黃建平，楊映紅，吳雪晶

不同抗原修復(fù)法對免疫組化HBcAg染色結(jié)果的影響

黃建平，楊映紅，吳雪晶

HBcAg；抗原修復(fù)；免疫組織化學(xué)

HBcAg是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的核殼結(jié)構(gòu)蛋白，是HBV的核心成分，它包裹著HBV病毒核酸，易與HBcAb結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物而被吞噬。HBcAg主要存在于受感染的肝細胞內(nèi)，其在血液中一般難以被檢測，只有在肝細胞內(nèi)才能檢出。因此，組織學(xué)活檢需行免疫組化染色明確診斷。HBcAg檢測具有重要的臨床指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值，是反映HBV存在及復(fù)制程度的直接指標，可與血液HBV DNA檢測互補驗證，但HBcAg檢測常出現(xiàn)染色弱、定位不準確、染色陽性率低等問題。本文現(xiàn)采用不同的抗原修復(fù)法進行實驗，以尋找最佳染色方法提高HBcAg染色的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料 選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院2014年1月～2016年6月肝臟穿刺標本60例，另選取肝組織中HBcAg強表達為陽性對照，以肝組織中HBcAg不表達為陰性對照，切片厚3～4 μm，65 ℃烤箱烤片1 h。

1.2 試劑 一抗HBcAg、EliVision二抗試劑盒、檸檬酸修復(fù)液(pH 6.0)、EDTA修復(fù)液(pH 9.0)、胰酶、DAB顯色試劑盒，均購自福州邁新公司。

1.3 方法 (1)檸檬酸高壓修復(fù)法：將檸檬酸修復(fù)液按1 ∶100蒸餾水稀釋后倒入高壓鍋中加熱至沸騰，放入脫蠟水化好的切片，繼續(xù)加熱至噴氣，2 min后移除熱源，冷卻至室溫；(2)EDTA煮沸修復(fù)法：將EDTA修復(fù)液按1 ∶50蒸餾水稀釋后加熱至沸騰，放入脫蠟水化好的切片，維持最低檔溫度繼續(xù)加熱煮沸，20 min后移除熱源，冷卻至室溫；(3)胰酶消化修復(fù)法：脫蠟水化后切片分別滴加胰酶50～100 μL，放入濕盒中37 ℃溫箱孵育20 min，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)；(4)未修復(fù)法：組織切片經(jīng)脫蠟水化后未做特殊處理。按照上述方法處理后的切片經(jīng)PBS沖洗1次，3%H2O2孵育10 min；PBS沖洗1次滴加一抗HBcAg，室溫25 ℃孵育120 min，PBS沖洗3次×3 min，滴加增強劑A，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次滴加二抗B，室溫孵育30 min，PBS沖洗，DAB室溫顯色4 min，自來水沖洗，終止顯色，蘇木精復(fù)染1 min，0.5%鹽酸乙醇分化10 s，0.5%氨水返藍30 s，流水沖洗5 min，常規(guī)脫水、透明、封固。

1.4 結(jié)果判定 HBcAg呈棕黃色為陽性，主要定位于胞核或核周胞質(zhì)，根據(jù)表達的強弱可以分為無陽性著色為陰性(-)，淡黃色為陽性(+)，深棕色為強陽性()。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間兩兩比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

60例切片分別經(jīng)高壓、煮沸、酶消化、未修復(fù)4種方法處理，HBcAg表達情況如下。(1)檸檬酸高壓修復(fù)：59例(-)、1例(+)，陰陽性對照組均無表達；(2)EDTA煮沸加熱修復(fù)：55例(-)、5例(+)，陽性對照組弱表達，陰性對照組無表達；(3)胰酶消化修復(fù)：57例(-)、3例(+)，陽性對照組弱表達，陰性對照組無表達；(4)未修復(fù)：53例(-)、1例(+)、6例()，陽性對照組強表達，陰性對照組無表達(圖1～4)。

3 討論

近年國內(nèi)病理學(xué)及美國病理醫(yī)師和腫瘤學(xué)會相繼公布相關(guān)免疫組化染色規(guī)范章程[1]，明確規(guī)定病理標本必須經(jīng)10%中性福爾馬林固定。甲醛是應(yīng)用最廣泛的固定液，經(jīng)甲醛固定的組織形態(tài)學(xué)良好，能有效保持細胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)的完整性及保存組織細胞內(nèi)的各有效成分。但是甲醛固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內(nèi)或分子間形成醛鍵，使組織中抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡(luò)，也導(dǎo)致抗原決定簇被掩蓋，使部分抗原不能與抗體很好地進行反應(yīng)，需通過一定的方法修復(fù)才能有效進行免疫組化染色?？乖迯?fù)能把因甲醛固定而改變的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重新恢復(fù)，使免疫組化染色獲得新鮮組織的染色效果[2]。因此，抗原修復(fù)是免疫組化染色中非常關(guān)鍵的步驟。常用的抗原修復(fù)法包括熱修復(fù)和酶消化等。加熱抗原修復(fù)技術(shù)的發(fā)明被譽為病理學(xué)以及免疫組化的革命性突破[3]。自Shi等[4]首次提出以來，現(xiàn)已應(yīng)用于日常免疫組化染色中。加熱抗原修復(fù)主要能使甲醛固定過程中發(fā)生交聯(lián)的蛋白質(zhì)解離，進而暴露與抗體結(jié)合的抗原位點，最大程度地恢復(fù)在制片過程中損失的抗原性，使原來認為不能在石蠟切片上進行免疫組化的許多抗體獲得良好的染色效果。加熱修復(fù)包括高壓修復(fù)、水浴加熱修復(fù)和微波修復(fù)等。酶消化修復(fù)也是抗原修復(fù)的一種，其原理主要是通過消化作用破壞甲醛固定產(chǎn)生的蛋白交聯(lián)，使抗原位點暴露；酶消化修復(fù)中用于消化的酶包括胰酶、蛋白酶及胃酶等。

①②③④

圖1 檸檬酸高壓修復(fù)：HBcAg無表達，EliVision法 圖2 EDTA煮沸加熱修復(fù)：HBcAg呈弱表達，EliVision法 圖3 胰酶消化修復(fù)：HBcAg無表達，EliVision法 圖4 未修復(fù)：HBcAg呈強表達，EliVision法

本實驗60例肝穿刺組織切片HBcAg染色分別選擇高壓加熱、煮沸加熱、胰酶消化以及未修復(fù)4種不同抗原的修復(fù)方式，結(jié)果顯示高壓加熱修復(fù)僅1例弱表達；煮沸加熱修復(fù)5例弱表達；胰酶消化修復(fù)3例弱表達；未修復(fù)1例弱表達，6例強表達。陽性對照組織切片高壓加熱修復(fù)時無表達，煮沸加熱及胰酶消化修復(fù)時弱表達，未修復(fù)時強表達。提示未修復(fù)處理效果最佳，煮沸加熱修復(fù)和胰酶修復(fù)次之，高壓修復(fù)效果最差。目前對于免疫組化過程中因甲醛固定引起的抗原封閉，應(yīng)使用抗原熱修復(fù)，打開引起抗原封閉的醛鍵以及交聯(lián)蛋白，更充分地暴露抗原、增強染色。高溫高壓熱修復(fù)法被認為是大多數(shù)抗原修復(fù)最為穩(wěn)定和有效的方法之一[5-6]，然而本組實驗結(jié)果與之相反，未修復(fù)的切片表達效果最好，高溫高壓修復(fù)的切片則表達最差。作者認為可能由于HBcAg是乙肝病毒的核殼結(jié)構(gòu)蛋白，屬于乙肝病毒的一部分，并非人體組織結(jié)構(gòu)成分，因而甲醛固定時并不一定被其封閉。根據(jù)Mason等[7]報道甲醛固定所致的蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)提供加熱修復(fù)抗原的可能性，甲醛與蛋白質(zhì)的交聯(lián)物保存抗原的分子結(jié)構(gòu)，使其免受高溫加熱的影響，而加熱能打斷交聯(lián)物，暴露抗原達到修復(fù)的目的。提示抗原被甲醛固定封閉是加熱抗原修復(fù)取得良好效果的前提，但如果抗原未被甲醛固定封閉，加熱修復(fù)反而因為高溫使蛋白質(zhì)抗原發(fā)生變性，失去與抗體結(jié)合的能力，從而減弱表達甚至不表達。本組實驗也恰好驗證這一結(jié)果，高壓修復(fù)組因為修復(fù)最為激烈，溫度達120 ℃使抗原破壞最為嚴重，表達效果最差；水浴修復(fù)組修復(fù)溫度100 ℃和胰酶消化組修復(fù)相對較為緩和，表達效果較高溫高壓修復(fù)組略好；未修復(fù)組抗原未受破壞，表達效果最好。

綜上所述，抗原修復(fù)方法應(yīng)用是否得當，直接影響抗體的表達效果，影響病理診斷的準確性。不同抗原具有各自最佳抗原修復(fù)條件，沒有一種抗原修復(fù)方法適合所有抗原。對于大多數(shù)抗原一般提倡熱修復(fù)法，但對于某些特殊抗原如HBcAg作用有限，甚至起反作用。因此，合理選擇抗原修復(fù)方法需要在實際操作過程中反復(fù)摸索、不斷完善。

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福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院病理科，福州 350001

黃建平，男，主管技師。E-mail： 45678197@qq.com

時間：2017-5-17 23:54 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.027.html

R 392.3

B

1001-7399(2017)05-0577-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.027

接受日期：2017-03-26