李旭升，洪麗霞，金慶躍

(1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 金華 321017；2.上海濟(jì)光職業(yè)技術(shù)學(xué)院,上海 201901)

臨床上將自然狀態(tài)下發(fā)生的流產(chǎn)稱為自然流產(chǎn)(spontaneous abortion)。統(tǒng)計(jì)分析表明，在所有臨床確認(rèn)的妊娠中，自然流產(chǎn)的發(fā)生率約為15%，嚴(yán)重影響著廣大適齡婦女的正常孕育過程[1-2]。發(fā)生在12周以前的流產(chǎn)定義為早期流產(chǎn)，妊娠12周至不足28周的流產(chǎn)定義為晚期流產(chǎn)。80%以上的自然流產(chǎn)發(fā)生在妊娠12周以內(nèi)，隨后流產(chǎn)率迅速下降。至少半數(shù)以上早期流產(chǎn)是由胚胎染色體異常所致，其他原因還包括全身性疾病、妊娠期患急性病、高熱等因素[3-4]。自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)隨產(chǎn)次、父母年齡增加而升高。子宮肌層的靜止和收縮的動(dòng)態(tài)調(diào)控在整個(gè)妊娠過程中起著非常重要的作用，除了上述因素外，仍有諸多未知的體內(nèi)、外刺激都能夠引起子宮平滑肌細(xì)胞不正常的收縮，從而造成流產(chǎn)的發(fā)生。

前列腺素(prostaglandin，PG)是一類具有多種生理功能的活性脂質(zhì)，在人體內(nèi)起著非常重要的作用[5]。其中PGE2是前列腺素中非常重要的一個(gè)類型，除了在炎癥中有著重要作用外，在心血管系統(tǒng)也被證明有著關(guān)鍵的功能[6]。子宮中的PGE2主要來源于子宮內(nèi)膜(在妊娠過程中會(huì)發(fā)生蛻膜化)，其受體主要在肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)。前列腺素能引起子宮強(qiáng)烈的收縮，故在足月妊娠的引產(chǎn)、人工藥物流產(chǎn)以及避孕等方面取得了一定的效果[7-8]。研究表明，前列腺素E受體亞型1(EP1)在人類子宮肌層表達(dá)[9]。因此我們推測(cè)EP1表達(dá)水平的異?？赡芘c不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)有關(guān)。但是在不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)病人中，EP1受體的分布與正常人之間的差異國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，其復(fù)雜的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究采用RT-PCR和免疫熒光等方法對(duì)復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中EP1的水平以及子宮平滑肌細(xì)胞收縮率水平進(jìn)行測(cè)定，以探討EP1在不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過病例隨訪的方法，對(duì)在我院進(jìn)行婦科保健門診的孕婦進(jìn)行隨訪，當(dāng)出現(xiàn)陰道少量出血、B超提示胚胎死亡，需進(jìn)行清宮者且滿足以下條件者(即確診為不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn))：發(fā)生多于2次自然流產(chǎn)；孕12周以內(nèi)；染色體核型、婦科檢查、Coombs試驗(yàn)、TORCH、抗心磷脂抗體檢測(cè)等均無異常；無其他急慢性疾??；丈夫精液檢查正常為URSA組。同期正常早期妊娠的采用吸宮術(shù)人工流產(chǎn)孕婦作為正常組。本次研究共收集URSA組37例，正常組48例。不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)組平均年齡(26.8±3.1)歲，平均孕期(8.9±2.2)周，未接受任何藥物保胎治療；對(duì)照組平均年齡(25.9±2.7)歲，平均孕期(9.2± 1.9)周。上述兩組各項(xiàng)資料具可比性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

子宮肌膜組織通過宮腔鏡活檢獲得，并立即進(jìn)行后續(xù)子宮平滑肌細(xì)胞分離。Trizol 購(gòu)自Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBY Green MiX 購(gòu)自全式金公司；熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自bio-rad公司；PCR引物由博尚生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 子宮平滑肌細(xì)胞分離與鑒定取子宮肌組織約0.5 g，置于冰冷的HBSS緩沖液中，洗凈組織表面血污。于10 mL培養(yǎng)皿內(nèi)，以眼科剪將組織剪碎成漿樣，加入HBSS緩沖5 mL，轉(zhuǎn)入8 mL離心管離心(2 500 g×3 min)，棄上清。組織內(nèi)再加入HBSS緩沖液，吹打制成組織懸液，再次離心(2 500 g×3 min)，棄上清。重復(fù)，直至上清液變澄清。組織內(nèi)加入20% FBS 2 mL，吹打，使其分散；離心(2 000 g×3 min)，棄上層液。向留下的組織內(nèi)再次加入20% FBS 2 mL，吹打，再次離心(2 000 g×3 min)，棄上清。夾取組織塊，點(diǎn)種于6 孔板(或12孔板)，塊與塊之間相距0.5～1.0 cm。輕輕將培養(yǎng)板放入37 ℃、5% CO2孵箱。4 h后，拿出培養(yǎng)板，向培養(yǎng)孔內(nèi)緩慢加入20%FBS約2 mL，使液面剛好沒過組織塊。小心將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入孵箱。前4天可不必觀察。每4～6天換液1次，若有組織塊漂起，可吸除之。觀察至組織塊之間的細(xì)胞互相融合，即可直接用于實(shí)驗(yàn)處理，或傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。利用α-actin熒光抗體進(jìn)行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下可看到細(xì)胞被染成綠色熒光。

1.3.2 熒光定量PCR將蛻膜組織從液氮中取出，置于1 mL Trizol 試劑中，勻漿后加入200 μL 的氯仿；對(duì)于分離的培養(yǎng)于六孔板的子宮平滑肌細(xì)胞，每孔中加入Trizol 試劑中，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中。振蕩混勻后冰上放置5 min，12 000 g離心15 min，吸取澄清部分加入等體積異丙醇中，混勻后冰上靜置10 min，12 000 g 離心15 min，棄上清液，向離心管中加入1 mL預(yù)冷的75% 乙醇溶液，輕輕振蕩后7 500 g離心5 min，棄上清液，沉淀用無RNA酶的雙蒸水水溶解。定量后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為熒光定量PCR的模板。各目標(biāo)分子的引物序列如下，β-actin正向引物AACGCAGCTCAACAGTCC；β-actin反向引物TGGAATCCTGTGGCATCCATG；EP1正向引物CGCAGGGTTCACGCACACGA；EP1反向引物CACTGTGCCGGGAACTACGC。引物合成后稀釋為2 μM。反應(yīng)體系如下：2 × SYBR Premix ExTaq 5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，cDNA模板1∶10稀釋后取1 μL，剩余用不含RNA酶的水補(bǔ)足，總體積10 μL。按比例配制上述反應(yīng)液后分裝于96 孔PCR 板，每孔10 μL，然后以500g離心1 min。PCR 反應(yīng)條件如下：預(yù)變性： 95 ℃，30 s；變性： 95 ℃，3 s；退火延伸： 60 ℃，30 s；構(gòu)建溶解曲線。表達(dá)量的計(jì)算采用ΔΔt 模式。

1.3.3 子宮平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)的測(cè)量倒置相差顯微鏡下，各組每檢體隨機(jī)觀測(cè)30個(gè)細(xì)胞，每組10個(gè)檢體(即300個(gè)細(xì)胞)，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)度，計(jì)算其平均長(zhǎng)度。細(xì)胞收縮反應(yīng)的變化以細(xì)胞收縮率表示。細(xì)胞收縮率=(正常組細(xì)胞平均長(zhǎng)度-URSA組細(xì)胞平均長(zhǎng)度)/正常組細(xì)胞平均長(zhǎng)度×100%。siRNA處理后收縮率的計(jì)算，EP1siRNA組細(xì)胞收縮率=(正常組細(xì)胞平均長(zhǎng)度-EP1 siRNA處理URSA組細(xì)胞平均長(zhǎng)度)/正常組細(xì)胞平均長(zhǎng)度×100%，陰性對(duì)照siRNA組細(xì)胞收縮率=(正常組細(xì)胞平均長(zhǎng)度-陰性對(duì)照 siRNA處理URSA組細(xì)胞平均長(zhǎng)度)/正常組細(xì)胞平均長(zhǎng)度×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮平滑肌細(xì)胞的鑒定

通過免疫熒光的手段，我們對(duì)分離出的子宮平滑肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，利用平滑肌細(xì)胞特異性的標(biāo)志物α-平滑肌細(xì)胞激動(dòng)蛋白(α-SMA)進(jìn)行鑒定，結(jié)果分析分離的細(xì)胞平滑肌細(xì)胞陽(yáng)性率高于90%，見圖1。

圖1 子宮平滑肌細(xì)胞鑒定

2.2 URSA組和正常組子宮平滑肌細(xì)胞中EP1表達(dá)

子宮內(nèi)膜分泌的PGE2會(huì)作用于分布在子宮平滑肌細(xì)胞上EP受體，EP受體進(jìn)而介導(dǎo)不同的信號(hào)通路，通過第二信使對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞的生理活動(dòng)產(chǎn)生影響。利用RT-PCR的方法，我們分析了URSA組和正常組子宮平滑肌細(xì)胞中EP1的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用ΔΔt 模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示EP1的表達(dá)有了顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 EP1表達(dá)水平

2.3 URSA組和正常組子宮平滑肌細(xì)胞收縮率

與正常組相比較，URSA組平滑肌細(xì)胞收縮率增強(qiáng)，且有明顯差異，P<0.01，見表1。這顯示在URSA組中，平滑肌細(xì)胞不正常的收縮可能是導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生的一個(gè)重要因素。

表1 URSA組和正常組子宮平滑肌細(xì)胞收縮情況

2.4 EP1 siRNA處理對(duì)URSA組子宮平滑肌細(xì)胞收縮率的影響

我們分別用陰性對(duì)照siRNA和EP1特異性siRNA處理URSA組子宮平滑肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照siRNAEP1處理子宮平滑肌細(xì)胞收縮率為27.58%，而特異性 siRNA處理子宮平滑肌細(xì)胞收縮率為13.21%，能夠顯著降低URSA組子宮平滑肌細(xì)胞不正常的收縮，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示EP1可能在子宮平滑肌細(xì)胞不正常的收縮中起重要的作用。

3 討論

不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)是嚴(yán)重影響適齡婦女正常生育的一個(gè)重要因素，隨著環(huán)境以及其他因素的日益復(fù)雜化，越來越多的復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)發(fā)生，并且無法確診出具體的原因，給孕婦心理和身體造成了極大的損傷，目前已經(jīng)成為臨床研究的焦點(diǎn)。其中平滑肌細(xì)胞異常的靜止和收縮都是造成自然流產(chǎn)發(fā)生的重要原因[10-12]，在體外研究子宮平滑肌細(xì)胞功能，尋找改善子宮平滑肌細(xì)胞收縮穩(wěn)態(tài)的靶點(diǎn)被證明是一個(gè)有效的研究思路。

前列腺素及其受體被證明在人體內(nèi)發(fā)揮著及其重要的作用，前列腺素E在平滑肌功能調(diào)節(jié)中有著重要的作用，起在體內(nèi)有著四個(gè)亞型的受體EP1，EP2，EP3，EP4[13]。其中EP1受體的激活能夠?qū)е缕交〖?xì)胞的收縮，屬于收縮型或興奮性受體[14]。EP1能夠偶聯(lián)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)，而鈣信號(hào)被證明能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的收縮特性。研究發(fā)現(xiàn)EP1受體在血管平滑肌細(xì)胞中具有重要功能[15]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)病人的子宮平滑肌細(xì)胞中，EP1受體的表達(dá)水平顯著上升，同時(shí)不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)病人子宮平滑肌細(xì)胞具有異常的收縮的現(xiàn)象，我們利用特異性siRNA敲降EP1受體后發(fā)現(xiàn)EP1的敲降能夠明顯減低子宮平滑肌細(xì)胞的收縮，并且提高子宮平滑肌細(xì)胞的收縮和靜止之間的穩(wěn)定。其具體的內(nèi)在分子機(jī)制可能是通過體內(nèi)第二信使鈣離子實(shí)現(xiàn)的，具體的機(jī)制值得進(jìn)一步的研究。

總之，EP1受體對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞功能的影響，使其能夠作為不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的一個(gè)靶點(diǎn)，為不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的診斷和治療提供理論依據(jù)。

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