徐麗美，付明哲，何亞鵬，許信剛，于三科，張 琪

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

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陜西省部分地區(qū)PRRSV流行毒株ORF3和ORF5基因的遺傳變異分析

徐麗美，付明哲，何亞鵬，許信剛，于三科*，張 琪*

(西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

為了解陜西省豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遺傳和變異情況,對9份疑似感染PRRSV的病料用RT-PCR方法分別擴增ORF3和ORF5基因，并進行測序和序列分析。測序結果表明,ORF3基因在254-490和646-737位置之間發(fā)生不連續(xù)堿基突變；與GenBank已發(fā)表的國外毒株ORF3基因組比較，同源性為89.2%～94.8%，與國內發(fā)表的ORF3基因比較，同源性為88.8%～99.0%，其中與2009年陜西分離株(HQ843181.1)同源性為94.9%～98.7%，與2010年陜西株(KJ855518.1)同源性為94.9%～98.6%。ORF5基因突變主要在508-600堿基位置之間，與GenBank上已發(fā)表的國外毒株ORF5基因組比較，同源性為90.1%～92.1%，與國內發(fā)表的ORF5基因比較，同源性為89.6%～99.2%，其中與2009年陜西分離株(HQ843181.1)同源性為95.2%～98.4%，與2010年陜西株(KJ855518.1)同源性為95.2%～98.7%。ORF3和ORF5基因進化樹中Wn-2、Ak-3和Tc-4毒株在同一個進化支上，之間親緣關系近，Xy-1和Hz-5毒株分別在不同的進化分支上，與其他毒株遺傳距離較遠。陜西省PRRSV流行毒株的ORF5和ORF3基因組與國內PRRSV分離株相比較均有一定變異，且親緣進化不完全相同。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；ORF3基因；ORF5基因；序列分析

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的感染母豬主要表現(xiàn)為繁殖障礙、仔豬呼吸系統(tǒng)衰竭以及高病死率為特征的一種高度傳染性疾病[1]。自1987年美國報道了首例PRRS之后[2]，其他國家也相繼報道，2006年我國南方大面積暴發(fā)了由PRRS變異株引起的“豬高熱病”疫情，當時對我國養(yǎng)豬業(yè)造成的影響極大。PRRSV至今與多種病原混合感染，難以判斷和檢測，隨著它給全球養(yǎng)豬業(yè)造成的巨大經濟損失，迅速上升為全球關注的焦點。PRRSV是不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，有囊膜，基因組全長約15 kb，有9個開放閱讀框，發(fā)揮著不同作用[3]。其中ORF3和ORF5分別編碼該病毒的囊膜相關糖蛋白GP3和GP5，GP5是PRRSV的主要結構蛋白之一，有較高的免疫原性與中和活性，參與體液、細胞免疫[4]。研究表明，PRRSV分離株間的核苷酸序列存有明顯差異，以Nsp2、ORF3和ORF5基因片段變異較大為主[5-7]。很多學著針對ORF5基因進行研究，并探索PRRSV的新型疫苗和分子診斷試劑。由于PRRS是一種急性、熱性、高致死性的豬傳染病，目前雖已有弱毒疫苗和滅活苗上市可用于PRRS的預防，但免疫效果不佳，因而有必要了解各個省份PRRSV流行株的遺傳變異情況。本文就陜西省部分地區(qū)檢測到的PRRSV的5個流行毒株進行測序并進行遺傳變異分析，旨在了解陜西省PRRSV流行毒株之間以及與GenBank已有PRRSV毒株間的遺傳變異關系，為陜西省PRRS流行病學調查以及防控提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集陜西省楊陵、渭南、安康、銅川、漢中、戶縣等地區(qū)規(guī)?；i場表現(xiàn)為體溫高熱、耳朵藍紫、呼吸困難病豬的肺臟、脾臟病料。

1.1.2 主要試劑 Trizol總RNA提取試劑盒(Trizol Reagent)購于天根生化科技有限公司；病毒RNA反轉錄試劑盒(HiScript?1st Strand cDNA Synthesis)購于諾唯贊生物技術有限公司；2×TaqMasterMix和DNA Marker DL 2 000購于北京康為世紀生物科技有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據GenBank已公布的PRRSV序列(KU950375.1、KP771739.1)，針對ORF3和ORF5基因用Primer 5.0各設計一對特異性引物。ORF3上游引物F1 5′-GACAGGGTCAAATGTAACCATAGTGTA-3′，下游引物R1 5′-GTGACATTGGCAGTGATGGTGAT-3′，擴增長度為904 bp，包括ORF3全長開放閱讀框基因765 bp。ORF5上游引物F2 5′-TGTGCGACTGCTTCATTT-3′，下游引物R2 5′-CATCACTGGCGTGTAGGT-3′，擴增長度分別為775 bp，包括ORF5全長開放閱讀框基因603 bp。引物由Invitrogen上海貿易有限公司合成，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒RNA提取 取病豬肺臟和脾臟，于研磨器中研磨成勻漿，在-20℃/37℃反復凍融3次，8 000 r/min離5 min，取200 μL上清液，按照Trizol Reagent提取試劑盒說明書提取病毒RNA，部分立即用于反轉錄，剩余的置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR擴增 提取的病毒RNA按照(HiScript?1st Strand cDNA Synthesis)試劑盒說明書進行反轉錄，以反轉錄的cDNA為模版，總體積50 μL進行PCR擴增。PCR反應參數94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃再延伸8 min。

1.2.4 序列測定 將PCR產物進行瓊脂凝膠電泳，檢測呈陽性樣品5份，分別命名為Xy-1、Wn-2、Ak-3、Tc-4、Hz-5，將PCR產物送于上海英俊生物科技有限公司進行序列測定。

1.2.5 序列比對分析 利用DNAStar-MegAlign軟件和Blast比對5個毒株的ORF3和ORF5基因組序列并與GenBank已收錄的國內外PRRSV毒株進行比對分析，構建核苷酸序列同源性分析表和遺傳進化樹。

2 結果

2.1 ORF3和ORF5基因PCR擴增結果

分別以PRRSV的RNA反轉錄的cDNA為模板，經ORF3和ORF5引物PCR擴增得到5個與預期大小一致的目的片段，ORF3基因對應的條帶為904 bp(圖1)、ORF5基因對應的條帶為775 bp(圖2)。

2.2 ORF3基因序列同源性分析

應用DNAStar-Meg Align分析軟件對5個PRRSV毒株的ORF3基因的核苷酸同源性進行分析，結果見(圖3)。全長ORF3基因開放閱讀框由765個核苷酸組成，有255個氨基酸。發(fā)現(xiàn)5個分離毒株與GenBank上已發(fā)表的國外分離株(AB811787.1、AF176348.2、AF325691.1)比較，同源性為89.2%～94.8.0%；與中國其他地區(qū)分離株(EU860249.1、HM016159.1、HQ233605.1、KP998431.1、KP998475.1)同源性為88.8%～99.0%，其中與陜西分離株(HQ843181.1、KJ855518.1)同源性為94.9%～98.7%?？梢钥闯鯫RF3基因具有地緣性差異，一般距離越近同源性越高。

M.DNA 標準 DL 2 000；1～5.ORF3擴增產物

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.PCR products of ORF3

圖1 ORF3基因PCR擴增

Fig.1 Amplification of ORF3 gene by PCR

M.DNA 標準DL 2 000；1～5.ORF5擴增產物

M.DNA Marker DL 2 000；1-5.PCR products of ORF5

圖2 ORF5基因PCR擴增

Fig.2 Amplification of ORF5 gene by PCR

2.3 ORF3基因遺傳進化樹分析

應用DNAStar-MegAlign生物分析軟件完成ORF3基因遺傳進化樹(圖4)，由進化樹可以看出，5株中的Wn-2、Ak-3、Tc-4在一個進化小分支上，與陜西株(HQ843181.1)遺傳距離較近，Hz-5與陜西株(KJ855518.1)遺傳距離較近，Xy-1與北京株(HQ233605.1)遺傳關系最近，5個毒株與臺灣分離株(KP998431.1)的進化分支最遠。

2.4 ORF5基因序列同源性分析

利用DNA Star-Meg Align分析軟件對5個PRRSV毒株的ORF5的基因核苷酸進行同源性分析(圖5)。ORF5基因由603個核苷酸組成，有201個氨基酸。發(fā)現(xiàn)5個毒株的ORF5基因與GenBank上已發(fā)表的國外分離株比較，同源性為90.1%～92.1%；與中國分離株(EU860249.1、HM016159.1、KP771760.1、KP998431.1、KP998475.1)同源性為89.6%～99.2%，其中與陜西分離株(HQ843181.1、KJ855518.1)同源性為95.2.8%～98.7%；可以看出ORF5基因也具有地緣性差異，可以看出ORF5基因也具有地緣性差異，一般距離越近同源性越高。

圖3 ORF3基因核苷酸同源性分析

2.5 ORF5基因遺傳進化樹分析

應用DNAStar-MegAlign生物軟件完成ORF5基因遺傳進化樹(圖6)，從ORF5基因遺傳進化樹可看出，5株里面的Wn-2、Ak-3、Tc-4分離株在一個進化分支上，親緣遺傳關系較近，Hz-5與陜西株(KJ855518.1)遺傳進化關系近，Xy-1從進化樹來看與本地株親緣進化關系較遠，5個毒株與中國臺灣分離株(KP998431.1)在進化分支上最遠。

圖4 ORF3基因核苷酸序列進化樹

圖5 ORF5基因核苷酸同源性分析

圖6 ORF5核苷酸序列進化樹

3 討論

從1987年美國首次報道，隨之歐洲多個國家地區(qū)PRRS的暴發(fā)，1996年郭寶清等[8]在我國首次分離出PRRSV，再到2006年我國南方地區(qū)發(fā)生的由豬藍耳病變異病毒引起的大規(guī)模的高熱病，PRRSV是全球性趨勢。目前針對PRRSV的弱毒疫苗和滅活苗已經在豬養(yǎng)殖生產中應用，但由于疫苗自身問題免疫效果不佳，若發(fā)病目前尚無特效藥物可以進行治療且呈大規(guī)模的暴發(fā)，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。加大對PRRSV的研究迫在眉睫，有必要進行不同地區(qū)PRRSV毒株的序列分析、比對，以了解該病毒的遺傳、進化及流行情況。

本研究擴增到陜西省部分地區(qū)5個毒株的ORF3與ORF5基因。核苷酸同源性分析，5個毒株的ORF3基因之間的同源性為94.9%～98.0%，與GenBank上已發(fā)表的國外毒株ORF3基因組比較，同源性為89.2%～94.8.0%，與國內發(fā)表的ORF3基因比較，同源性為88.8%～99.0%，與GenBank上已收錄的國內外毒株進行核苷酸比對，發(fā)現(xiàn)ORF3基因組在254-490和646-737位置之間發(fā)生不連續(xù)堿基突變。ORF5基因之間的同源性為95.2%～98.4%，與GenBank上已發(fā)表的國外毒株ORF5基因組比較，同源性為90.1%～92.1%，與國內發(fā)表的ORF5基因比較，同源性為89.6%～99.2%，與GenBank上已收錄的國內外毒株進行核苷酸比對，發(fā)現(xiàn)突變主要在508-600堿基位置之間。據相關資料已知ORF5是PRRSV基因組中的高突變區(qū)之一，這也與本研究得到的結果一致，其編碼蛋白GP5又是PRRSV主要的宿主保護性抗原，ORF5基因序列，特別是GP5氨基酸序列的變異將直接降低PRRSV疫苗株的交叉保護率[9]，所以加深ORF5基因的研究勢在必行，對本病防控和病毒研究及更有效疫苗研究都很重要。ORF3和ORF5基因進化樹中，均呈現(xiàn)出一個規(guī)律，Wn-2、Ak-3、Tc-4在一個進化小分支上，親緣關系較近，Hz-5和Xy-1毒株有別與其他毒株，與本地分離株遺傳關系較遠，可能這兩個地方的流行株與帶毒豬的跨地域流動有關。

目前雖投入大量資源進行研究，也已有弱毒疫苗和滅活苗應用于實踐，但效果并不是很理想，反而PRRSV一直呈現(xiàn)上升趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失，本研究發(fā)現(xiàn)陜西省部分地區(qū)PRRSV存在一定的變異，這種變異是否影響疫苗的免疫效果還需要進一步研究。本文針對陜西省部分地區(qū)疑似為PRRSV的病豬采取病料，對ORF3和ORF5基因組進行RT-PCR擴增，遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)陜西省部分地區(qū)PRRSV存在一定變異，以補充陜西省地區(qū)PRRSV流行株的流行情況，為后續(xù)研究奠定基礎。

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Genetic Variation Analysis of ORF3 and ORF5 genes of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Partial Regions of Shaanxi Province

XU Li-mei,FU Ming-zhe,HE Ya-peng,XU Xin-gang,YU San-ke,ZHANG Qi
(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100，China)

In order to understand the genetics and variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Shaanxi province,9 suspected samples of PRRSV infection were collected from pig farms in partial regions,and ORF3 and ORF5 genes were amplified using RT-PCR.Sequencing results showed that the ORF3 gene had discontinuous base mutations between 254-490 and 646-490 positions.Compared with published abroad ORF3 genome in GenBank,the similarity is 89.2%-94.8%,and compared with domestic published ORF3 gene,the similarity is 88.8%-99.0%,compared with 2009 Shaanxi isolate (HQ843181.1),the similarity is 94.9%-98.7%,and with 2010 Shaanxi strain (KJ855518.1), the similarity is 94.9%-98.6%.Sequencing results showed that the ORF5 gene has discontinuous base mutations between 508-600 positions.Compared with published abroad ORF5 genome in GenBank,the similarity is 90.1%-92.1%,and compared with domestic published ORF5 gene,the similarity is 89.6%-99.2%,with 2009 Shaanxi isolate (HQ843181.1), the similarity is 95.2%-98.4%,and with 2010 Shaanxi strain (KJ855518.1),the similarity is 95.2%-98.7%.In ORF3 and ORF5 gene phylogenetic trees,Wn-2,Ak-3 and Tc-4 three strains are in the same evolutionary branch and the genetic distance is farther with Xy-1 and Hz-5 strains.ORF5 and ORF3 genomes all have certain variation of pandemic strains in Shaanxi compared with domestic PRRSV isolates,and biological evolution is not exactly the same.

Porcine reproductive and respiratory syndrome; ORF3 gene; ORF5 gene; sequence analysis

2016-09-21

陜西省農業(yè)科技創(chuàng)新與攻關項目(2016NY-095)；西北農林科技大學基本科研業(yè)務費項目(Z109021427)

徐麗美(1994-)，女，甘肅會寧人，碩士，主要從事分子病原學與免疫學研究。*通訊作者

S855.1

A

1007-5038(2017)06-0013-05