吳 航，令小峰

1.青海省中醫(yī)院(西寧810000)，2. 西寧市食品藥品監(jiān)督管理局(西寧810008)

·實驗研究·

不同白毛夏枯草提取物抗肝癌機制分析

吳 航1，令小峰2

1.青海省中醫(yī)院(西寧810000)，2. 西寧市食品藥品監(jiān)督管理局(西寧810008)

目的：以白毛夏枯草水提取物、乙酸乙酯提取物為例探究不同提取物的抗肝癌機制。方法：將白毛夏枯草的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)分別作用于肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721。運用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度的STW、ZTW對肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721增生的抑制作用，通過流式細胞儀檢測不同濃度的STW、ZTW誘導(dǎo)肝癌HepG2和SMMC-7721細胞凋亡的凋亡率，運用一步法熒光RT-PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測經(jīng)不同濃度的STW、ZTW處理后HepG2和SMMC-7721細胞中Bax mRNA的表達情況。結(jié)果:STW、ZTW對HepG2和SMMC-7721細胞均有顯著的抑制增生和誘導(dǎo)其凋亡的作用，同時能夠抑制肝癌血管增殖。STW、ZTW的抑制機制呈一定的濃度依賴性，其中以乙酸乙酯提取物ZTW抑制性最強。結(jié)論:白毛夏枯草水提取物、乙酸乙酯提取物均通過抑制肝癌細胞增生，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制肝癌血管增殖，加速肝癌細胞分化等機制來抗肝癌。

白毛夏枯草最早載于《本草綱目拾遺》，為雙子葉唇形科草屬植物，有性味苦寒、歸肺肝經(jīng)，專清肝火之效[1]。目前白毛夏枯草及其提取物被廣泛運用于現(xiàn)代藥理學(xué)和臨床研究中，近年來國內(nèi)外相關(guān)專家又提出白毛夏枯草在抗肝癌方面有著顯著地效果[2-3]。本研究旨在探究不同白毛夏枯草提取物對肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721增殖的抑制作用，推測其抗肝癌機制，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 材 料 白毛夏枯草水提取物和乙酸乙酯提取物、肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721、小牛血清、MTT粉劑、5-FU、青霉素、鏈霉素、PCR試劑盒(以上實驗材料均由本院實驗室采購)。

2 方 法

2.1 實驗準(zhǔn)備:將白毛夏枯草在完全干燥狀態(tài)下用水和乙酸乙酯萃取，將萃取出的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)分別置于4℃恒溫箱保存?zhèn)溆?；將肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721置于含10 %小牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的HepG2和SMMC-7721細胞備用；根據(jù)萃取試劑的不同將提取物分為STW組和ZTW組，并設(shè)置空白組作為對照，STW組和ZTW組均設(shè)置4 mg/ml、1 mg/ml、0.25 mg/ml三種濃度。

2.2 用MTT法檢測STW、ZTW對肝癌細胞抑制效果:將肝癌HepG2和SMMC-7721細胞植入培養(yǎng)板，培養(yǎng)完畢后加入不同濃度的STW、ZTW，隨后加入10 μl規(guī)格為5 g/L的MTT繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后，加入DMSO溶解，震蕩10 min后用酶聯(lián)免疫儀490 nm波長測定OD值，并計算抑制率。

2.3 運用流式細胞儀檢測STW、ZTW對肝癌細胞凋亡率的影響:將濃度為300 μg/ml的STW和ZTW給予對數(shù)生長期的HepG2和SMMC-7721細胞中，空白組加入培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.4 運用熒光RT-PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測經(jīng)STW、ZTW處理后HepG2和SMMC-7721細胞中Bax mRNA的表達情況。將兩種肝癌細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1d，加入濃度為4 mg/ml的STW、ZTW，直至孔中終濃度為2(μg·ml)。停留適當(dāng)時間(0.5、1、3、6、12 h)后，用PCR試劑盒提取總RNA，并通過合成、擴增得到所需的mRNA。

結(jié) 果

1 不同濃度STW對HepG2和SMMC-7721細胞增生的抑制作用 STW能顯著抑制肝癌細胞的增生，并有一定的濃度依賴性。與空白組相比，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度 STW對HepG2和SMMC-7721細胞的抑制作用((mg/ml))

2 不同濃度ZTW對HepG2和SMMC-7721細胞增生的抑制作用 ZTW同樣能有效抑制肝癌細胞的增生，呈一定的濃度依賴性。與空白組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度 ZTW對HepG2和SMMC-7721細胞的抑制作用(mg/ml)

3 流式細胞儀對肝癌細胞凋亡率檢測 濃度為300 μg/ml的STW和ZTW對HepG2和SMMC-7721細胞的細胞凋亡具有影響，有明顯的誘導(dǎo)作用，與空白組對比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

4 STW、ZTW對HepG2和SMMC-7721細胞中Bax mRNA表達的影響 實驗顯示，白毛夏枯草提取物STW、ZTW均能促進肝癌細胞HepG2和SMMC-7721中Bax mRNA的表達，其中乙酸乙酯提取物ZTW對HepG2和SMMC-7721細胞中Bax mRNA表達的促進作用更為明顯，同時呈現(xiàn)出一定的時間依賴性，見表4。

表3 流式細胞儀對肝癌細胞凋亡率檢測(%)

表4 不同時間下STW、ZTW對HepG2和SMMC-7721細胞中Bax mRNA表達的影響

討 論

白毛夏枯草主要分布于我國秦嶺以南各省份[4]，《本草綱目拾遺》記載：“葉梗同夏枯草，唯葉上有白毛，性寒、味苦、專清肝火”[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，白毛夏枯草的功效多樣，例如抑菌、抗過敏、抗病毒以及增強免疫系統(tǒng)；其提取物可以止咳祛痰，降血壓、保肝利膽等等。在臨床應(yīng)用中，含白毛夏枯草的復(fù)方藥劑能夠治療慢性骨髓炎、抗肝炎、治療高血壓和慢性支氣管炎等。近年來，國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者對白毛夏枯草在癌癥領(lǐng)域研究報道逐漸增多[8-10]。本院通過實驗探究白毛夏枯草的水提取物(STW)、乙酸乙酯提取物(ZTW)、對肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721的抑制作用和機制。相關(guān)研究顯示，白毛夏枯草提取物可通過抑制肝癌細胞血小板衍生生長因子的表達來起到抗肝癌的作用[11]。在本實驗中，通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測不同濃度STW、ZTW對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的抑制增生作用，均取得了比較滿意的效果。研究結(jié)果表明：不同白毛夏枯草提取物對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721均有較強的抑制作用，并且濃度越高，肝癌細胞分化越快，對肝癌細胞增生的抑制作用越明顯，說明白毛夏枯草提取物對肝癌細胞的抑制有一定的濃度依賴性。研究顯示，白毛夏枯草提取物可通過增加肝癌細胞凋亡基因的表達來誘導(dǎo)細胞的凋亡[12-13]。本實驗運用流式細胞儀對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721凋亡率進行檢測，通過檢測發(fā)現(xiàn)濃度為300μg/ml的白毛夏枯草提取物STW、ZTW對HepG2和SMMC-7721細胞有明顯的誘導(dǎo)其凋亡的作用，細胞凋亡率都在9%以上，與付曉瑞[14]研究結(jié)果相似。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)STW、ZTW均能促進HepG2和SMMC-7721細胞中的Bax mRNA的表達，并且時間越長，Bax mRNA表達增加的越多。提示HepG2和SMMC-7721細胞中的Bax mRNA的表達具有一定時間依賴性，STW、ZTW對肝癌細胞的抑制作用可能與Bax相關(guān)信號通路有關(guān)，與張娜[15]研究結(jié)果類似。西醫(yī)治療癌癥不可避免的存在著各種副作用，而傳統(tǒng)的中醫(yī)藥憑借著合理的價格和無任何毒副作用，已經(jīng)受到越來越多的專業(yè)人士的重視。中藥白毛夏枯草提取物可以通過抑制肝癌細胞增生，誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制肝癌血管增殖，加速肝癌細胞分化等機制來抗肝癌。

[1] 王勇慶,王 智,劉 浩，等.湖南金瘡小草資源調(diào)查研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2016,18(6):724-729.

[2] 陳 彤,蘇月華,黃余琳，等.夏枯草水提物對肝損傷小鼠的保護作用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,44(2):23-27,34.

[3] 王 攀,李招云,付 倫，等.夏枯草提取物對肺腺癌細胞A549蛋白質(zhì)組的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2014,94(28):2216-2221.

[4] 宋 莉,倪世峰,李亞君，等.夏枯草不同溶劑提取物抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā),2016,37(17):32-35.

[5] 劉 暢.褪黑素抗肝癌作用及其機制的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2013,19(23):4271-4274.

[6] 徐 智,陳軍寶,覃小艷，等.姜黃素抗肝癌機制研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,21(4):911-914.

[7] 陳清法,趙宗杰,謝海濤，等.樟芝抗肝癌機制研究進展[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2015,44(6):469-471.

[8] 潘春英,顧新剛.去甲斑蝥素抗肝癌作用機制的研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2015,23(4):575-577.

[9] 宋必衛(wèi),章方珺,劉潔瓊，等.香附超臨界CO2提取物體外抗肝癌作用[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,44(6):645-648.

[10] 張 淼,白月梅,苗 芳，等.夏枯草生殖生長期總黃酮積累規(guī)律及抗氧化活性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報,2012,27(2):170-174.

[11] 張 浩,龍 添,樓一層，等.復(fù)方夏枯草提取物對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用[J].中國藥師,2016,19(5):828-832.

[12] 姜 瓊,夏松柏,梅同荷，等.白毛夏枯草提取物對肝癌細胞增殖的抑制作用及機制研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2016,36(20):1770-1773.

[13] 馮春來,袁 穎,張海生，等.夏枯草抗腫瘤分子協(xié)同作用網(wǎng)絡(luò)分析[J].中成藥,2016,38(9):2003-2012.

[14] 付曉瑞,孫振昌,張明智，等.夏枯草提取物誘導(dǎo)B、T淋巴瘤細胞凋亡的實驗研究[J].中藥材,2012,35(3):433-438.

[15] 張 娜,封穎璐.人參皂苷的抗肝癌作用機制[J].國際腫瘤學(xué)雜志,2015,44(10):786-788.

(收稿：2017-01-10)

Analysis of mechanism of anti-hepatoma different ajugadecumbens extractive

Wu Hang，Ling Xiaofeng.

Qinghai Hospital of TCM(Xining 810000)

Objective：To mechanism of anti-hepatoma ajugadecumbens water extractive and ethyl acetate extract as an example to explore the different extracts. Methods：The water extract of Herba Ajugae (STW), ethyl acetate extract (ZTW) respectively in HepG2 and SMMC-7721 in hepatocellular carcinoma cell lines. Using four methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the inhibitory effect of different concentration of STW, ZTW and SMMC-7721 on HepG2 cell proliferation, apoptosis and apoptosis of hepatoma SMMC-7721 cells induced by HepG2 under different concentrations of STW and ZTW were detected by flow cytometry, using one-step fluorescent RT-PCR (Real-time PCR) expression technique for the detection of the different concentrations of STW, ZTW and HepG2 after treatment of SMMC-7721 cells in Bax mRNA. Results ：STW and ZTW could significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 and SMMC-7721 cells, and inhibit the proliferation of hepatoma cells. The inhibitory mechanism of STW and ZTW was concentration dependent, and the inhibitory effect of ZTW was the strongest. Conclusion：Herba Ajugae water extract and ethyl acetate extract by inhibiting proliferation of hepatoma cells, induce cell apoptosis, inhibit vascular proliferation, accelerate cell differentiation mechanisms against liver cancer.

Ajugadecumbens Extractive Mechanism of anti-hepatoma

白毛夏枯草 提取物 抗肝癌機制

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.06.059