張芳成，劉 樂，肖 藝，孫小玲，官 陽

兩種不同取材方法在胰島細胞電鏡定位及觀察中的比較

張芳成，劉 樂，肖 藝，孫小玲，官 陽

胰島；膠原酶P；電鏡

隨著電子顯微技術(shù)的發(fā)展，組織或細胞超微結(jié)構(gòu)觀察已成為醫(yī)學研究和臨床醫(yī)學檢測必不可少的手段[1-2]。胰島為胰腺的內(nèi)分泌部，由胰島細胞聚集形成大小不等和形狀不定的細胞團，散在分布于胰腺各處；其分泌的胰島素和胰高血糖素可直接控制碳水化合物的代謝，調(diào)節(jié)機體的血糖水平[3]。胰島細胞的結(jié)構(gòu)改變對其激素分泌有較大影響，故觀察胰島細胞超微結(jié)構(gòu)對了解胰島功能狀態(tài)有重要價值。健康成人體內(nèi)大約分布有300萬個胰島細胞[4]，占胰腺總體積的1%～2%[5]。由于胰島無固定形狀，體積小，分布分散，肉眼無法識別。加之電鏡取材小，可觀察的范圍有限。如采用常規(guī)的電鏡取材方法直接取材，以半薄切片定位來尋找胰島細胞，費時、費力且效果不佳，還時常因定位不準確而導致實驗失敗。因此，尋找快速、精準地獲取胰島細胞的方法對提高工作效率十分必要。本實驗通過比較直接取材法和膠原酶P灌注法的優(yōu)良，旨在尋找高效、可行的胰島電鏡取材定位的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD雄性大鼠12只，隨機分為2組，每組6只。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑 (1)光學顯微鏡(Olympus)，超薄切片機(Leica UC7)，透射電鏡(HITACHI HT7700)。(2)膠原酶P、HBSS洗液、Histopaque1083，均購自美國Sigma公司；戊二醛、鋨酸、乙醇、丙酮、Epon812、甲苯胺藍、醋酸鈾、檸檬酸鉛，均購自北京中興百瑞公司。

1.3 方法

1.3.1 直接法 (1)取材：將大鼠麻醉后，沿腹正中線逐層剪開腹腔，在左上腹部找到脾臟，脾臟位于胃和左腎之間，為長條形，顏色與肝臟相近。脾臟內(nèi)側(cè)近脾門處可見灰白色的組織為胰尾部，可見明顯分葉狀，分離外周脂肪組織、血管和十二指腸及脾臟，切除胰尾，切成大小1 mm×1 mm×1 mm組織。(2)預(yù)固定：2.5%戊二醛預(yù)固定30 min以上，采用0.1 mol/L PBS沖洗3次×10 min。(3)固定：1%鋨酸固定1 h，采用0.1 mol/L PBS沖洗3次×10 min。(4)脫水：梯度乙醇及丙酮逐級脫水。(5)浸透：丙酮 ∶環(huán)氧樹脂 (1 ∶1)37 ℃浸透4 h，純環(huán)氧樹脂37 ℃浸透4 h。(6)包埋及聚合：60 ℃ 4 h，90 ℃ 12 h。(7)切片：在超薄切片機上，用玻璃刀切出1 μm厚的半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡下定位胰島所在部位；再用鉆石刀切出70 nm厚的超薄切片。(8)染色：醋酸鈾與檸檬酸鉛雙染；HT7700透射電鏡下觀察。

1.3.2 膠原酶P灌注法 取材：斷頸處死大鼠，打開腹腔，移開肝臟和十二指腸，暴露膽管，夾住膽管的十二指腸開口處，切除肝臟游離膽總管上端，經(jīng)膽總管注射2～3 mL膠原酶溶液至胰腺，使胰腺膨脹，切取膨脹的胰腺，將胰腺轉(zhuǎn)移至含有2～3 mL(0.5 mg/mL)膠原酶P的50 mL離心管內(nèi)，38 ℃水浴箱孵育約5 min，將離心管移至冰上，加入預(yù)冷HBSS洗液至20 mL，劇烈振搖離心管10 s；1 300 r/min離心后棄掉上清，20 mL洗液再次混勻離心，棄掉上清液，加入10 mL Histopaque1083輕輕吹打混勻，傾斜離心管，沿管壁緩慢加入等量預(yù)冷HBSS溶液，水平離心機800 r/min離心14 min。用吸管小心吸出2層液面分界層處的胰島細胞，加入預(yù)冷HBSS溶液混勻，800 r/min離心3 min。重復(fù)洗滌離心2次，將懸浮液轉(zhuǎn)至100 mm2有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)，顯微鏡下用P20自動移液器挑取胰島，在培養(yǎng)皿內(nèi)手動挑取重懸胰島3次，避免外分泌細胞的污染。后續(xù)電鏡制樣方法與直接法(2)～(8)相同。

2 結(jié)果

2.1 半薄切片定位時間 直接法經(jīng)多次半薄切片及甲苯胺藍染色，光鏡下可見在較多胰腺腺泡中一淡染區(qū)域，周圍有血管分布(圖1A)，直接法半薄切片定位胰島細胞所需時間平均為(34.4±6.5) min；膠原酶P灌注法經(jīng)半薄切片及甲苯胺藍染色，光鏡下可見較多大小一致的單個胰島細胞(圖1B)，平均定位時間為(2.7±0.6) min，膠原酶P灌注法耗時明顯低于直接法，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.88，P<0.01)。

①A①B②A②B②C②D

圖1 大鼠胰島甲苯胺藍染色：A.直接法；B.膠原酶P灌注法 圖2 大鼠胰島超微結(jié)構(gòu)：A.直接法，透射電鏡×1 000倍；B.膠原酶P灌注法，透射電鏡×1 000倍；C.直接法，透射電鏡×8 000倍；D.膠原酶P灌注法，透射電鏡×8 000倍

2.2 胰島細胞數(shù)量 直接法5個1 000倍視野(HT7700，1 000倍)可見胰島細胞平均數(shù)量為(2.8 ± 1.0)個。膠原酶P灌注法同樣倍數(shù)視野下平均細胞數(shù)量為(5.5±1.3)個。膠原酶P灌注法獲取的胰島細胞數(shù)量明顯多于直接法，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.55，P<0.01)。

2.3 胰島細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 超薄切片電鏡下觀察胰島細胞胞核為圓形或卵圓形，核膜清晰完整，胞質(zhì)內(nèi)可見核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基器，另可見較多的膜包顆粒，即不同類型的內(nèi)分泌顆粒。直接法和膠原酶P灌注法均可獲得結(jié)構(gòu)清晰完整的胰島細胞(圖2)。

3 討論

透射電鏡標本的制備技術(shù)精細，耗時較長。當標本較多時，切片量大，工作負擔重，如長時間耗在半薄切片定位上，勢必導致工作效率低下。此外，由于電鏡標本大小僅為1 mm×1 mm×1 mm，限制標本的觀察范圍，影響超微結(jié)構(gòu)觀察的全面性[6]。因此，要在大片胰腺外分泌部中進行胰島細胞的快速、精準定位，對于胰島細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察具有重要意義。

本實驗結(jié)果顯示，膠原酶P灌注法平均定位胰島細胞的時間明顯短于直接法。透射電鏡前期制樣過程耗時較長，如能縮短半薄切片定位時間，則可有效提高電鏡切片效率，有利于科研及臨床工作的開展。瞿文生等[7]認為，選取胰尾小血管周圍的組織尋找胰島是一種簡便快捷的方法，省去了其他繁瑣的步驟。該方法與本文描述的直接法類似；但由于胰島解剖結(jié)構(gòu)的特殊性、胰島大小的差異性及分布密度的不均一性[3-5]，導致后期半薄切片定位胰島極為困難，須經(jīng)反復(fù)多次的半薄切片及染色觀察，才能在大片胰腺外分泌部中找見數(shù)量有限的胰島細胞；有時甚至可能未找出胰島而導致實驗失敗。同時，在取材過程中還可能出現(xiàn)擠壓損傷胰島細胞的超微結(jié)構(gòu)，以致后期觀察時不能獲得清晰完整的電鏡圖片。也有研究表明[8]，雙硫腙溶液灌注后，有利于準確獲取胰島細胞；但該方法需先進行二甲胂酸鈉灌注，再用固定液灌注后取材，還需嚴格把握灌注的壓力及時間。采用膠原酶P灌注法，可直接分離獲取純度較高的胰島細胞，半薄切片可以在較短時間內(nèi)完成胰島細胞定位。因此，膠原酶P灌注法是一種高效的胰島細胞電鏡取材法。

本實驗在1 000倍透射電鏡下，膠原酶P灌注法查見的胰島細胞平均數(shù)量明顯多于直接法，可較明顯地提高胰島細胞的觀察效率。透射電鏡觀察通常存在切片較小而組織標本觀察視野要盡可能大的矛盾[6]。因此，在有限的電鏡視野中觀察到較多數(shù)量的胰島細胞，有利于實驗者更為全面的判斷胰島細胞超微結(jié)構(gòu)的改變，提高實驗結(jié)果的準確率。目前，膠原酶P灌注法獲得的胰島細胞已廣泛應(yīng)用于體外胰島細胞功能研究、胰島細胞移植治療Ⅰ型糖尿病等方面。該方法可獲得數(shù)量較多、細胞存活率較高且生物學功能正常的胰島細胞[5,9-10]，膠原酶P灌注法還是一種切實可行的胰島細胞電鏡取材法。本實驗結(jié)果顯示，2種方法獲取的胰島細胞超微結(jié)構(gòu)均保存完好，細胞器結(jié)構(gòu)清晰，可滿足實際工作需要。

綜上所述，利用膠原酶P灌注法進行胰島細胞電鏡取材，用于胰島細胞電鏡定位及觀察，可快速有效地獲取數(shù)量較多的超微結(jié)構(gòu)清晰的胰島細胞，顯著提高工作效率，有較好的實用價值；但膠原酶P取材相較于直接法操作過程繁雜，取材過程較為費時。因此，實驗者可根據(jù)自身實驗需求，合理選擇實驗方法。

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武漢大學人民醫(yī)院超微病理中心，武漢 430000

張芳成，女，碩士，技師。Tel:(027)88041911-81488， E-mail：915821980@qq.com 官 陽，男，博士，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail：guanyang@foxmail.com

時間：2017-5-17 23:54 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.029.html

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1001-7399(2017)05-0582-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.029

接受日期：2017-02-22