馮曉燕， 何 琳，孫志茹

子宮頸鱗狀細胞癌中MCM5和p16INK4A的表達及其意義

馮曉燕1， 何 琳2，孫志茹3

目的 探討HPV 16感染的子宮頸癌中MCM5與p16INK4A表達及其意義。方法 采用RT-PCR及免疫組化SABC法檢測HPV 16感染正常子宮頸、子宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)包括CIN 1與CIN 2～3及子宮頸鱗狀細胞癌中MCM5、p16INK4A的mRNA及蛋白表達，并分析其臨床意義。結(jié)果 MCM5、p16INK4AmRNA在子宮頸癌組織中表達均明顯高于正常組織(χ2=-6.589，P<0.001；χ2=-4.349，P<0.001)；且隨子宮頸病變程度的升高逐漸增加，差異有顯著性(χ2=57.141，P<0.001；χ2=47.628，P<0.01)；子宮頸癌中MCM5 mRNA的表達與臨床分期、病理分級有關(guān)，Ⅰa～Ⅰb期明顯低于Ⅱa～Ⅱb期(χ2=-4.93，P<0.01)，其表達隨病理分級降低而降低(χ2=-4.017，P<0.01)；子宮頸癌中p16INK4AmRNA表達隨病理分級的降低而降低(χ2=8.560，P<0.01)；MCM5、p16INK4AmRNA在子宮頸鱗狀細胞癌中表達最明顯；MCM5和p16INK4A蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.497)。結(jié)論 子宮頸癌中MCM5和p16INK4A高表達，MCM5可較好的反應子宮頸的惡性增生，與p16INK4A聯(lián)合檢測對完善CIN分級及預后的判斷意義重大。

子宮頸腫瘤；鱗狀細胞癌；p16INK4A；MCM5

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染在子宮頸上皮內(nèi)病變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽訉m頸癌的過程中發(fā)生重要作用[1-3]。早期發(fā)現(xiàn)癌前病變中異常水平的分子標志物對子宮頸癌篩查的意義重大。MCM5是DNA復制過程中發(fā)揮重要作用的一類蛋白，其功能的正常與否和微染色體有絲分裂穩(wěn)定性關(guān)系密切[4]。p16INK4A屬于抑癌基因，和細胞周期調(diào)控關(guān)系密切，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5]。目前，關(guān)于MCM5與p16INK4A在子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的表達及其相互作用機制報道較少[6]。本文檢測不同程度子宮頸病變和子宮頸鱗狀細胞癌中MCM5、p16INK4A的表達，探討兩者在HPV 16感染子宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為完善癌前篩查及預后判斷提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集河北省保定市第二醫(yī)院2014年2月～2016年2月活檢確診為子宮頸鱗狀細胞癌50例，低度子宮頸上皮內(nèi)病變(CIN 1級)14例，高度子宮頸上皮內(nèi)病變(CIN 2～3級)18例?；颊吣挲g38～64歲，平均(40.5±5.8)歲，其中40歲及以上者31例，小于40歲者19例。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟的臨床分期標準[7]：Ia期6例，Ib期12例，Ⅱa期14例，Ⅱb期18例。所有患者均確診為HPV 16單一感染，術(shù)后經(jīng)病理確診，術(shù)前均無放、化療及其他藥物治療。選擇同時段收治的HPV 16單一感染、子宮脫垂住院患者行子宮完整切除后病理提示正常子宮頸組織20例為對照組。獲取標本后分為2份，1份經(jīng)10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋；1份凍存于液氮中備用。本實驗經(jīng)河北省保定市第二醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 引物設計 上海寶生物公司合成p16INK4A和MCM5引物；上海生物工程公司合成內(nèi)參β-actin。p16INK4A上游引物：5′-CCCCACTACCGTAAATGTCCA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；MCM5上游引物：5′-GAGATGCCCAGACACATGCAG-3′，下游引物：5′-ATGGAGTAGATGCCCATGATGGTA-3′；β-actin上游引物：5′-TCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGATGGAAG-3′。

1.3 RT-PCR

1.3.1 提取總RNA與合成cDNA 取樣本50 mg提取總RNA，測其純度(紫外分光法)，予以A260/A280位于1.8～2.2的標本按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，將500 ng總RNA加入20 μL反應體系中，反映條件為37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃延伸，獲得cDNA后行PCR檢測或冰箱保存(-20 ℃)備用。

1.3.2 RT-PCR檢測 ABI 7500 RT-PCR儀對MCM5 mRNA與p16INK4AmRNA的相對表達量進行檢測，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。PCR反應體系(20 μL)：2 μL cDNA、95 ℃預變性30 s；PCR循環(huán)40次，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s。溶解并繪制溶解曲線：90 ℃ 1 min、65 ℃ 15 s、37 ℃ 30 s。

1.4 免疫組化 取切片脫蠟、水化、高壓熱抗原修復后采用免疫組化SABC法進行染色，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。陰性對照組采用PBS緩沖液替代一抗。MCM5蛋白以細胞核著色呈棕黃色為陽性，其中陽性細胞數(shù)<10%為陰性，10%～30%為弱陽性，31%～70%為中度陽性，>70%為強陽性。p16INK4A蛋白以細胞核和(或)細胞質(zhì)著色呈棕黃色為陽性，其中陽性細胞數(shù)<10%為陰性，10%～30%為弱陽性，31%～60%為中度陽性，>60%為強陽性。

2 結(jié)果

2.1 MCM5、p16INK4AmRNA在HPV 16感染后不同子宮頸組織中的表達 采用RT-PCR檢測MCM5、p16INK4A基因、內(nèi)參的溶解曲線峰，結(jié)果顯示均為明顯單峰。MCM5 mRNA的相對表達量隨子宮頸病變的程度升高逐漸增加，差異有顯著性(χ2=57.141，P<0.001)。MCM5 mRNA在子宮頸鱗狀細胞癌組中表達量明顯高于正常組及各級別子宮頸病變組，差異均有顯著性(χ2=-6.589，χ2=-5.524，χ2=-4.473；P<0.001)；MCM5 mRNA在CIN 1組與CIN 2～3組相比差異無顯著性(χ2=4.0.107，P>0.05)。p16INK4AmRNA的相對表達量隨子宮頸病變程度升高而增加，差異有顯著性(χ2=47.628，P<0.01)。p16INK4AmRNA在子宮頸癌中表達顯著高于正常組(χ2=-4.349，P<0.001)；p16INK4AmRNA在子宮頸癌組與CIN 2～3組相比差異無顯著性(χ2=-1.572，P>0.05)。p16INK4AmRNA在CIN1組中表達與正常組相比差異無顯著性(χ2=-1.217，P>0.05)；與CIN 2～3組相比差異有顯著性(χ2=-3.54，P<0.01，圖1)。

圖1 MCM5(A)、p16INK4A mRNA(B)在HPV 16感染后不同子宮頸組織中的表達

2.2 p16INK4A、MCM5 mRNA的表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 子宮頸癌中MCM5 mRNA的表達與患者年齡無關(guān)(χ2=-0.241，P>0.05)；與臨床分期有關(guān)，MCM5 mRNA表達量Ⅰa～Ⅰb期明顯低于Ⅱa～Ⅱb期(χ2=-4.93，P<0.01)；與病理分級有關(guān)，表達量隨病理分級降低而降低(χ2=-4.017，P<0.01)。子宮頸癌中p16INK4AmRNA表達與患者年齡(χ2=-1.079，P>0.05)、臨床分期均無關(guān)(χ2=2.001，P>0.05)；與病理分級有關(guān)，隨病理分級的降低而降低(χ2=8.560，P<0.01，表1)。

2.3 HPV 16感染后不同子宮頸組織中MCM5、p16INK4A蛋白的表達 MCM5蛋白陽性定位于細胞核呈棕黃色，在子宮頸正常組織中無著色或僅為弱表達，限于基底層。隨著CIN病變程度加深，陽性表達細胞升高，范圍增大，染色增強，鱗狀細胞癌組織呈彌漫表達(圖2)。p16INK4A蛋白陽性定位于細胞核和(或)細胞質(zhì)呈棕黃色，在正常組織中幾乎不表達。隨CIN病變程度加深，陽性表達細胞升高，范圍增大，染色增強，鱗狀細胞癌組織呈彌漫表達，染色以強陽性為主(圖3)。MCM5在不同子宮頸組織中表達隨病變程度升高逐漸增加，差異有顯著性(P<0.01)；其中在子宮頸鱗狀細胞癌中表達顯著高于正常及各程度子宮頸病變組織(P<0.05)；CIN 1組與CIN 2～3組相比，MCM5蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)。p16INK4A在不同子宮頸組織中表達隨病變程度升高逐漸增加，差異有顯著性(P<0.01)；在CIN 2～3組中的表達顯著高于正常組及CIN 1組(P<0.05)，與鱗狀細胞癌組相比差異無顯著性(P>0.05，表2)。

②A②B②C③A③B③C

圖2 MCM5在不同子宮頸病變中的表達，SABC法：A.CIN 1組；B.CIN 3組；C.子宮頸鱗狀細胞癌組 圖3 p16INK4A在不同子宮頸病變中的表達，SABC法：A.CIN 1組；B.CIN 3組；C.子宮頸鱗狀細胞癌組

表1 p16INK4A 、MCM5 mRNA表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 不同子宮頸組織中MCM5和p16INK4A的表達

采用χ2檢驗及Fisher確切概率法；MCM5蛋白的表達：與正常組相比，aP<0.05；與CIN 1組相比，bP<0.05；與CIN 2～3組相比，cP<0.05；p16INK4A蛋白的表達：與正常組相比，xP<0.05；與CIN 1組相比，yP<0.05；與CIN 2～3組比較，zP<0.05

表3 MCM5、p16INK4A蛋白表達及與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

采用MannWhitneyU檢驗和Kruskal-WallishH檢驗

2.4 MCM5、p16INK4A蛋白表達與子宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 子宮頸鱗狀細胞癌中MCM5蛋白表達和病理分級及臨床分期相關(guān)(P<0.01)；與患者年齡無關(guān)(P>0.05)。p16INK4A的表達和病理分級有關(guān)(P<0.05)；與臨床分期及患者年齡均無關(guān)(P>0.05，表3)。

2.5 子宮頸癌中MCM5、p16INK4A蛋白表達的相關(guān)性 采用Spearman秩相關(guān)性分析顯示：子宮頸鱗狀細胞癌中MCM5和p16INK4A蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.497，P<0.01，表4)。

表4 子宮頸癌中MCM5、p16INK4A蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

HPV基因基本結(jié)構(gòu)包括早、中、晚3個重要區(qū)域，是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其中HPV感染細胞的惡變常與早期基因區(qū)域及其產(chǎn)物E6、E7的表達異常相關(guān)[8]。HPV 16是全球公認的引起子宮頸鱗狀細胞癌最重要基因型[9-10]。因此，本實驗選擇HPV 16單一感染的子宮頸病變組織，并對不同程度CIN及子宮頸鱗狀細胞癌中MCM5、p16INK4A表達進行檢測，對其在子宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床病理特征的關(guān)系進行探討。

MCM蛋白在DNA復過制程中有重要意義，為高度保守的蛋白質(zhì)，與細胞增殖關(guān)系密切，可隨細胞分裂周期出現(xiàn)周期性的表達上調(diào)與下調(diào)[11-12]。本組結(jié)果顯示，MCM5蛋白及mRNA在CIN 1組中均呈陽性，其陽性細胞數(shù)隨病變程度增加而上升，表達范圍從基底層逐漸向表層推移；與Chew等[13-14]報道結(jié)果相符。進一步提示MCM5的異常表達與子宮頸癌的發(fā)生、浸潤等過程密切相關(guān)。

本組MCM5 mRNA及蛋白在子宮頸正常組中的表達明顯低于各級CIN組及子宮頸鱗狀細胞癌組；子宮頸鱗狀細胞癌中的表達明顯高于CIN 2～3組。提示上調(diào)的MCM5標志潛在惡性細胞和非典型細胞的增生，與Zhang等[15-16]的報道結(jié)果相符。

有研究顯示[17]，子宮頸涂片中應用MCM5抗體檢測進行惡變潛能細胞的診斷其敏感性和特異性均較高。本組CIN 2～3組中MCM5蛋白及mRNA的表達與CIN 1組相比，差異均無顯著性。因此，作者認為尚不能根據(jù)MCM5表達的改變來進行CIN程度分級。

文獻報道顯示[18-20]，p16INK4A在多種腫瘤中均不表達或低表達，但在子宮頸癌組織中呈高表達。本實驗結(jié)果顯示，p16INK4AmRNA在正常子宮頸組織中未見明顯表達，而在各級CIN及子宮頸鱗狀細胞癌組織中其表達量及范圍隨子宮頸病變程度的升高逐漸增加，與Zhang等[21]的報道一致。本組實驗發(fā)現(xiàn)，MCM5和p16INK4A蛋白在子宮頸鱗狀細胞癌中表達呈正相關(guān)，提示兩者在HPV 16感染子宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展中可能存在協(xié)同作用。由于目前臨床相關(guān)研究仍相對較少，MCM5和p16INK4A在子宮頸癌中的表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性及其作用機制，仍有待于深入分析。

綜上所述，聯(lián)合檢測MCM5和p16INK4A可以協(xié)助判斷細胞增殖狀態(tài)、CIN程度，以及篩查出具有潛在惡性的CIN，并對預測病情發(fā)展及CIN轉(zhuǎn)歸的關(guān)系意義重大，與HPV的聯(lián)合檢查提高癌前病變及子宮頸癌的篩查陽性率。

[1] Petry K U, Cox J T, Johnson K,etal. Evaluating HPV-negative CIN2+ in the ATHENA trial[J]. Int J Cancer, 2016,138(12):2932-2939.

[2] 呂秀芳，宋曉霞，賀 慧，等. HPV DNA、E6/E7 mRNA在各子宮頸病變及子宮頸鱗狀細胞癌中的表達[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2016,32(7):745-748.

[3] 譚 琪，章任兵，王靜霞，等. 高危型人乳頭瘤病毒感染的子宮頸非典型鱗狀細胞中p16基因的缺失[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(6):687-689.

[4] White T E, Surles-Zeigler M C, Ford G D,etal. Bilateral gene interaction hierarchy analysis of the cell death gene response emphasizes the significance of cell cycle genes following unilateral traumatic brain injury[J]. Bmc Genomics, 2016,17(1):1-29.

[5] Rosemann M, Gonzalez-Vasconcellos I, Domke T,etal. A Rb1, promoter variant with reduced activity contributes to osteosarcoma susceptibility in irradiated mice[J]. Mol Cancer, 2014, 13(1):182.

[6] Jorge V R, Silva M R, Guillin E A,etal. The origin and genetic diversity of the causal agent of Asian soybean rust, phakopsora pachyrhizi, in South America[J]. Plant Pathol, 2014,64(3):729-737.

[7] Choi J W, Kim Y, Lee J H, Kim Y S. The clinical performance of primary HPV screening, primary HPV screening plus cytology cotesting, and cytology alone at a tertiary care hospital[J]. Cancer Cytopathol, 2015,124(2):144-152.

[8] Hesselink A T, Sahli R, Berkhof J,etal. Clinical validation of anyplex II HPV HR detection according to the guidelines for HPV test requirements for cervical cancer screening[J]. J Clin Virol, 2016,76(2):211-225.

[9] Jones R W. The natural history of cervical and vulvar intraepithelial neoplasia[J]. Am J Obstet Gynecol, 2010,202(3):e12-e13.

[10] Iwao K, Seiichiro M, Satoru A,etal. Hypermutation in the E2 gene of human papillomavirus type 16 in cervical intraepithelial neoplasia[J]. J Med Virol, 2015,87(10):1754-1760.

[11] Dijkstra M G, Heideman D A, de Roy S C,etal. pl6(INK4a) immunostaining as an alternative to histology review for reliable grading of cervical intraepithelial lesions[J]. J Clin Pathol, 2010,63(11):972-977.

[12] 高 峻，楊 勇，陳 霖，等. STK15、MCM5在胃癌前病變及癌變組織中的表達及相關(guān)性分析[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2014,9:1432-1434.

[13] Chew I, Post M D, Carinelli S G,etal. p16 expression in squamous and trophoblastic lesions of the upper female genital tract[J]. Int J Gynecol Pathol, 2010,29(6):513-522.

[14] 郭 沖，尹格平. MCM5蛋白和hTERC基因檢測在預測CIN惡性潛能的價值[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2014,22(11):2696-2701.

[15] Zhang J L, Wang L, Qiu M,etal. The protein levels of MCM7 and p63 in evaluating lesion severity of cervical disease[J]. Int Gynecol Cancer, 2013,23(2):318-324.

[16] 劉麗娜，李 瑤，楊永秀，等. MCM5和p16INK4A在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 西安交通大學學報(醫(yī)學版), 2015,36(6):829-835.

[17] Zheng J. Diagnostic value of MCM2 immunocytochemical staining in cervical lesions and its relationship with HPV infection[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(1):875-880.

[18] Schlichte M J, Guidry J. Current cervical carcinoma screening guidelines[J]. J Clin Med, 2015,4(5):918-932.

[19] 潘瓊慧，黃凌霄，陳育梅，等. p16INK4A、L1殼蛋白聯(lián)合檢測在子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的應用研究進展[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2015,31(2):324-326.

[20] von Knebel Doeberitz M, Reuschenbach M, Schmidt D,etal. Biomarkers for cervical cancer screening: the role of p16(INK4a) to highlight transforming HPV infections[J]. Expert Rev Proteomics, 2012,9(2):149-163.

[21] Zhang C Y, Bao W, Wang L H. Downregulation of p16(ink4a) inhibits cell proliferation and induces G1cell cycle arrest in cervical cancer cells[J]. Int J Mol Med, 2014,33(6):1577-1585.

Expression and significance of MCM5 and p16INK4Ain cervical squamous cell carcinoma

FENG Xiao-yan1, HE Lin2, SUN Zhi-ru3

(1DepartmentofNuclearMedicine,2DepartmentofGynaecologyandObstetrics,theNo.2HospitalofHebeiProvinceBaoding,Baoding071051,China;3DepartmentofGynaecologyandObstetrics,DingxingCountyYunfengMaternityHospitalofHebeiProvince,Dingxing072650,China)

Purpose To investigate the expression and significance of MCM5 and p16INK4Ain cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia (CIN 1, CIN 2～3 ) with different degrees of HPV 16 infection. Method RT-PCR and immunohistochemistryof SABC method were used to detect the expression of mRNA and protein in HPV 16 infected normal cervix, CIN 1 tissue, CIN 2～3 tissue and cervical squamous cell carcinoma and analyzed the clinical significance. Result The expression of p16INK4Aand MCM5 mRNA in cervical cancer tissues were significantly higher than that in normal tissues (χ2=-6.589,P<0.001, χ2=-4.349,P<0.001). The degree of cervical lesions increased gradually (χ2=57.141,P<0.001, χ2=47.628,P<0.01). Expression of mRNA MCM5 was correlated with pathological grade and clinical stage. Ⅰa-Ⅰb period was

significantly lower than that of Ⅱa-Ⅱb (χ2=-4.93,P<0.01), the expression decreased with the decrease of pathological grade (χ2=-4.017,P<0.01). The expression of p16INK4AmRNA in cervical cancer decreased with the decrease of pathological grade (χ2=8.560,P<0.01). The most obvious expression of p16INK4Aand p16INK4AmRNA in squamous cell carcinoma. Expression of MCM5 protein and p16INK4Aprotein in cervical squamous cell carcinoma was positively correlated (r=0.497). Conclusion There is high expression of MCM5 and p16INK4Ain cervical carcinoma. MCM5 can be a better reaction of cervical malignant hyperplasia, and p16INK4Ajoint detection for the improvement of CIN classification and prognosis of the significance of the judgment.

cervical neoplasm；squamous cell carcinoma；p16INK4A； MCM5

1河北省保定市第二醫(yī)院核醫(yī)學科、2婦產(chǎn)科 0710513河北省定興縣云峰婦產(chǎn)醫(yī)院婦產(chǎn)科 072650

馮曉燕，女，主管技師。E-mail： yhfeng99@126.com

時間：2017-5-17 23:53 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.010.html

R 737.33

A

1001-7399(2017)05-0515-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.010

接受日期：2017-03-02