朱翔宇，曹志方，楊雨輝，蔡熙姮，姜亞磊，陳 濤

(1.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南?？?570228；2.海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

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LPS體外誘導(dǎo)PRP產(chǎn)生PGE2模型的構(gòu)建及HPLC-FD的優(yōu)化

朱翔宇1，曹志方1，楊雨輝2*，蔡熙姮1，姜亞磊1，陳 濤1

(1.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南海口 570228；2.海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228)

為了研究花生四烯酸(AA)代謝拮抗劑篩選的新方法，通過模擬體內(nèi)AA代謝產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)的過程，建立一種新的體外脂多糖(LPS)誘導(dǎo)高濃度血小板血漿(PRP)懸液中AA代謝產(chǎn)生PGE2的炎癥模型，并對(duì)高效液相色譜-熒光衍生法(HPLC-FD)測(cè)定PGE2方法進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，經(jīng)50℃水浴反應(yīng)，衍生化程度最高， HPLC-FD檢測(cè)最佳條件為柱溫40℃、流動(dòng)相為添加0.1% 三氟乙酸(TFA)的水∶乙腈(40∶60)，流速1 mL/min，Brmmc-PGE2的保留時(shí)間為6.562 min。體外模型試驗(yàn)中LPS+AA誘導(dǎo)試驗(yàn)組(157.476±36.104)ng/mL，LPS誘導(dǎo)空白對(duì)照組(11.416±2.034)ng/mL，而AA底物空白對(duì)照組中未檢測(cè)到PGE2。表明AA作為體外PGE2代謝模型的關(guān)鍵底物，在加入誘導(dǎo)物質(zhì)LPS后，AA可大量代謝生成為PGE2。

前列腺素E2；脂多糖；高效液相色譜；衍生化；熒光檢測(cè)

前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是PG家族眾多成員之一，是一種由花生四烯酸(arachidonic acid，AA)經(jīng)一系列代謝產(chǎn)生的前炎癥細(xì)胞因子[1]。其普遍存在于動(dòng)物的組織和體液中，具有廣泛的生物學(xué)活性，其含量極微，除了在人精液中含量較高外,在其他組織和體液中含量大都在ng級(jí)(10-9) 以下[2]。傳統(tǒng)試驗(yàn)中對(duì)PGE2的測(cè)定，多采用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定；雖然酶聯(lián)免疫法精密度高，但有著試劑盒價(jià)格昂貴、樣本要求高和不適合進(jìn)行大批量樣本實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)。20世紀(jì)80年代以來國(guó)外科學(xué)家已對(duì)多種PGs的測(cè)定有不少報(bào)道[3-4]，隨著近年來高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)技術(shù)的發(fā)展，HPLC被應(yīng)用于檢測(cè)PG家族化合物；然而正常組織和血液中PGE2的含量最高時(shí)也僅僅幾納克，這是HPLC在檢測(cè)PGE2時(shí)具有局限性的主要原因。高效液相熒光檢測(cè)(high performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLC-FD)是一種有效提高檢測(cè)效率和響應(yīng)強(qiáng)度的方法，能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)通過熒光衍生化轉(zhuǎn)化為具有熒光反應(yīng)的次級(jí)衍生物進(jìn)行測(cè)定，具有高準(zhǔn)確度、高響應(yīng)強(qiáng)度、更低檢測(cè)濃度的優(yōu)勢(shì)[5]。因此，本研究希望通過模擬體內(nèi)花生四烯酸代謝產(chǎn)生PGE2的過程，建立一種新的體外脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導(dǎo)高濃度血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)產(chǎn)生PGE2的模型，并進(jìn)行了HPLC-FD測(cè)定PGE2方法的優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 前列腺素E2對(duì)照品(純度≥93%)，購(gòu)自Sigma公司；雙環(huán)己基-18-冠醚-6 、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素(BrMMC)，購(gòu)自Sigma公司，用乙腈稀釋，配成4 mmol/L的乙腈溶液(下面分別簡(jiǎn)稱衍生試劑A液和B液)避光備用；脂多糖(LPS)和花生四烯酸(AA)標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自Sigma公司；乙腈(色譜純)，購(gòu)自TEDIA公司；三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、二水檸檬酸三鈉、檸檬酸、葡萄糖，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 精密電子天平(XPE105)，購(gòu)自METTLER TOLEDO公司；低溫離心機(jī)(Centrifuge 5810R)、高速離心機(jī)(Centrifuge 5418)，均購(gòu)自Eppendorf公司；恒溫水浴鍋(HH-S4)，購(gòu)自金壇市醫(yī)療儀器廠；隔膜真空抽濾機(jī)(GM-0.5A)，購(gòu)自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀，配有RF-20A熒光檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，購(gòu)自SHIMADZU 公司。

1.2 方法

1.2.1 體外LPS誘導(dǎo)PRP產(chǎn)生PGE2模型的構(gòu)建

1.2.1.1 血液的前處理及模型的建立 取新鮮血液，第1次離心(1 000 r/min，15 min)，分離收集血清和PRP沉淀。將沉淀血漿PRP重溶于等體積的檸檬酸/葡萄糖溶液(27.35 g二水檸檬酸三鈉，0.147 g檸檬酸，27.74 g葡萄糖定容至1 000 mL)。再次離心得到沉淀，沉淀細(xì)胞重懸于原體積的Dulbecco's(DPBS)中，得到PRP懸液。

取PRP懸液650 μL/孔，置于48孔板中，均加入50 μL超純水和75 μL LPS溶液(終濃度為100 ng/mL，以DPBS代替LPS作為誘導(dǎo)空白對(duì)照組)，37 ℃溫孵15 min。再加入75 μL AA溶液(濃度為0.2 mmol/mL)刺激AA代謝(以等量DPBS緩沖液代替AA作為底物空白對(duì)照組)，37 ℃再次溫孵15 min。用0 ℃的0.1 mL的1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 樣品前處理及衍生反應(yīng) 樣品于37 ℃水浴溶解，置于15 mL離心管中，充分混勻后再加入4倍體積的乙酸乙酯，旋渦混合3 min進(jìn)行提取。4 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層并干燥除水，于室溫下用氮?dú)獯蹈?，?fù)溶于200 μL乙腈中，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。測(cè)定時(shí),室溫下融化后加入衍生試劑進(jìn)行衍生化處理。

1.2.2 高效液相色譜-熒光衍生法測(cè)定PGE2的方法

1.2.2.1 PGE2標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度設(shè)置及柱前衍生反應(yīng) 取PGE2標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶于乙腈中定容至10 mL作為標(biāo)準(zhǔn)品母液，20℃保存?zhèn)溆?。以二倍稀釋法逐?jí)稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度為5 000、2 500、1 250、625、312、156 ng/mL的PGE2標(biāo)準(zhǔn)液。

取各濃度標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，分別加入衍生試劑A液和B液各250 μL，再加入無水碳酸鉀10 mg，混勻后水浴中避光反應(yīng)15 min。冷卻反應(yīng)液，3 000 r/min離心10 min，取上層清液1 mL過0.22 μm濾膜后進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以PGE2的峰面積(A)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.2.2 衍生反應(yīng)及色譜條件的優(yōu)化 Hypersil BDS C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)反向色譜柱；等梯度洗脫：流動(dòng)相A為水，B為乙腈，均設(shè)置添加三個(gè)濃度(0%、0.01%、0.1%)的三氟乙酸(TFA)調(diào)節(jié)pH；激發(fā)波長(zhǎng)313 nm，發(fā)射波長(zhǎng)370 nm。柱溫箱預(yù)設(shè)最低溫度40 ℃；流速1.0 mL/min。

高效液相色譜-熒光衍生法測(cè)定前列腺素E2受多因素影響，根據(jù)檢測(cè)參數(shù)的設(shè)定，預(yù)設(shè)衍生溫度、柱溫、流動(dòng)相中TFA添加量、流動(dòng)相B% 4個(gè)考查因素，具體設(shè)定如表1所示。

廣西是一個(gè)多民族的以壯族為主體，地處我國(guó)西南邊陲的地區(qū)，在民族遷徙和千百年的融合中，廣西地區(qū)形成了具有自身特點(diǎn)的耳聾基因突變譜。因此對(duì)廣西地區(qū)耳聾高危人群、患病人群進(jìn)行分子篩查，查找新致病突變、豐富耳聾突變分子譜，有助于本地區(qū)制定相應(yīng)的耳聾基因篩查策略；指導(dǎo)人群篩查、遺傳咨詢和臨床診斷，并幫助高風(fēng)險(xiǎn)家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷和醫(yī)學(xué)干預(yù)，才能達(dá)到提高出生人口素質(zhì)的目標(biāo)。

表1 考查因素預(yù)設(shè)值表

2 結(jié)果

2.1 柱前熒光衍生條件對(duì)結(jié)果的影響

PG家族化合物均無天然熒光,其結(jié)構(gòu)中也缺乏與常見熒光衍生試劑結(jié)合的基團(tuán)，故以4-溴甲基-6.7 -二甲氧基香豆素作為羧酸基團(tuán)的光衍熒生試劑，在雙環(huán)己基-18-冠醚-6和碳酸鉀催化條件下，與PGE2上的羧基進(jìn)行衍生化反應(yīng)，生成具有熒光的PGE2-雙香豆素酯[6-8]。因此，衍生化程度對(duì)能否完全檢測(cè)PGE2影響很大?？疾炝瞬煌苌鷾囟葘?duì)PGE2的熒光衍生程度的影響，結(jié)果表明(圖1)：采用水浴溫度50℃時(shí)，PGE2的檢測(cè)響應(yīng)度最高，即衍生化程度最高。

圖1 不同衍生溫度對(duì)PGE2衍生化程度的影響

2.2 流動(dòng)相的選擇

2.2.1 流動(dòng)相酸堿度對(duì)分離結(jié)果的影響 在反相HPLC中色譜峰拖尾是一個(gè)普遍的現(xiàn)象，峰拖尾可以引起分離度降低，靈敏度減弱，精密度和定量變差降低，而加入對(duì)電子具有競(jìng)爭(zhēng)性的酸性添加劑可消除拖尾現(xiàn)象[9]。分別考察了添加0%、0.01%、0.1%三個(gè)濃度TFA的水和乙腈作為流動(dòng)相對(duì)PGE2的分離情況，并對(duì)整個(gè)出峰范圍和峰型進(jìn)行了比較。結(jié)果表明(表2)：采用添加了0.1% TFA的流動(dòng)相時(shí)，整個(gè)方法的精確度最高，且色譜圖中各峰分離情況最好，PGE2的峰型無拖尾現(xiàn)象。

表2 流動(dòng)相中AcCl3不同添加量對(duì)精確度及峰型的影響

2.2.2 流動(dòng)相不同比例對(duì)分離結(jié)果的影響 通過改變B泵有機(jī)相的比例設(shè)置，考查了混合后乙腈濃度分別為50%、55%、60%、65%、70% 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等梯度洗脫。結(jié)果表明(圖2)，當(dāng)乙腈濃度≥55%時(shí)即可完全分離各有效峰，且隨著乙腈濃度比例的增大，色譜峰的保留時(shí)間縮短，但各峰之間的分離度將越差。通過對(duì)各峰分離情況及保留時(shí)間的分析考慮，乙腈濃度為55%～60%時(shí)均可在10 min內(nèi)出峰，且各峰分離良好，為最佳流動(dòng)相濃度比例范圍。

圖2 不同比例的流動(dòng)相對(duì)PGE2分離情況的影響

島津LC-20AD型高效液相色譜儀可設(shè)置的最低柱溫為40 ℃，并考慮BDS色譜柱的耐受溫度，設(shè)置了室溫、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃進(jìn)行比較。結(jié)果表明(圖3)，室溫下因機(jī)器內(nèi)溫度變化大，多次測(cè)定的保留時(shí)間偏差較大，故不考慮以常溫作為檢測(cè)溫度；而預(yù)設(shè)柱溫后，儀器內(nèi)部溫度穩(wěn)定，出峰時(shí)間均在6 min～7 min內(nèi)，溫度對(duì)保留時(shí)間的影響是以0.031 min/℃減少。綜合結(jié)果及對(duì)儀器損耗、保護(hù)柱子等多方面考慮，設(shè)置柱溫40 ℃即可保證保留時(shí)間的穩(wěn)定和檢測(cè)效率。

2.4 方法的線性范圍、精密度與檢出限

通過對(duì)衍生溫度、柱溫、流動(dòng)相pH、流動(dòng)相比例四個(gè)因素進(jìn)行考查，選擇最優(yōu)檢測(cè)條件。本法檢測(cè)的線性范圍較寬，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，其中x為待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，y為相應(yīng)的色譜峰面積(圖4)。并以3倍信噪比計(jì)算PGE2的最低檢出限，得出最佳檢測(cè)方法如表3所示。對(duì)整個(gè)濃度梯度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了日內(nèi)、日間差異測(cè)定。結(jié)果表明(表3)，整個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定，日內(nèi)精密度低于7.0%，日間精密度低于4.4%。

圖3 不同柱溫對(duì)PGE2保留時(shí)間的影響(N=4)

圖4 PGE2液相熒光檢測(cè)色譜圖

2.5 模型構(gòu)建的結(jié)果

本試驗(yàn)分為誘導(dǎo)試驗(yàn)組、誘導(dǎo)空白對(duì)照組和底物空白對(duì)照組，通過優(yōu)化后的檢測(cè)方法，對(duì)PRP懸液中PGE2的表達(dá)情況進(jìn)行了測(cè)定，其中誘導(dǎo)試驗(yàn)組(157.476±36.104) ng/mL，誘導(dǎo)空白對(duì)照組(11.416±2.034)ng/mL，而底物空白對(duì)照組中未檢測(cè)到PGE2。表明AA作為體外PGE2代謝模型的關(guān)鍵底物，在加入誘導(dǎo)物質(zhì)LPS后，AA可大量代謝生成為PGE2。

表3 最佳檢測(cè)方法的各項(xiàng)參數(shù)

3 討論

本模型從花生四烯酸代謝系統(tǒng)入手，包括由環(huán)氧酶催化形成的前列腺素內(nèi)過氧化物，這種不穩(wěn)定、半衰期短的內(nèi)過氧化物在血栓素異構(gòu)酶的作用下立即生成血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)，TXA2也很不穩(wěn)定，隨即形成穩(wěn)定的非酶水解產(chǎn)物血栓素B2(thromboxane B2，TXB2)。環(huán)氧酶抑制劑可降低TXB2的形成，特異性抑制血栓素異構(gòu)酶，可立即導(dǎo)致前面所述的內(nèi)過氧化物的堆積，這一過程是由于其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定性而并不是非酶催化的PGE2前體物生成的結(jié)果[10-12]。因而，TXA2-異構(gòu)酶的抑制可導(dǎo)致PGE2的生成，而TXB2峰值減少。

因此，該模型可作為花生四烯酸代謝拮抗藥物的篩選模型，根據(jù)代謝途徑及物質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑，可發(fā)展為AA、PGE2、TXB2同時(shí)進(jìn)行定性與定量測(cè)定，并進(jìn)一步研究拮抗劑抑制途徑和抑制對(duì)象，為抗炎活性成分的初步篩選提供一種快速、精準(zhǔn)、簡(jiǎn)單的有效手段。

表4 各濃度的日內(nèi)、日間精密度

圖5 各組PGE2的表達(dá)量情況

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Construction of LPS-induced PGE2ProductioninVitroModel from PRP and Optimization of HPLC With Fluorescence Derivatization Method

ZHU Xiang-yu1,CAO Zhi-fang1,YANG Yu-hui2,CAI Xi-heng1,JIANG Ya-lei1,CHEN Tao1
(1.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Hainan,Haikou,570228,China；2.HainanKeyLabofTropicalAnimalReproduction&BreedingandEpidemicDiseaseControl，Hainan,Haikou,570228,China)

To study the new method of arachidonic acid(AA)metabolic antagonist screening,this article established a new inflammatory modelinvitrolipopolysaccharides(LPS)-induced platelet-rich plasma(PRP)suspension of AA metabolism of prostaglandin E2(PGE2),through the simulation of the metabolism of AA PGE2production in the process,and optimized HPLC with fluorescence derivative method for determination of PGE2.The results showed that By 50℃ water bath reaction,the highest degree in derivatization and HPLC-FD test best conditions were the column temperature 40 ℃,the flow of water to add 0.1% trifluoroacetic acid(TFA):acetonitrile(40∶60),the flow rate of 1 mL/min,Brmmc-PGE2retention time was 6.562 min.Invitromodel,LPS+AA induced test group (157.476±36.104) ng/mL,LPS induced blank control group (11.416±2.034) ng/mL,but PGE2wasn’t detected in AA substrates blank control group.It showed that AA as the key substrateinvitrometabolism of PGE2model,will become the large number of PGE2after adding LPS induced material.

PGE2; LPS; HPLC; derivatized; fluorescence detection

2016-05-31

海南省科技廳“產(chǎn)學(xué)研一體化”項(xiàng)目(cxy20150021)

朱翔宇(1995-)，內(nèi)蒙古人，男，本科，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究。*通訊作者

S852.2

A

1007-5038(2017)06-0033-05