葉明建 朱衛(wèi)中趙恩慧 李金美 胡曉薇

浙江省麗水市人民醫(yī)院生殖中心（浙江麗水 323100）

低能量激光擊打精子尾部鑒別存活精子中應用

葉明建 朱衛(wèi)中*趙恩慧 李金美 胡曉薇

浙江省麗水市人民醫(yī)院生殖中心（浙江麗水 323100）

目的 驗證激光擊打法鑒別存活精子的可行性。方法 選用不同脈沖輸出時間的激光擊打精子尾部的不同位置，觀察活精子和死精子的形態(tài)變化，評估激光擊打效果，選擇合適的脈沖輸出時間，確定理想的擊打部位。采用激光擊打法和伊紅-苯胺黑活體染色兩種方法檢測不同來源的精子樣本，分析兩種方法檢出存活精子的結果相關性。結果 采用脈沖輸出時間100μs的激光擊打精子尾部的3/4位置，可收到較好的擊打效果。受低能量激光擊打后有90%活精子出現形態(tài)變化，其中75%表現為明顯變化，5%呈現明顯的頸部折角，而死精子形態(tài)無任何變化。激光擊打法的存活精子檢出率與精子活體存活率呈高度正相關（r =0.9925），但前者明顯低于后者（P＜0.05）。結論 低能量激光擊打法是鑒別存活精子簡便而有效的方法，但需要注意操作要領。

生殖技術, 輔助; 精子注射, 細胞質內; 精子; 激光

卵胞漿內單精子注射（ICSI）是治療梗阻性無精子癥、重度少精子癥及弱精子癥的重要方法，而如何在不動精子中鑒別和選擇存活精子是施行ICSI的技術難題。文獻報道，用激光射擊精子尾部后會引起蛋白變性，存活的精子會發(fā)生卷尾，而死精子無變化，使用此法從完全不動精子中篩選存活精子用于ICSI，經臨床應用獲得滿意的受精率及臨床妊娠結局[1-6]。但文獻對采用激光擊打精子尾部鑒別存活精子在技術操作層面的敘述不夠詳盡。

為驗證激光擊打法鑒別存活精子的可行性，本文采用不同能量激光擊打精子尾部的不同位置，觀察精子的形態(tài)變化，評估激光的擊打效果，確定擊打精子的最適能量和位置；同時采用激光擊打法和伊紅-苯胺黑活體染色兩種方法檢測不同來源的精子標本，分析兩種方法檢測精子存活率的相關性，進一步評估激光擊打法鑒別存活精子這一方法的應用價值。

材料與方法

一、材料

1. 正常精液3份，參照《人類精液分析與處理實驗室手冊第5版》[7]完成檢驗，將3份精液充分混合。用HEPES液（含10%SSS）洗滌2次，制成濃度（30~50）×106/mL精子懸液。

2. 全部為死精子的新鮮精液標本1份，用伊紅-苯胺黑染色法證實精子存活率為零。用HEPES液洗滌2次，制成濃度（30~50）×106/mL精子懸液。

3. 弱精子癥新鮮精液2份，不動精子比例＞60%。用HEPES液洗滌2次，制成濃度（30~50）×106/mL精子懸液。

4. 附睪穿刺冷凍精子2份（患者行ICSI后剩余），采用Quinn's（美國SAGE產品）精子冷凍液和解凍液進行精子的冷凍和解凍，按試劑說明書操作。用HEPES液洗滌2次，制成濃度（5~10）×106/mL精子懸液。

5. 少精子癥冷凍精子2份，采用Quinn's精子冷凍液和解凍液進行精子的冷凍和解凍，按試劑說明書操作。用HEPES液洗滌2次，制成濃度（5~10）×106/mL精子懸液。

6. PVP 試劑，Quinn's產品。

7. HEPES洗精液，Quinn's產品。

8. SSS代血清，Continuous Single Cultuer產品。

9. Hamilton激光破膜儀，選用科研工作模式，激光功率固定為300mW。

10. 與提供精子標本的患者簽署知情同意書。

二、方法

1. 活精子尾部在不同激光脈沖輸出時間擊打下的精子形態(tài)變化：取5個小皿各加入PVP液30μL，涂成直徑15mm的圓形液滴，并覆蓋3mL礦物油，每間隔5min透過礦物油在液滴的中央加入混合的正常精液3μL，靜置15min讓精子向四周擴散，分別用500μs、300μs、100μs、75μs和50μs脈沖輸出時間的激光擊打。游走并分布在液滴四周的精子均為活動力良好的活精子，隨著時間延長其運動速度趨緩，有利于激光擊打和形態(tài)觀察。

將小皿置于顯微注射的恒溫平臺上。分別選擇激光脈沖輸出時間為500μs、300μs、100μs、75μs和50μs，因100μs已是最小脈沖輸出時間，故將100μs的激光功率由100%調整為75%（相當于75μs）和50%（相當于50μs），順時針方向依次對準液滴周圍活精子尾部的下段約3/4（從精子頭部起）進行單次擊打，在3s內觀察尾部變化，各連續(xù)計數200個精子。精子尾部形態(tài)分為3種變化：（1）明顯變化 ①尾尖卷曲成環(huán)；②精子頸部彎曲；③擊打處下段彎曲且夾角＞90°；（2）輕度變化 擊打處下段有彎曲但夾角＜90°；（3）無變化 精子尾軸未見變化。精子尾部在激光擊打后精子出現的形態(tài)變化，見圖1。

圖1 精子尾部在激光擊打后精子出現的形態(tài)變化A: 尾部卷曲成環(huán); B: 頸部彎曲; C: 尾部明顯彎曲; D: 尾部輕度彎曲; E: 無變化

2. 活精子尾部不同位置在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化：取3個小皿同上法制作3個活精子擴散的液滴，靜置15min后分別采用激光脈沖輸出時間100μs，按順時針方向在活精子尾部的中間點、3/4位置和尾尖3個位置連續(xù)擊打200個活精子，觀察精子形態(tài)變化。

3. 觀察死精子及不同精子標本在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化：在小皿中各加入PVP液30μL和精子存活率為零或其他的精子標本3~10μL，用槍頭吹打混勻10次，涂成直徑15mm的圓形液滴，覆蓋3mL礦物油，將小皿置于顯微注射的恒溫平臺上。采用100μs激光脈沖輸出時間，選擇精子均勻且散在分布的部位，按順時針方向對視野下全部精子尾部的3/4位置進行單次擊打，在3s內觀察尾部變化，連續(xù)計數200個精子。精子尾部形態(tài)分類同上。上述精子標本在進行激光擊打前分別制備伊紅-苯胺黑染色涂片，稍后完成精子存活率計數。

4. 伊紅-苯胺黑染色法：分別取伊紅-苯胺黑染色液1滴（麗水中益生物技術有限公司產品）加入試管中，各加入待檢的精子懸液1滴，混勻。30s后取出10μL混合液于玻片上制成薄片，干燥，油鏡鏡檢。油鏡觀察200個精子，計數不著色精子的比例。不著色精子為活精子。

5. 統(tǒng)計分析：采用SPSS.10軟件。

結 果

1. 活精子在不同激光脈沖輸出時間擊打下的精子形態(tài)變化：激光擊打活精子尾部以脈沖輸出時間100μs的效果最佳，有90%精子發(fā)生形態(tài)變化，有75%精子發(fā)生明顯形態(tài)變化，擊打處無灼燒痕跡。其中大部分表現為瞬間卷曲成環(huán)狀，少部分在3s內呈現不同程度的尾部彎曲，有5%精子的頸部形成明顯折角。500μs擊打后精子尾部可見熔化和折斷改變，300μs的擊打效果稍低于100μs，75μs擊打后精子形態(tài)變化率明顯降低，而50μs擊打后精子形態(tài)未見改變?；罹游膊吭诩す饷}沖輸出時間500μs、300μs、100μs、75μs、50μs擊打下發(fā)生的形態(tài)變化，見表1。

2. 活精子尾部不同位置在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化：激光脈沖輸出時間100μs分別擊打精子尾部的中間點、3/4位置和尾尖的3個位置，其精子形態(tài)變化率無顯著性差異（P＞0.05），其中100μs的擊打結果與表1的100μs激光擊打精子尾部3/4位置的結果略有差異。活精子尾部不同位置在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化見表2。

3. 死精子在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化：死精子在激光脈沖輸出時間100μs擊打下均未見精子尾軸發(fā)生變化，擊打處未見灼燒痕跡。

4. 不同精子標本在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化：不同精子標本在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化率（%）與精子活體存活率（%）呈高度正相關（r =0.9925），但前者明顯低于后者（P＜0.05），表明有一定比例的活精子在激光擊打下未出現形態(tài)變化。不同精子標本在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化率及精子活體染色的存活率，見表3。

表1 活精子尾部在激光脈沖輸出時間500μs、300μs、100μs、75μs、50μs擊打下發(fā)生的形態(tài)變化(%)

表2 活精子尾部不同位置在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化（%）

表3 不同精子標本在激光脈沖輸出時間100μs擊打下的精子形態(tài)變化率（%）及精子活體染色的存活率(%)

討 論

如何鑒別活的不動精子，一直是困擾ICSI的技術難題。WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版推薦的伊紅染色法和低滲澎脹試驗（HOS），前者經伊紅染色后鑒別出的活精子無法用于ICSI；而后者操作繁瑣且不是100%準確，可能會出現假陽性[8]，并且不適用于冷凍-解凍精子[9]；SperMagic是一種精子能量促進劑，在短時間內可以顯著提高精子的活力，但研究樣本較少，安全性有待觀察[10]；采用激光擊打精子尾部是鑒別死活精子的一種方法，發(fā)生卷尾者為活精子，無反應者則視為死精子，活精子發(fā)生卷尾的機理仍不明確[1-3]。本文采用激光擊打法還觀察到一種新的精子形態(tài)變化形式，約5%的精子在尾部被擊打后其頸部被牽拉瞬間呈明顯折角，而尾部的卷尾及彎曲程度卻顯得不明顯。

活精子在激光擊打后有90%發(fā)生形態(tài)變化，而死精子形態(tài)無任何改變。因此發(fā)生形態(tài)變化的精子可判定為活精子，其中以形態(tài)發(fā)生明顯變化如尾部卷曲成環(huán)、頸部和尾部發(fā)生明顯彎曲的精子更具有確診價值。需要說明的是，活精子尾部受激光擊打后約有10%未見尾軸彎曲，因此尾部無變化不一定就是死精子。

弱精子、少精子及凍精標本在激光脈沖輸出時間100us擊打下的精子形態(tài)變化率（%）與精子活體存活率（%）呈高度正相關（r =0.9925），但前者結果明顯低于后者（P＜0.05），是因為有一定比例的活精子在激光擊打下未出現形態(tài)變化，這就可以合理解釋激光擊打法檢出的存活精子比例明顯低于伊紅-苯胺黑染色活體染色法的原因。

激光用于胚胎輔助孵化國內外已有大量的研究，多數認為是安全和有效的[11-14]，但對能否提高凍融胚胎著床率和臨床妊娠率仍有不同觀點[15]。Mantoudis等[16]認為激光制動精子可能存在因熱效應而破壞精子染色體進而影響胚胎的進一步發(fā)育的潛在危險；但徐志鵬等[17]通過末端轉移酶介導的dUTP末端標記法和單細胞凝膠電泳法分別對激光輔助制動的精子進行檢測，結果顯示激光輔助制動精子后對精子核DNA并無明顯影響,證實激光可以用來輔助ICSI操作；有較多文獻報道采用激光法制動精子施行ICSI獲得理想的妊娠結局，認為激光是篩選存活精子的有效方法，可以應用于睪丸精子ICSI[1-6]。

結果表明：采用低能量激光擊打精子尾部，是在不動精子中鑒別存活精子簡便而有效的方法，但需要注意操作要領。首先要盡量降低擊打精子的激光能量，其次要盡可能將擊打位置遠離精子頭部，以避免熱效應損傷精子DNA。擊打位置以尾部3/4位置為宜，接近精子尾尖不利于形態(tài)觀察，擊打的次數以一次為宜。

本文認為激光擊打精子的安全性應高于胚胎的激光孵化，首先是前者的激光強度要比后者弱小數倍；其次是擊打的位置遠離了精子頭部，減少了熱效應可能產生的損害，但采用激光擊打法鑒別存活精子的安全性仍有待進一步評估。

1 Ebner T, Yaman C, Moser M, et al. Laser assisted immobilization of spermatozoa prior to intracytoplasmic sperm injection in human. Hum Reprod 2001; 16(12): 2628-2631

2 Ebner T, Moser M, Yaman C, et al. Successful birth after laser assisted immobilization of spermatozoa before intracytoplasmic injection. Fertil Steril 2002; 78(2): 417-418

3 Aktan TM, Montag M, Duman S, et al. Use of a laser to detect viable but immotile spermatozoa. Andrologia 2004; 36(6): 366- 369

4 陳煥華, 馮貴雪, 張波, 等. 應用激光從完全不動精子中篩選存活精子行ICSI 后獲臨床妊娠: 附2 例報告. 中華男科學雜志 2015; 15(11): 988-991

5 陳煥華, 馮貴雪, 張波, 等. 激光篩遠不動精子ICSI后成功分娩健康嬰兒. 中國男科學雜志 2016; 30(4): 52-54

6 李培旭, 李尚為, 彭芝蘭. 激光輔助法精子制動在睪丸精子卵母細胞內單精子注射中的應用. 激光雜志 2004; 25(2): 75-76

7 世界衛(wèi)生組織. 人類精液分析與處理實驗室手冊第5版.北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011: 9-56

8 Carreras A, Ramirez JP, Mendoza C. Sperm plasma membrane integrity measurement: A combined method. Andrologia 1992; 24(6): 335-340

9 Hossain A, Osuamkpe C, Hossain S, et al. Spontaneously developed tail swellings (SDTS) in fl uence the accuracy of the hypo-osmotic swelling test(HOS-test) in determining membrane integrity and viability of human spermatozoa. J Assist Reprod Genet 2010; 27(2-3): 83-86

10 王雪梅, 孫麗君, 郝大勇. SperMagic對極度嚴重少弱精癥精子活動力及妊娠率的影響. 中國婦幼保健 2014; 29(1): 92-94

11 Lanzendorf SE, Ratts VS, Moley KH, et al. A randomized, prospective study comparing laser-assisted hatching and assisted hatching acidified medium. Fertil Steril 2007; 87(6): 1450-1457

12 Balaban B, Urman B, Alatas C, et al. A comparison of four different techniques of assisted hatching. Hum Reprod 2002; 17(5): 1239-1243

13 劉浩, 金志魁, 耿春惠. 激光輔助孵化對凍融胚胎種植潛力的影響. 中國實用婦科與產科雜志 2006; 22(5): 369-370

14 孫偉, 李靜, 聞姬.人胚胎透明帶與輔助孵化的研究進展. 中國優(yōu)生與遺傳雜志 2007; 15(12): 3-4, 2

15 Martins WP, Rocha IA, Ferriani RA, et al. Assisted hatching of human embryos: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Hum Reprod Update 2011; 17(4): 438-453

16 Mantoudis E, Podsiadly BT , Gorgy A, et al. A comparison between quarter, partial and total laser assisted hatching in selected infertility patients. Hum Reprod 2001; 16(10): 2182- 2186

17 徐志鵬, 孫海翔, 胡婭莉. 激光輔助制動對精子核DNA的影響. 中華男科學雜志 2007; 3(13): 216-218

（2016-11-28收稿）

Strike sperm tails with low energy laser to identify viable sperm

Ye Mingjian, Zhu Weizhong*, Zhao Enhui, Li Jinmei, Hu Xiaowei
Center of Reproduction Medicine, The People’s Hospital of Lishui, Lishui 323000, China Corresponding author: Zhu Weizhong, E-mail: 7087807@163.com; Tel: 18957090517

Objective To investigate the feasibility of single laser shot method for identifying viable spermatozoa. Methods We gave the sperm a shot at the different site of the tail using laser with different pulse time, and then observed the morphology changes of sperm for determining suitable pulse time of laser and the right shooting position. We also detect the survival rate of sperms from different sources using laser and staining, then analyzed its correlation.Results Laser with pulse time of 100us and three quarters of the sperm tail had a better result. After giving a shot, 90% of live sperms exhibited changes in morphology. Among them, 75% had signi fi cant changes and 5% presented neck angle, but the dead sperm had no change in morphology. The survival rate of two methods above showed positive correlation(r =0.9925), but the laser method was signi fi cantly lower in survival rate(P<0.05).Conclusion Low energy laser is a simple and effective method for identifying viable sperm, but you should pay attention to operation details.

reproductive techniques, assisted ; sperm Injections, intracytoplasmic; spermatozoa; lasers

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.006

R 698.2

*通訊作者，E-mail: 7087807@163.com；Tel: 18957090517