分別為0，1.5，5，15，45，120 μg/L；并按1.2.2步驟測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線和IC50值。

1.2.4.1 基質(zhì)的選擇性

配制氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使氯霉素的質(zhì)量濃度為0，0.03，0.10，0.30，0.90，2.70 μg/L；分別用10種不同的基質(zhì)配制加標(biāo)的樣品，添加質(zhì)量濃度為0.5 μg/L)，每種基質(zhì)3個(gè)平行，對照組為不加任何藥物的樣品稀釋液。按步驟1.2.2進(jìn)行檢測。

1.2.4.2 藥物的選擇性

配制氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使氯霉素的質(zhì)量濃度為0，0.03，0.10，0.30，0.90，2.70 μg/L；分別配制恩諾沙星：100 μg/L，四環(huán)素100 μg/L，鏈霉素200 μg/L，林可霉素150 μg/L，頭孢氨芐100 μg/L，紅霉素40 μg/L的加標(biāo)樣品，每種藥物3個(gè)平行，對照組為不加任何藥物的樣品稀釋液。按步驟1.2.2進(jìn)行檢測。

1.2.5 準(zhǔn)確度與重復(fù)性的測定

采用樣品加標(biāo)進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，樣品按照1.2.1步驟進(jìn)行處理，對6個(gè)質(zhì)量濃度水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，氯霉素的質(zhì)量濃度水平分別為0，0.1，0.3，0.5，1；每個(gè)水平8個(gè)平行，按1.2.2步驟檢測。

1.2.6 耐變性的測定

氯霉素添加質(zhì)量濃度為0.5 μg/L，每種測試條件8平行。進(jìn)行4因素2水平的正交檢測。A：7 mL乙酸乙酯；a：5 mL乙酸乙酯；B：20℃；b：30℃；C：40 min；c：50 min；D：4次；d：2次。按1.2.1和1.2.2步驟進(jìn)行前處理和檢測。

1.2.7 穩(wěn)定性的測定

分別取3個(gè)不同批次的試劑盒對樣品進(jìn)行檢測，樣品按照1.2.1步驟進(jìn)行處理，氯霉素添加質(zhì)量濃度為0.5 μg/L，每批試劑盒8平行，按1.2.2步驟檢測。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

對3 d的重復(fù)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其擬合方程為

式中：x為質(zhì)量濃度值；y為對應(yīng)信號值。氯霉素半抑制質(zhì)量濃度(IC50值)為0.206 μg/L，用來衡量抗體靈敏度的半抑制率越低，說明抗體靈敏度越高。

圖1 氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 選擇性驗(yàn)證

2.2.1 同類藥物的選擇性驗(yàn)證

根據(jù)檢測結(jié)果繪制氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及甲砜霉素、氟甲砜霉素的工作曲線，并計(jì)算半抑制率IC50值，根據(jù)各藥物的IC50值計(jì)算交叉反應(yīng)率，計(jì)算公式為：氯霉素的交叉反應(yīng)率=IC50值(氯霉素)/IC50值(各藥物)×100%，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，氯霉素與甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反應(yīng)率均低于1%，這說明該試劑盒對氯霉素有很強(qiáng)的特異性，其他藥物對試驗(yàn)的干擾也很小。

表1 幾種結(jié)構(gòu)類似物對氯霉素的交叉反應(yīng)率

2.2.2 不同基質(zhì)的選擇性

檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，檢測值在0.28～0.87 μg/L之間，平均值為0.614，計(jì)算出變異系數(shù)為10%。說明不同的基質(zhì)對檢測結(jié)果影響不大。

圖2 不同基質(zhì)的選擇性

2.2.3 不同藥物的選擇性

測定結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，測定結(jié)果在0.03～0.06 μg/L之間，均為小于0.1，說明其他藥物對檢測結(jié)果影響不大，不宜作為可顯著影響檢測結(jié)果的因素。

表2 不同藥物的選擇性μg/L

2.3 回收率的驗(yàn)證

根據(jù)檢測結(jié)果分別繪制氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回收率，回收率的計(jì)算公式如下：回收率=(加標(biāo)樣品測定值-空白樣品測定值)/加標(biāo)值，結(jié)果如表3所示。

表3 加標(biāo)回收率

由表3可以看出，氯霉素的回收率在90%～126%，平均回收率為108.5%，變異系數(shù)在7%～26%，平均變異系數(shù)為15%，在樣品的氯霉素加標(biāo)回收率的試驗(yàn)中，變異系數(shù)均在可允許的范圍內(nèi)波動(dòng)，說明該檢測試劑盒有較好的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，可以用于牛奶的檢測。

2.3.2 檢測限LOD

以20份空白樣品測定的值的平均值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算出檢測限。經(jīng)計(jì)算得，牛奶樣品的檢測限是0.067 μg/L

2.4 耐變性

測定結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，測定結(jié)果在0.42～0.58 μg/L之間，平均值為0.52 μg/L，計(jì)算其變異系數(shù)10.83%，說明各因素對計(jì)算結(jié)果影響不大，不宜作為可顯著影響檢測結(jié)果的因素。

表4 耐變性的測定結(jié)果

2.5 批間差異與穩(wěn)定性

計(jì)算不同時(shí)間的每批次產(chǎn)品的測定平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表5所示，3個(gè)批次中，牛奶的批間變異系數(shù)分別為4.9%，14.5%，16.6%；均小于20%，穩(wěn)定性良好。

表5 批間差異的測試結(jié)果

3 結(jié)論

隨著科學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)和人們生活水平的日益提高，人們的食品安全意識(shí)也越來越高，對牛奶的質(zhì)量安全也逐漸重視起來。因此需要不斷的完善各種檢測技術(shù)，來保證牛奶質(zhì)量的安全。試劑盒由于檢測成本低、操作簡單、耗時(shí)短而得到廣泛的應(yīng)用，逐步成為基層單位和偏遠(yuǎn)地區(qū)快速檢測的主要手段，但是，試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度、假陽性、假陰性等方面也存在一下問題，因此，建立試劑盒評價(jià)方法是必要的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該試劑盒在測試范圍內(nèi)線性回歸良好，相關(guān)系數(shù)R2可達(dá)0.9943，與結(jié)構(gòu)相似的甲砜霉素、氟甲砜霉素的交叉反應(yīng)率均小于1%，批間變異系數(shù)小于20%，牛奶中的平均回收率為108.5%，檢出限為0.067 μg/L，該試劑盒有較好的準(zhǔn)確性、特異性與重復(fù)性，耐變性與批間變異均在可接受范圍內(nèi)，可用于牛奶樣品中氯霉素的殘留檢測。

[1]KARTHIK R,GOVINDASAMY M,CHEN S M,et al.Green syn?thesized gold nanoparticles decorated graphene oxide for sensitive de?termination of chloramphenicol in milk,powdered milk,honey and eye drops[J].Journal of Colloid and Interface Science,2016,475:46–56.

[2]WANG TT，ZHANG D，ZHANG Z L，et al.Synchronized separa?tion,concentration and determination of trace chloramphenicol,thi?amphenicol and florfenicol in food by using polyoxyethylenecetyl ether-salt aqueous two-phase system coupled with high-performance liquid chromatography[J].Journal of the Iranian Chemical Society, 2016,13(10)：1759–1765.

[3]MIAO Y B,REN H X,GANA N,et al.A homogeneous and“off–on”fluorescence aptamer-based assay for chloramphenicol using vesi?cle quantum dot-gold colloid composite probes[J].AnalyticaChimi?caActa,2016,929:49-55.

[4]徐修遠(yuǎn),滑靜,胡建民,等.氯霉素在動(dòng)物體內(nèi)殘留問題的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2004，31(10):20-21.

[5]鞏軍,褚中秋,姜金斗,等.超高效液相色譜—三重四級桿質(zhì)譜測定乳與乳制品中氯霉素的殘留[J].中國乳品工業(yè),2012,40(7):50-52.

[6]ZHANG Z W,WUY P,LI X W,et al.Multi-class method for the determination of nitroimidazoles,nitrofurans,and chloramphenicol in chicken muscle and egg by dispersive-solid phase extraction and ul?tra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrome?try[J].Food Chemistry,2017,217:182–190.

[7]SN/T 2775—2011,商品化食品檢測試劑盒評價(jià)方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011：1-10.

[8]何田田,薛強(qiáng),段潛,等.氯霉素ELISA檢測試劑盒評價(jià)技術(shù)[J].食品科技,2013,38(2):311-314.

[9]劉智宏,葉妮,郭文林,等.四環(huán)素類藥物多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(1):318-323.

Evaluation techniques of detecting chloramphenicol by ELISA-Based visualiza?tion microarray chip

DU Bingyao1,2,WEN Fang2,ZANG Changjiang1,SHAO Wei1,LI Hao1,ZHANG Yangdong2,YANG Kai?lun1,YU Xiong1,JIANG Jindou3,GONG Jun3
(1.College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 8300523，China；2.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；3.Ministry of agriculture dairy quality supervision and testing center(harbin),harbin 150090，China)

In order to understand the effectiveness and reliability of domestic Chloramphenicol ELISA-based visualization microarray chip kit,evaluated in terms of sensitivity,specificity,accuracy,reproducibility,the detection limit,stability and inter-assay coefficients of variation. The results showed that the kit had a regression line of and correlation coefficient 0.9943.It showed less than 1%cross-reactivity with thiam?phenicol and florfenicol,which was similar to chloramphenicol in structure.The inter-assay coefficients of variation is less than 20%,and the rate of recovery for chloramphenicol from milk was 108.5%,the corresponding the detection limit was 0.067 μg/L,This kit had a good accu?racy,speci city and reproducibility,its stability and inter-assay were both in the acceptable range.This kit can be used in melamine detection from milk and milk powder.

chloramphenicol;ELISA;kit;evaluation

TS252.7

A

1001-2230（2017）05-0047-04

2016-12-20

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（nycytx-04-01）。

杜兵耀(1990-)，男，碩士，從事動(dòng)物營養(yǎng)與牛奶質(zhì)量安全的研究。

文芳