王 進(jìn),孫 亮,齊秀英,馬 晶

(1.黑龍江哈爾濱普瑞眼科醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

正常角膜組織內(nèi)沒有血管及淋巴管分布以維持角膜的透明狀態(tài)和保持角膜處于“免疫赦免”狀態(tài)。在角膜化學(xué)燒傷、感染及移植手術(shù)的情況下，角膜在損傷修復(fù)過程中可能有新生淋巴管和新生血管形成[1]。這些新生淋巴管與血管共同構(gòu)成角膜的“免疫雙臂”，破壞了角膜原有的免疫赦免功能而發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。Avastin(Bevaeizumab，貝伐單抗)是一種人源化的抗VEGF重組鼠單克隆抗體，能夠阻止VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)的受體結(jié)合，進(jìn)一步抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂過程，從而阻礙新生血管的形成[2]，臨床應(yīng)用Avastin滴眼液治療眼新生血管形成相關(guān)疾病已獲得了良好的治療效果[3]。VEGF-C是最早發(fā)現(xiàn)的具有促進(jìn)淋巴管生成作用的因子，通過與受體VEGFR-3結(jié)合后，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和增殖[4]。本研究通過制備小鼠堿燒傷角膜模型，結(jié)膜下注射Avastin，采用免疫組化法觀察堿燒傷后不同時(shí)期小鼠角膜組織內(nèi)VEGF-C的表達(dá)情況，以及角膜堿燒傷后新生淋巴管和新生血管的生成情況，探討Avastin對(duì)角膜新生淋巴管和新生血管形成的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 建立小鼠角膜堿燒傷動(dòng)物模型

取體重25～30 g，8～10周齡C57BL/6J小鼠36只，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將直徑3 mm圓形單層濾紙浸入1 mol/L NaOH溶液中，30 s左右使濾紙達(dá)到飽和狀態(tài)，吸除多余液體。小鼠0.5%利多卡因角膜局部麻醉數(shù)秒，拭去多余的藥液，將3 mm圓形濾紙片置于小鼠右眼角膜中央20 sec，用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊1 min。左眼作為正常對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

小鼠角膜堿燒傷模型制備后，將36只小鼠隨機(jī)分為Avastin治療組和對(duì)照組。Avastin治療組小鼠堿燒傷2 h后給予25 mg/mL Avastin 5 μL結(jié)膜下隔日注射及每日左氧氟沙星滴眼液滴眼3次，用藥兩周；堿燒傷對(duì)照組小鼠每日給予左氧氟沙星滴眼3次，用藥兩周。于堿燒傷后3 d、7 d和12 d處死小鼠，每個(gè)時(shí)間段6只小鼠，取出雙側(cè)眼球，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.3 主要試劑

兔抗小鼠LYVE-1、兔抗鼠VEGF-C抗體和Avastin購自Santa Cruz公司；PV-6001試劑盒購自博士德生物公司。

1.4 免疫組化染色步驟

采用SP法，組織切片4 μm厚，常規(guī)脫蠟至水，0.3%H2O2作用10 min，目的是阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。0.01MPBS沖洗3次，每次5 min，然后將切片放入0.01 M檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH=6.0)中高壓2 min進(jìn)行抗原修復(fù)。0.01 MPBS沖洗3次，滴加一抗(LYVE-1和VEGF-C的工作濃度均為1∶200)，4 ℃冰箱孵育12～24 h。0.01MPBS沖洗3次，滴加二抗室溫孵育30 min。0.01MPBS沖洗3次，DAB顯色。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5 結(jié)果判斷和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

圖像分析儀(Image-ProPlus 6.0)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)定免疫組化結(jié)果的光密度值(optical density,OD)。在200倍顯微鏡下隨機(jī)觀察每個(gè)時(shí)間段標(biāo)本的6個(gè)視野，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行圖象分析，計(jì)算OD的均值，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 堿燒傷角膜內(nèi)新生淋巴管的形成情況

在堿燒傷后7 d和12 d時(shí)間段，對(duì)照組角膜內(nèi)可見LYVE-1陽性表達(dá)的新生淋巴管，淋巴管形狀不規(guī)則，部分管壁不完整呈開放狀態(tài)(圖1)。在Avastin治療組，堿燒傷后12d可見角膜內(nèi)LYVE-1表達(dá)呈陽性的開放狀態(tài)的新生淋巴管(圖2)，Avastin治療組角膜新生淋巴管出現(xiàn)的時(shí)間較對(duì)照組有明顯延遲現(xiàn)象。

2.2 堿燒傷角膜內(nèi)新生血管形成的觀察

小鼠角膜堿燒傷后第3 d，體視顯微鏡下觀察對(duì)照組角膜，可見到角膜新生血管生長(zhǎng)。與對(duì)照組相比，Avastin治療組角膜新生血管的生成較對(duì)照組少，新生血管的生長(zhǎng)明顯受到抑制(圖3)。

2.3 VEGF-C免疫組化結(jié)果

正常小鼠角膜上皮細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)VEGF-C蛋白(圖4A)。在堿燒傷對(duì)照組中，堿燒傷后3 d，角膜基質(zhì)層內(nèi)可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，VEGF-C表達(dá)于角膜上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)水平較強(qiáng)(圖4B)。堿燒傷后7 d，角膜上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞內(nèi)VEGF-C表達(dá)(圖4C)呈減弱趨勢(shì)。堿燒傷后12 d，VEGF-C表達(dá)水平下降接近正常角膜VEGF-C表達(dá)的水平(見圖4D)。在Avastin治療組中，VEGF-C亦表達(dá)于角膜上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞內(nèi)，在3 d和7 d時(shí)間段，Avastin治療組VEGF-C的表達(dá)均低于相應(yīng)時(shí)間段對(duì)照組VEGF-C的表達(dá)(圖5)。

圖1 堿燒傷后對(duì)照組7d和12d角膜內(nèi)新生的淋巴管(箭頭)×400

圖2 Avastin治療組12d角膜內(nèi)新生的淋巴管(箭頭)×400

圖3 角膜堿燒傷對(duì)照組3d,7d和12d 角膜新生血管(A,B,C)Avastin治療組3d,7d和12d角膜新生血管(D,E,F)

圖4 正常角膜(A)和堿燒傷后對(duì)照組3 d,7 d和12 d角膜(B,C,D)內(nèi)VEGF-C的表達(dá)×200

圖5 Avastin治療組3 d,7 d和12 d角膜內(nèi)VEGF-C的表達(dá)(A,B,C)×200

采用圖像分析軟件分析角膜堿燒傷后對(duì)照組和治療組不同時(shí)間段VEGF-C表達(dá)的光密度值，結(jié)果表明，與對(duì)照組VEGF-C的表達(dá)相比較，3 d、5 d和7 d時(shí)間段Avastin治療組角膜VEGF-C的表達(dá)明顯降低，二者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

角膜新生淋巴管和新生血管的形成與角膜炎癥和角膜移植排斥反應(yīng)密切相關(guān)，新生淋巴管和新生血管的形成不僅改變了角膜的“免疫赦免”的解剖特點(diǎn)，也是臨床角膜移植排斥反應(yīng)的主要原因，同時(shí)亦增加了角膜的混濁度[5]。近年隨著血管和淋巴管生成因子(VEGF-C)和淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)記物(LYVE-1)的發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)角膜淋巴管生成和血管生成與VEGF-C的關(guān)系進(jìn)行了深入研究[6]。VEGF-C可通過與受體VEGFR-3結(jié)合，使得VEGFR-3發(fā)生磷酸化，激活VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)通路，誘導(dǎo)組織內(nèi)淋巴管生成和血管生成。VEGF-C與VEGFR-3結(jié)合還可能激活多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)淋巴管和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、遷移、抗凋亡等重要生物學(xué)行為偶聯(lián)，最終形成淋巴管和血管[7]。

研究表明,人源性Avastin能夠抑制VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而抑制新生血管的形成。目前，Avastin在眼科的主要應(yīng)用集中于Avastin眼內(nèi)注射治療血管源性眼科疾病，例如視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變、新生血管性青光眼等[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠角膜堿燒傷對(duì)照組，燒傷后7 d的角膜基質(zhì)層內(nèi)可觀察到大量的LYVE-1陽性表達(dá)的新生淋巴管，部分呈開放狀態(tài)，部分呈不規(guī)則條索狀。在Avastin治療組，堿燒傷后12 d，可見管腔呈開放狀態(tài)的淋巴管，且淋巴管的數(shù)量低于堿燒傷對(duì)照組，表明結(jié)膜下注射Avastin可延遲和減少堿燒傷角膜內(nèi)新生淋巴管的形成。在角膜堿燒傷后新生血管生成方面，堿燒傷對(duì)照組小鼠角膜堿燒傷后第3 d，體視顯微鏡下即可見到新生血管生長(zhǎng)進(jìn)入角膜內(nèi)，角膜堿燒傷后第12 d時(shí)間段，部分新生血管侵入角膜堿燒傷斑。而在Avastin治療組，堿燒傷后第3 d，僅在角膜緣處可見到新生血管芽，堿燒傷后第12 d，可見稀疏的新生血管分布于堿燒傷斑的周邊。這說明結(jié)膜下注射Avastin可顯著延遲和減少角膜新生血管的形成時(shí)間和數(shù)量。本研究應(yīng)用免疫組化檢測(cè)證實(shí)，Avastin治療組與堿燒傷對(duì)照組比較，VEGF-C在不同時(shí)間段的表達(dá)量均顯著降低，新生淋巴管和新生血管的數(shù)量也明顯減少，其機(jī)制可能是Avastin下調(diào)VEGF-C的表達(dá)或Avastin與VEGF-C結(jié)合，阻止了VEGF-C與淋巴管和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和增殖，從而阻礙了新生淋巴管和血管的形成。預(yù)防和抑制角膜新生淋巴管和新生血管生成對(duì)降低角膜移植的排斥風(fēng)險(xiǎn)、提高角膜移植的成功率以及治療眼科血管源性疾病等方面都具有重要的實(shí)際意義，然而角膜新生淋巴管和新生血管的形成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，可能需要很多因子或多條分子通路參與，因此，對(duì)角膜新生淋巴管和新生血管生成的分子機(jī)制、角膜淋巴管和血管生成與VEGF-C的確切關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

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