田一雄,趙 偉,*,陳曉嬋,楊瑞金

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

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二維電泳技術(shù)對脈沖電場處理哈密瓜汁中釀酒酵母的蛋白質(zhì)組學研究

田一雄1,趙 偉1,*,陳曉嬋2,楊瑞金2

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

采用二維電泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技術(shù)對脈沖電場(pulsed electric field,PEF)處理前后哈密瓜汁中釀酒酵母蛋白質(zhì)進行檢測分析,探究處理過程對釀酒酵母蛋白表達的影響。實驗結(jié)果得知,所有檢測出的酵母蛋白等電點均介于4.00與6.87之間,分子量分布在14.58～109.83 kDa之間;PEF處理后的釀酒酵母為免受環(huán)境變化帶來的氧化損傷,細胞中硫氧還蛋白過氧化物酶、延長因子2表達上調(diào);并且因場強影響到了細胞的遺傳物質(zhì),核染色質(zhì)蛋白和DNA修復蛋白表達上調(diào);此外,細胞中Cu-Zn輔基超氧化物歧化酶和與糖原合成與代謝密切相關(guān)的磷酸丙酮酸水合酶的表達下調(diào),反映細胞的活力下降或死亡;與細胞生存和增殖相關(guān)蛋白的表達也發(fā)生了明顯的變化,如胱硫醚β-合酶、腺苷5-單磷酰胺酶、非典型蛋白Ynr034w-A亞基等。PEF處理影響到細胞代謝的相關(guān)酶類和遺傳物質(zhì),可為研究PEF強化殺菌方法提供理論依據(jù)。

高壓脈沖電場技術(shù)(PEF),非熱加工技術(shù),二維電泳技術(shù),釀酒酵母蛋白

脈沖電場(Pulsed electric field,PEF)技術(shù)作為一種新型的食品非熱加工技術(shù),具有能耗低、處理溫度低、食品品質(zhì)保存效果好、設備穩(wěn)定性好及連續(xù)性處理等優(yōu)點,近年來受到國內(nèi)外政府及企業(yè)的高度重視[1]。脈沖電場對液態(tài)食品的滅菌效果不僅取決于微生物本身,同時還受電導率、離子強度、pH、水分活度、黏度、氣泡等因素的影響[2]。有研究表明,在較高場強(30 kV/cm,400 μs),處理溫度45 ℃時對啤酒中的釀酒酵母有較好的滅菌效果[3]。

哈密瓜汁為熱敏性果汁,熱處理會產(chǎn)生令消費者無法接受的風味,然而哈密瓜汁具有低電導率特點,通過脈沖電場處理可實現(xiàn)較好的滅菌效果[4]。本文選擇以低電導率的哈密瓜汁為介質(zhì),用PEF處理果汁中的釀酒酵母,從蛋白質(zhì)組學的角度解釋PEF處理對釀酒酵母蛋白質(zhì)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母BY4742 Open Biosystem;新疆西州蜜哈密瓜 無錫華潤萬家超市;IPG膠條、CHAPS、礦物油、電極紙片、尿素 美國Bio-Rad公司;N,N-亞甲雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、SDS、β-巰基乙醇 美國Sigma公司;實驗室常用試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

OSU-4L型PEF連續(xù)處理設備 美國俄亥俄州立大學;DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;QYC2102-C型恒溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械有限公司;冷凍離心機 艾本德中國有限公司;IPGhor等電聚焦儀 GE Healthcare公司;DALT-SIX SDS-PAGE電泳儀、ImageScanner 掃描儀 GE Healthcare公司;PDquest 分析軟件 Bio-Rad公司;ABI 5800 MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國 AB SCIEX 公司;酸度計 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;UV-1100型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;DD-11C型電導率儀 上海精密科學儀器有限公司;其他儀器設備 均為實驗室常用儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 哈密瓜汁的制備 市售的新鮮哈密瓜進行削皮、去籽后用組織搗碎機搗碎,果漿用離心機離心(9000 r/min,10 min)取上清液。將離心好的上清液進行抽濾,濾液用去離子水調(diào)節(jié)電導率到2000 μs/cm。

1.2.2 微生物的活化培養(yǎng) 從酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂斜面培養(yǎng)基中取釀酒酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中在30 ℃、200 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)14 h至酵母細胞生長穩(wěn)定期[5]。取菌液進行離心(9500 r/min,10 min),將離心好的菌體用無菌水清洗并再次離心(9500 r/min,10 min),將離心好的菌體收集備用。

1.2.3 微生物的接種 按照上述哈密瓜汁制備方法制備哈密瓜汁,將離心好的釀酒酵母加入到適量的哈密瓜汁中,使菌體最終濃度為106～107CFU/mL。

1.2.4 哈密瓜汁的PEF處理 實驗采用實驗室規(guī)模的OSU-4L型連續(xù)處理設備處理(20 kV/cm,200 μs,脈沖頻率200 Hz,脈寬2 μs),管路依次用4% NaOH、10%的市售84消毒液和無菌水依次清洗使管路保持無菌狀態(tài)。物料從進料口泵入,依次通過3對處理腔(電極間距為0.29 cm),處理后流經(jīng)10 ℃的恒溫水浴鍋冷卻,并讀數(shù)。

1.3 測定方法

1.3.1 釀酒酵母蛋白的提取與定量 根據(jù)1.2.1方法將處理好的液體樣品離心取離心好的釀酒酵母用無菌水清洗并離心兩次,離心好的菌體取出并加入液氮,充分研磨;在研磨好的樣品中加入蛋白裂解液在30 ℃下溶解1 h,使蛋白充分溶解;將溶解后的蛋白液離心(9500 r/min,15 min),取上清液,重復兩次。采用Bradford法[6]測定上清液中蛋白濃度,并儲存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.2 第一向固相pH梯度等電聚焦 取200 μg蛋白樣品,與一定量的樣品水化液(9 mol/L尿素+4% CHAPS+1% IPG buffer(GE Healthcare)+1% DTT+痕量溴酚藍)混合,使得總體積為450 μL。從冰箱中取出低溫保存的IPG膠條(GE Healthcare,24 cm,pH=4～7),在室溫下放置10 min。在聚焦槽中緩慢加入蛋白樣品,將膠條下面緩慢覆蓋在蛋白樣品上。在每根膠條的支持膜面緩慢加上2 mL礦物油,準備完畢后開始等電聚焦程序。等電聚焦參數(shù):溫度 20 ℃、最大電流為50 μA/膠條。水化在50 V低電壓下進行12 h,然后經(jīng)過500 V下1 h、1000 V下1 h,而后1 h內(nèi)梯度升高到10000 V,并保持10 h。

1.3.3 第二向垂直板SDS-PAGE電泳 將聚焦好的IPG膠條取下,在平衡緩沖液1(6 mol/L尿素+50 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)+30%甘油+2% SDS+1% DTT+痕量溴酚藍)和平衡緩沖液2(6 mol/L尿素+50 mmol/L Tris-HCl(pH8.8)+30%甘油+2% SDS+2.5%碘乙酰胺+痕量溴酚藍)中各平衡15 min。將膠條放到第二向SDS-PAGE凝膠的上表面,使膠條與SDS-PAGE凝膠的膠面充分接觸,用瓊脂固定,進行電泳:水浴循環(huán)儀設定溫度為15 ℃;電泳設置為100 V、45 min;至溴酚藍前沿剛好跑出凝膠。電泳結(jié)束后取出凝膠進行染色。

1.3.4 雙向凝膠電泳EMBL銀染方法(質(zhì)譜兼容) 參考Shevchenko等[6]的銀染方法對凝膠進行染色?；静僮饕来问?50%甲醇+5%冰乙酸固定20 min;50%甲醇洗脫10 min;500 mL超純水水洗10 min;0.02%硫代硫酸鈉敏化1 min;500 mL超純水水洗1 min;0.1%硝酸銀4 ℃下進行銀染20 min;500 mL超純水水洗兩次各1 min;0.04%甲醛+2% Na2CO3進行顯色至斑點清晰;5%冰乙酸終止30 min;用30%乙醇+4.6%甘油保存。

1.3.5 凝膠掃描以及圖像分析 用mageScanner掃描儀對染色后的凝膠進行掃描,并采用PDquest 8.0軟件對所得的圖像分析。將處理組和對照組的雙向電泳圖片進行比較,選取以變化倍數(shù)大于5或小于0.2的蛋白點為差異蛋白,進行質(zhì)譜分析。

1.3.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析

1.3.6.1 蛋白質(zhì)酶解 操作步驟依次為:100 μL去離子水清洗膠點兩次;吸出去離子水,每管加入酶解脫色液(15 mmol/L K3Fe9(CN)6+50 mmol/L NaS2O3)50 μL待顏色完全脫去后吸出液體,然后加入200 μL去離子水停止反應;吸出去離子水,并用200 μL去離子水清洗膠點兩次;加入25 mmol/L NH4HCO3350 μL吸脹5 min后,吸出液體;加50%乙腈100 μL,5 min后吸出液體;加100 %乙腈100 μL脫水,至膠塊完全變白即可,吸出液體;取離心管每管加入2～4 μL酶液(用含10% 乙腈+25 mmol/L NH4HCO3+1 g/L溶于50 mmol/L乙酸中的胰蛋白酶(Promega)溶液配至成終濃度為0.02 μg/μL的酶解工作液),充分吸漲后加20 μL覆蓋液(25 mmol/L NH4HCO3+10%乙腈水溶液);37 ℃恒溫水浴鍋酶解16 h;溶液轉(zhuǎn)移至新離心管中,膠粒采用50 μL萃取液(5%TFA+67%乙腈水溶液)抽提,合并蛋白萃取液和之前的溶液,冷凍干燥,待做質(zhì)譜。

表1 釀酒酵母蛋白點的等電點與分子量分布Table 1 Isoelectric point and molecular weight distribution of Saccharomyces cerevisiae protein spots

1.3.6.2 質(zhì)譜鑒定 將干粉重新溶解于5 μL含0.1% TFA的溶液中,然后按照1∶1的比例與含50% ACN和1% TFA的α-氰基-4-羥基肉桂酸飽和溶液混合;取1 μL樣品進行質(zhì)譜點靶鑒定;采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式進行數(shù)據(jù)采集;將一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)整合并使用GPS 3.6(Applied Biosystems)和Mascot2.3(Matrix Science)軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析和蛋白鑒定;并在NCBInr-Fungi 數(shù)據(jù)庫中檢索。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母蛋白質(zhì)的2-DE分析

圖1所示為釀酒酵母處理前后細胞蛋白質(zhì)的2-DE圖譜,水平方向為第一向固相pH梯度等電聚焦(IEF),垂直向為第二向垂直板SDS-PAGE電泳。其中未處理樣品中共得到926個蛋白點,PEF處理樣品得到851個蛋白點。

圖1 不同條件下釀酒酵母蛋白雙向電泳圖Fig.1 2-DE of Saccharomyces cerevisiae under different condition

由圖1可知,未處理和PEF處理(20 kV/cm、200 μs)樣品中釀酒酵母蛋白質(zhì)的等電點均分布在4.00～6.87之間。從分子量分布上來看,所檢測出的酵母蛋白分子量分布在14.58～109.83 kDa之間，分子量分布在處理后不同分子量范圍內(nèi)的樣品的蛋白點數(shù)比未處理樣品均有所減少。具體等電點和分子量分布如表1。

將未處理樣品和PEF處理樣品的2-DE圖進行匹配,尋找差異點,匹配結(jié)果如圖2所示。

圖2 釀酒酵母蛋白點匹配結(jié)果Fig.2 Protein spots matching in Saccharomyces cerevisiae

圖2a為未處理樣品,圖2b為處理樣品;由于高強度電場處理,釀酒酵母細胞受到不同程度的影響,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達發(fā)生了不同程度的變化。以未處理樣品為對照組選取差異倍數(shù)大于5(表達明顯上調(diào))和小于0.2(表達明顯下調(diào))的蛋白點。結(jié)果得到明顯下調(diào)的蛋白點42個,明顯上調(diào)的蛋白點35個。剩余90.95%的蛋白點未發(fā)生明顯變化。通過結(jié)果可以得出,經(jīng)過PEF處理,釀酒酵母蛋白的表達變化顯著(p<0.05),但蛋白質(zhì)的等電點和分子量分布沒有發(fā)生較大變化。

2.2 PEF處理前后釀酒酵母差異蛋白的分析與鑒定

對表達差異顯著的釀酒酵母蛋白,利用PDquest分析軟件分析,從中選取35個差異蛋白點進行質(zhì)譜和功能鑒定。用胰蛋白酶酶解選取的35種蛋白點,對水解后的多肽片段進行質(zhì)譜鑒定,在NCBInr-Fungi數(shù)據(jù)庫中檢索,得到35個蛋白點的鑒定信息,如表2所示。

表2 釀酒酵母差異蛋白點鑒定結(jié)果Table 2 Identification of differentially expressed proteins in Saccharomyces cerevisiae

在UniProt數(shù)據(jù)庫中搜索上述35個蛋白點功能信息,結(jié)果如下:

蛋白點1為原肌球蛋白(Tpm2p),原肌球蛋白在肌肉收縮過程中起著重要作用,影響并調(diào)控肌動球蛋白之間相互作用[7]。在釀酒酵母細胞中主要構(gòu)成細胞形態(tài)并與細胞器分布有關(guān)[8-9]。

蛋白點2為翻譯機制相關(guān)蛋白17(Translation machinery-associated protein 17)。是一種ATP酶伴侶，協(xié)助RPT6-TPT3 ATP酶對形成。用于維持穩(wěn)態(tài)的蛋白酶體水平并在組裝蛋白酶時起到關(guān)鍵作用,如蛋白酶的伸縮和RPN14功能的重疊。

蛋白點3、5為Egd2p。主要存在于細胞質(zhì)中,參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運[10]。

蛋白點4為驅(qū)動蛋白相關(guān)蛋白SMY1(Kinesin-related protein SMY1),此種蛋白質(zhì)可能與細胞微管運動有關(guān),可代替肌球蛋白2(myo2)[11-14]。

蛋白點6、7、8為硫氧還蛋白過氧化物酶(Tsa1p),該種蛋白質(zhì)與核糖體結(jié)合,維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài),保持細胞對氧化應激的反應,分子伴侶介導的蛋白質(zhì)折疊,DNA損傷檢驗和DNA保護等有關(guān)[15-16]。

蛋白點9為Sba1p,能夠結(jié)合DNA進行調(diào)控,與端粒酶對端粒維持的正向調(diào)節(jié)活動,端粒酶活性調(diào)控和蛋白質(zhì)的折疊有關(guān)[17-18]。

蛋白點10、13為熱應激蛋白(Hsp12p)。作用可能是對周圍環(huán)境作出應激反應[19-22]。

蛋白點11、14、25為磷酸丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase ENO2),主要和2-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸與水的縮合反應,參與糖酵解合成D-甘油醛3-磷酸丙酮酸[23]。

蛋白點12為高遷移率族非組蛋白核染色質(zhì)蛋白(High-mobility group non-histone chromatin protein)。其作用可能與INO80染色質(zhì)相互作用參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控[24-26]。

蛋白點15、16為Hmf1p,可能與異亮氨酸合成相關(guān)[27-28]。

蛋白點17、28、32為磷酸甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase),這種蛋白質(zhì)是參與糖酵解的關(guān)鍵酶,對甘油醛-3-丙酮酸合成起到關(guān)鍵作用[29]。

蛋白點18為延長因子2(Eft2p),與GTP結(jié)合,調(diào)節(jié)GTP酶活性。

蛋白點19為DNA修復蛋白RAD10(DNA repair protein RAD10),該種蛋白可以切除受紫外線等不良環(huán)境下異常的DNA,特異性的降解單鏈DNA[30-33]。

蛋白點20為熱休克蛋白70(Heat shock protein of HSP70 family)。該蛋白可以和與代謝相關(guān)的酶類結(jié)合,保護自己不受外界高溫環(huán)境對自身的傷害[34]。

蛋白點21為胱硫醚β-合酶(cystathionine beta-synthase),該酶是細胞內(nèi)同型半胱氨酸轉(zhuǎn)硫途徑代謝的關(guān)鍵酶。

蛋白點22為含Cu-Zn輔基超過氧化物歧化酶A亞基(Chain A,structure solution and molecular dynamics refinement of the yeast Cu,Zn enzyme superoxide dismutase),該酶能夠清除細胞內(nèi)的自由基[35]。

蛋白點23為類漿膜蛋白(Reticulon-like protein 1):該種蛋白主要存在于釀酒酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常運作起到調(diào)節(jié)穩(wěn)定作用[36]。

蛋白點24為應激蛋白70(stress-seventy subfamily A protein),該蛋白與ATP結(jié)合,維持能量代謝。

蛋白點26為二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase),該酶以延胡索酸為電子受體將二氫乳清酸轉(zhuǎn)化為乳清酸鹽[37]。

蛋白點27、31、33為未命名蛋白。

蛋白點29、30為腺苷5,-單磷酰胺酶,可以水解腺苷5,-單磷酰胺酯類物質(zhì)。釀酒酵母在半乳糖培養(yǎng)基上生長,該酶起到重要作用。

蛋白點34為ETF1p,該蛋白作為電子傳遞的載體,與黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合。

蛋白點35為非典型蛋白Ynr034w-A亞基,該酶參與細胞代謝[38-39]。

經(jīng)過PEF處理后,釀酒酵母中硫氧還蛋白過氧化物酶表達明顯上調(diào),該酶與細胞的自我防御密切相關(guān),說明PEF處理過程中釀酒酵母細胞為免受環(huán)境變化造成的損傷而啟動代謝調(diào)控來防止氧化損傷。延長因子2在蛋白質(zhì)合成過程中起到重要作用,其表達上調(diào),說明經(jīng)PEF處理,釀酒酵母細胞需要合成更多的蛋白質(zhì)以適應外界環(huán)境變化,推斷可能是一些酶類或膜蛋白等。核染色質(zhì)蛋白和DNA修復蛋白表達的上調(diào),說明細胞遺傳物質(zhì)在PEF處理過程中也受到了外界電場的影響,推測這有可能會有助于DNA的合成、復制及功能。PEF處理后,細胞Cu-Zn輔基超過氧化物歧化酶表達下調(diào),該酶在生物體內(nèi)的水平高低是衰老與死亡的直觀指標,且與糖原的合成與代謝密切相關(guān)的磷酸丙酮酸水合酶表達也發(fā)生下調(diào),說明經(jīng)過PEF處理,釀酒酵母細胞活力下降或死亡。此外,表達發(fā)生明顯變化的還包括一些與細胞生存和增殖相關(guān)蛋白,如胱硫醚β-合酶、腺苷5,-單磷酰胺酶、非典型蛋白Ynr034w-A亞基等。

3 結(jié)論

哈密瓜汁中釀酒酵母經(jīng)過PEF處理,細胞內(nèi)代謝相關(guān)的關(guān)鍵蛋白受到較大影響。細胞需要調(diào)控自身蛋白的合成來應對外界惡劣環(huán)境的變化,如延長因子2、硫氧還蛋白過氧化物酶、核染色質(zhì)蛋白和DNA修復蛋白表達上調(diào);與細胞活性相關(guān)的蛋白,如Cu-Zn輔基超過氧化物歧化酶和磷酸丙酮酸水合酶表達下調(diào);此外,釀酒酵母細胞蛋白質(zhì)表達發(fā)生明顯變化的還包括一些與細胞生存和增殖相關(guān)蛋白,如胱硫醚β-合酶、腺苷5,-單磷酰胺酶、非典型蛋白Ynr034w-A亞基等。目前高壓脈沖電場強化殺菌方法效果較好的有溫和熱協(xié)同和添加天然抑菌物質(zhì)的協(xié)同[40-41]。此外,我們還可以從這些酵母菌細胞發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)入手,尋求PEF強化殺菌的方法來達到較好的滅菌效果。從而有效延長貨架期,在果汁加工行業(yè)具有重大潛力。

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Study on proteomics ofSaccharomycescerevisiaetreated by pulsed electric field in Ha-mi melon juice using two dimensional electrophoresis technology

TIAN Yi-xiong1,ZHAO Wei1,*,CHEN Xiao-chan2,YANG Rui-jin2

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

:2-dimensional gel electrophoresis(2-DE)technology was used to detect and analyze the protein ofSaccharomycescerevisiaein Ha-mi melon juice before and after PEF treatment. On the basis of the experiment results,the isoelectric point of protein spots was between 4.00 and 6.87,the molecular weight of protein spots was 14.58～109.83 kDa. The expression of proteins was up regulated in order to avoid the damage result in environment change,such as thioredoxin peroxidase and elongation factor 2. Additionally,because of field strength,genetic materials were affected,so the expression of nuclear chromatin protein and DNA repair protein was up regulated. The proteins like Cu-Zn cofactor superoxide dismutase and pyruvate phosphatese were down expressed. It revealed that cells viability decreased or cells were dead. The expression of cell survival and proliferation related proteins also changed significantly such as cystathionineβ-synthase,adenosine 5- single phosphate amide,atypical protein Ynr034w-A subunit and so on. The treatment of PEF affected the enzyme relevant to metabolize and genetic material in cells. It can provide the theoretical basis for the study of intensified sterilization of PEF.

pulsed electric field(PEF);non thermal processing technology;2-dimensional gel electrophoresis(2-DE);Saccharomycescerevisiaeprotein

2016-12-02

田一雄(1992-),男,碩士研究生,研究方向:食品加工與配料,E-mail:372767129@qq.com。

*通訊作者:趙偉(1982-),男,博士,教授,研究方向:食品加工與配料,E-mail:zhaow@jiangnan.edu.cn。

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0400300);國家自然基金科學基金項目:(31522044);教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-13-0834);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目(JUSRP51406A)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)11-0128-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.016