陳藝強,李光進,金陳斌,許 峰,葉 艇,洪超群

(浙江新銀象生物工程有限公司,浙江臺州 317200)

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高純度Nisin的制備及工業(yè)生產(chǎn)條件的優(yōu)化

陳藝強,李光進,金陳斌,許 峰,葉 艇,洪超群

(浙江新銀象生物工程有限公司,浙江臺州 317200)

研究了一種制備高純度Nisin的方法。該方法采用弱酸性離子交換樹脂D113對Nisin濃縮液進行靜態(tài)吸附和動態(tài)解吸,然后將解吸液進行鹽析、抽濾、烘干、粉碎即得高純度Nisin。結(jié)果表明pH為6,吸附時間為90 min,解吸劑為1 mol/L、V鹽酸/V乙醇=1.25的鹽酸乙醇溶液,解吸速率為1 BV/h,鹽析所用氯化鈉濃度為23%為最佳條件,獲得的Nisin效價可達34000 IU/mg,收率達到67.45%,具有較好的工業(yè)應用前景。

高純度,乳酸鏈球菌素,離子交換

乳酸鏈球菌素又為乳酸鏈球菌肽,是一種由34個氨基酸殘基組成的抗菌肽[1],對Gram陽性菌有抑制作用,被認為是一種天然的,高效的食品防腐劑而廣泛應用于各類食品[2-3]。但是目前市場上銷售的都是純度較低的乳酸鏈球菌素鹽制劑,效價約為1000 IU/mg,雜質(zhì)較多且鹽含量高,對食品風味有一定的影響。而高純度乳酸鏈球菌素可用于解決此類問題,例如高純?nèi)樗徭溓蚓貞糜谘喔C,海參,濃縮果汁等[4-5]。此外還可用于醫(yī)藥領(lǐng)域的研究。例如治療奶牛乳房炎[6],進一步純化可用于頭、頸部鱗狀細胞癌癥的研究[7-8]。有關(guān)高純度Nisin制備的專利及文獻過去均有報導[9-11],但純度不是很高,嚴宇媛等人的工藝中Nisin效價只有28000 IU/mg,或者收率較低,葉萬榮等人的工藝收率只有30%,成本較高,不適合工業(yè)生產(chǎn)。本文研究的高純度Nisin制備工藝在以期在保證純度的同時保證較高的收率,適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Nisin標準品(sigma),Nisin濃縮液 浙江新銀象生物工程有限公司，由發(fā)酵液過濾后濃縮而成;離子交換樹脂110,D 113,122 安徽三星樹脂科技有限公司;D M130,HZ-8,D61樹脂 上海華震科技有限公司;乙醇 分析純,杭州高晶精細化工有限公司;鹽酸 分析純,浙江中星化工試劑有限公司;氯化鈉 分析純,西隴化工股份有限公司;蒸餾水等試劑。

SHZ-88A水浴恒溫振蕩器 太倉市實驗設備廠;DHG-9070A型恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;BT 100-2J型蠕動泵 longer pump;層析柱 5.3 cm×70 cm;DFY-300搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司。

1.2 靜態(tài)吸附與解吸實驗

1.2.1 樹脂的篩選 準確量取預處理好的6種樹脂各10 mL分別倒入250 mL錐形瓶中(其中110,D113,122均轉(zhuǎn)為鈉型樹脂),加入pH為3的Nisin濃縮液50 mL,25 ℃下將錐形瓶置于振蕩頻率為60 r/min的搖床吸附4 h。然后抽濾,用蒸餾水洗滌樹脂,濾液取樣檢測。然后將樹脂加入到100 mL濃度為1 mol/L的鹽酸乙醇溶液中在相同條件下解吸。4 h后抽濾,取解吸液檢測。并按如下公式計算吸附量,吸附率,解吸率[12]。

式(1)

式(2)

式(3)

收率(%)=吸附解吸收率×鹽析收率

式(4)

其中:C0為初始溶液中Nisin濃度;CP為吸附平衡時溶液中Nisin的濃度;m為樹脂的質(zhì)量;V為吸附液體積;Cj為解吸液中Nisin的濃度;Vj為解吸液體積。

1.2.2 吸附pH的影響 分別取4 L效價為100000 IU/mL左右的Nisin濃縮液6份,分別加入800 mL D113樹脂,于常溫下各自在pH為3、4、5、6、7、8下進行攪拌吸附。1.5 h后取樣檢測殘液中Nisin含量并計算吸附率。吸附完全后,分別上柱,動態(tài)解吸。解吸液鹽析、抽濾、烘干、粉碎并檢測成品效價。

1.2.3 吸附時間的影響 分別取4 L效價約為100000 IU/mL左右的 Nisin濃縮液5份,加入800 mL D113樹脂,常溫下在pH6時分別攪拌15、30、45、60、90 min。分別取樣檢測殘液中Nisin效價。

1.2.4 解吸劑配比實驗 計算并量取不同濃度的鹽酸與乙醇分別按體積比4∶1，2∶1，1.5∶1，1.25∶1，1.2∶1，1.1∶1，1∶1，1∶1.1，1∶1.3比例配成最終濃度為1 mol/L的鹽酸乙醇溶液,采用動態(tài)解吸法對已吸附好樹脂進行解吸,解吸時流速為1.0 BV/h,分別收集解吸液,檢測并記錄解吸收率。解吸液鹽析、抽濾、烘干粉碎并檢測成品效價。

1.2.5 解吸流速的影響 將V鹽酸/V乙醇=1.25的解吸劑分別以0.5,0.75,1.0,1.25,1.5 BV/h流速進行解吸,分別收集解吸液,檢測并記錄解吸收率。吸液鹽析、抽濾、烘干粉碎并檢測成品效價。

1.2.6 吸附pH,解吸劑配比,解析流速的正交實驗 考慮到吸附時間的交互作用較小,在單因素實驗基礎上分別以吸附pH,解吸劑配比,解吸流速進行L9(34)正交實驗,因素水平如表1所示,分別以效價和收率為指標,得出高純度Nisin制備的最佳工藝條件。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3 鹽析實驗

在最佳條件下吸附解吸,然后將解吸液分別加入15%、20%、23%、25%、27%、30%的氯化鈉鹽析,攪拌2 h。然后靜置12 h、抽濾、烘干、粉碎檢測效價并計算鹽析收率。

1.4 檢測方法

液體濃度與Nisin成品均采用GB1886.231-2016中的方法進行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂篩選結(jié)果

不同樹脂結(jié)果見表2。從表2中可以看出弱酸性樹脂的吸附量均大于強酸性樹脂的吸附量,這可能是由于Nisin以離子形式存在時,強酸性樹脂吸附氫離子的能力要大于Nisin。而弱酸性陽離子樹脂由于轉(zhuǎn)為鈉型之后,其對鈉離子的吸附選擇性要小于Nisin。從而造成它們的吸附容量差別很大。大孔吸附樹脂DM130由于其物理吸附性能以及依靠其孔徑大小而具有選擇性,其吸附量介于強酸性樹脂和弱酸性樹脂之間,理論上我們可以根據(jù)孔徑的大小選擇一種更為合適的樹脂,但是實驗中發(fā)現(xiàn)大孔樹脂解吸液中的雜質(zhì)含量并沒有降低,起不到除雜質(zhì)的作用,而離子交換樹脂能明顯降低雜質(zhì)的含量。弱酸性陽離子樹脂中又以D113的吸附解吸性能較優(yōu),因為其兼?zhèn)浯罂讟渲奈阶饔煤碗x子交換能力,綜合以上因素考慮,選擇D113作為合適的吸附樹脂。

表2 樹脂的吸附解吸性能參數(shù)Table 2 Performance parameters of resin adsorption and desorption

2.2 吸附pH的影響

從圖1中看出隨著pH升高,效價不斷的升高,呈遞增狀態(tài)。實驗中發(fā)現(xiàn)當pH在4～5之間的時候有大量絮狀析出,絮狀物經(jīng)調(diào)pH重新溶解后檢測到里面含有部分Nisin。

圖1 吸附pH與效價、收率關(guān)系圖Fig.1 Relationship of adsorption pH,yield and potency

此絮狀物經(jīng)烘干稱量后發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量遠大于相同效價的Nisin重量,推測其為雜蛋白,此pH區(qū)間為雜蛋白的等電點區(qū)間。而Nisin的等電點在9.5左右[13],當pH超過5時雜蛋白以陰離子形式存在,不被樹脂吸附,相反Nisin卻能繼續(xù)被樹脂吸附。因此，當pH3時,樹脂的選擇性很差，而pH從3升至4時其效價差別較大，同時由于Nisin的穩(wěn)定性受pH影響[14],當pH大于6時,其收率急劇下跌,綜合考慮pH6作為吸附pH比較合理。

2.3 吸附時間的影響

考慮到吸附時間對成品效價影響不大,主要考察了其對吸附殘液效價的影響。結(jié)果如圖2所示。吸附時間為15 min時,將近85%的Nisin已被吸附,之后延長吸附時間,吸附速度明顯降低,90 min時溶液中的Nisin已被吸附完全。表明90 min作為最佳吸附時間較合理。

圖2 吸附殘液效價-時間圖Fig.2 Time profile of adsorption raffinate potency

2.4 解吸劑配比對高純度Nisin收率的影響

單純采用酸水或者乙醇均不能很好地將吸附在樹脂中的Nisin解吸下來。本文采用酸水與乙醇的混合溶液進行解吸,解吸效果如圖3所示。V鹽酸/V乙醇比例在1附近時,其收率較高,都在85%以上,比例為1.25時達到最高95.93%,比例大于1.25或小于0.91時均收率下降明顯?？赡苁荄113具備離子交換和大孔樹脂的物理吸附能力,鹽酸比例的升高,氫離子濃度增大,從而使Nisin更多的被交換下來,但同時又考慮到乙醇對大孔樹脂的解吸能力,所以其比例過高或者過低均不利于解吸。同時V鹽酸/V乙醇比例小于1.25時其效價較高,均在35000 IU/mL左右,比例大于1.25時效價下降明顯。效價隨著鹽酸用量的加大呈下降趨勢,可能是雜質(zhì)所帶電荷與Nisin相同,但其吸附能力較Nisin更強?？紤]到效價與收率的因素,V鹽酸/V乙醇=1.25是較為合適的解吸劑配比。

圖3 解吸劑配比與收率、效價關(guān)系圖Fig.3 Relationship of desorption rate,yield and potency

2.5 解吸流速對高純度Nisin收率的影響

分別以0.5,0.75,1.0,1.25,1.5 BV/h流速進行解吸,結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出解吸速率對收率以及效價的影響并不是很大,但是在解吸速率為1.0 BV/h時收率為最高達到93.3%。

圖4 Nisin解吸流速、收率、效價關(guān)系圖Fig.4 Relationship of desorption flow,yield and potency

2.6 正交實驗

考慮到多因素的交互關(guān)系,設計了相關(guān)的正交實驗,實驗結(jié)果如表3所示,對效價來說極差最大的是B,因素主次順序為B>C>A,最優(yōu)組合為B1C2A3。對收率來說因素主次順序為B>A>C,最優(yōu)組合為B1C2A2?？紤]到A因素在兩個指標中的主次順序,我們選擇B1C2A2作為最佳組合,即吸附pH為6,解吸劑比例V鹽酸/V乙醇為1.25∶1,解吸流速為1.0 BV/h作為最佳工藝條件,此時,效價為35105 IU/mg,收率為90.79%。

表3 吸附,解吸正交實驗表Table 3 Orthogonal experiment table of Adsorption and desorption

2.7 鹽析實驗

在以上正交實驗最佳條件下吸附解吸,然后在解吸液中分別加入15%、20%、23%、25%、27%、30%的氯化鈉進行鹽析,鹽析結(jié)果如圖5所示。鹽析成品效價隨著氯化鈉的加入量呈下降趨勢,鹽析收率隨氯化鈉的用量呈上升趨勢,當氯化鈉的用量大于23%時,收率變化不大,在23%時收率達到74.29%左右?？偸章蕿?0.79%×74.29%=67.45%,且此時Nisin效價達到34180 IU/mg,考慮到工業(yè)生產(chǎn)對收率的需求,選擇濃度為23%的氯化鈉來進行鹽析。

圖5 不同氯化鈉濃度鹽析圖Fig.5 Effect of different NaCl concentration in salting out process

3 結(jié)論與討論

綜合以上實驗結(jié)果分析,影響Nisin純度的主要因素有樹脂吸附時的pH、吸附劑配比、解吸速度以及鹽析時氯化鈉的用量,而這些因素均會影響到成品的收率,既考慮到純度要求,同時又考慮到工業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟效益,所以本實驗選擇的工藝條件是:樹脂采用D113弱酸性陽離子交換樹脂,吸附pH為6,吸附時間90 min,解吸劑比例V鹽酸/V乙醇為1.25∶1,解吸流速為1.0 BV/h,23%的氯化鈉進行鹽析。此工藝可獲得效價大于34000 IU/mg的Nisin粉,同時總收率能達到67.45%。獲得的Nisin可進一步提純以用于醫(yī)藥領(lǐng)域,未來市場及其可觀。

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Preparation of high- purity Nisin and the optimization of industrial scale production conditions

CHEN Yi-qiang,LI Guang-jin,JIN Chen-bin,XU Feng,YE Ting,HONG Chao-Qun

(Zhe Jiang Silver-Elephant Bio-Engineering Company,Taizhou 317200,China)

In this study,a new method of preparation high-purity Nisin preparation was researched. The method adopted static adsorption and dynamic desorption of Nisin concentrated solution at a weak acidic ion exchange resin D113.The subsequent production process included salting out,suction filtration,drying and crushing to obtain high-purity Nisin. The results showed that the optimum condition was pH6,adsorption time 90 min,CDesorption agent=1 mol/L,VHCl/VEtOHl=1.25,desorption rate 1 BV/h,CNaCl=23% in salting out. The potency of Nisin attained through this procedure was 34000 IU/mg,total yield reached 67.45%.The method has bright prospect in industrial application.

high-purity;Nisin;ion exchange

2016-12-29

陳藝強(1966-),男,本科,工程師,研究方向:發(fā)酵產(chǎn)品工藝優(yōu)化,E-mail:chenyiq8668@163.com。

TS202

A

1002-0306(2017)11-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.045