余仲東 陳祖靜 曹支敏 任爭爭 馮世強 張瑤琦

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風景園林學(xué)院 廣州 510642； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院 楊凌 712100； 4.遼寧省林業(yè)有害生物防治檢疫局 沈陽 110804； 5.沈陽市渾南區(qū)林業(yè)局 沈陽 110163)

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松楊柵銹菌無毒基因型性狀分離及AvrL567同源序列分析

余仲東1陳祖靜2曹支敏1任爭爭3馮世強4張瑤琦5

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風景園林學(xué)院 廣州 510642； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院 楊凌 712100； 4.遼寧省林業(yè)有害生物防治檢疫局 沈陽 110804； 5.沈陽市渾南區(qū)林業(yè)局 沈陽 110163)

【目的】 分析松楊柵銹菌小種無毒基因型性狀分離規(guī)律和其無毒基因序列與歐美小種無毒基因序列的差異和系統(tǒng)學(xué)關(guān)系?！痉椒ā?以秦嶺厚畛子落葉松上松楊柵銹菌2號小種HZ3542的性子器為雄性親本，與秦嶺火地塘落葉松上2號小種HF2369性子器為雌性親本進行人工有性雜交，初步獲得F1代銹孢子堆。通過對太白楊離體葉片接種反應(yīng)型統(tǒng)計，分析松楊柵銹菌2號生理小種無毒基因型，并根據(jù)亞麻銹菌無毒基因AvrL567(accession： AAS66952)設(shè)計和篩選引物，利用同源擴增技術(shù)，對松楊柵銹菌無毒基因片段進行PCR擴增，經(jīng)測序、比對后構(gòu)建最大似然系統(tǒng)樹?！窘Y(jié)果】 2號生理小種無毒基因表現(xiàn)型符合孟德爾分離定律，來自秦嶺厚畛子太白楊不親和性親本為Aa無毒基因型，來自秦嶺火地塘的親和性親本為aa基因型。在F1代銹孢子堆群體(P=0.01)和F1代夏孢子堆群體(P=0.05)中，抗∶感表現(xiàn)型均按1∶1分離。無毒基因型以壞死斑有無和褪綠斑大小為重要標準，潛育期長短和夏孢子堆密度、直徑大小等數(shù)量性狀為輔助標準進行判斷，并在PCR擴增中得到檢驗和證實。篩選引物對AvrPr1(5′-TAATCCTCGTTGACATCAGTC-3′,5′-AAGCTTGAGAGCTCCGCTC-3′，Tm=53.5 ℃)可以穩(wěn)定擴增出800～900 bp的產(chǎn)物。ML系統(tǒng)樹表明，真菌無毒基因序列總體上同源性較低，但本研究所供試的17條序列可分為2個群，柵銹菌無毒基因序列聚在一個分支上，其中5條中國松楊柵銹菌無毒基因序列同加拿大2條MLP無毒基因序列聚在同一個亞分枝上，另一條序列與法國松楊柵銹菌、美國亞麻銹菌等菌聚在另一個亞分支上?！窘Y(jié)論】 中國松楊柵銹菌2號小種無毒基因為單顯性遺傳，其無毒基因序列同加拿大的小種無毒基因序列同源性高。

松楊柵銹菌； 無毒基因； 遺傳分離； 系統(tǒng)進化樹

無毒基因在病原物-寄主互作中，是影響寄主對小種垂直抗病性選擇的關(guān)鍵因子。無毒基因編碼激發(fā)子，與寄主抗病基因編碼蛋白直接或間接識別和結(jié)合后產(chǎn)生信號分子，從而引起或誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)(Flor, 1971)，使寄主細胞膜結(jié)構(gòu)改變、消解，或產(chǎn)生活性氧，或產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)基因表達(Dangl, 1994)。也有人認為無毒基因直接編碼毒性因子，殺死寄主細胞從而獲取營養(yǎng)物質(zhì)(Laugeetal., 1998)。在丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的Ⅲ型誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)中(Haucketal., 2003)，AvrPto與Pto相結(jié)合并改變接受蛋白空間結(jié)構(gòu)，從而激發(fā)包括活性氧爆發(fā)、基因表達、細胞壁加固等一系列防衛(wèi)反應(yīng)。在已分離的300余種無毒基因效應(yīng)蛋白分子中，大多數(shù)分子都含有NB-LRR結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)和傳導(dǎo)信號上發(fā)揮重要作用，其中主要有水楊酸途徑、茉莉酸途徑和乙烯途徑等途徑中的20多種信號傳導(dǎo)相關(guān)因子(Innesetal.， 1993)。無毒基因蛋白并無功能同源性(Attardetal., 2002; Vivianetal., 2002)，在序列結(jié)構(gòu)上，部分無毒基因表現(xiàn)為高度保守的重復(fù)序列(Linningetal., 2004； 張德水等, 1997)，如稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)的無毒基因高度保守，已被成功地用于該菌種內(nèi)系統(tǒng)學(xué)的研究(王建飛等， 2006)。在亞麻銹菌(M.lini)的F2代銹菌群體中，Dodds等(2004)發(fā)現(xiàn)一個與亞麻(Linumusitatissimum)抗銹性L5、L6、L7相關(guān)聯(lián)的復(fù)合無毒基因位點AvrL567，編碼銹菌吸器細胞中大小為127個氨基酸的分泌蛋白，可在亞麻和煙草(Nicotianatabacum)細胞內(nèi)誘導(dǎo)過敏性壞死。在已報道的1 184個松楊柵銹菌(M.larici-populina)的小分泌蛋白中，84%具有家系特異性并以基因家族形式出現(xiàn)(Duplessisetal., 2011)。Hacquard等(2012) 發(fā)現(xiàn)已描述的20個松楊柵銹菌小分泌蛋白具有63個同源性蛋白，其中8個與亞麻銹菌的AvrM同源，13個與AvrP4同源，1個與AvrL567同源，1個與AvrP123同源，3個與Uromycesfabae的轉(zhuǎn)運蛋白RTP1同源，其余大多數(shù)為夏孢子侵染時分泌的效應(yīng)蛋白。AvrM具有3個串聯(lián)子，基因間隔區(qū)為Pfam轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。AvrP4的C-端除包含6個絲氨酸殘基，其余部分高度變異。它與黃枝孢梅(Cladiosporiumfulvum)的Avr9蛋白(van den Hoovenetal., 2001)、一些毒蛋白或抑制子蛋白結(jié)構(gòu)相似(Pallaghyetal., 1994)。松楊柵銹菌的AvrL567同源基因蛋白同亞麻銹菌的AvrL567蛋白空間結(jié)構(gòu)相似，但在26-50氨基酸區(qū)域沒有RFYR傳導(dǎo)信號肽(Rafiqietal., 2010)，序列結(jié)構(gòu)較亞麻銹菌的保守。松楊柵銹菌的轉(zhuǎn)運蛋白RTP1與亞麻銹菌的吸器分泌蛋白HESP-327/RTP1相同，C-端保守而N-端高度變異，行使細胞核信號定位功能(Fernandezetal., 2012)。

大多數(shù)無毒基因以基因家族形式出現(xiàn)，并表現(xiàn)為連鎖顯性遺傳(Duplessisetal., 2011; Laugeetal., 1998)。Lawrence(2010)發(fā)現(xiàn)亞麻銹菌中有4個無毒基因家族，分別包含4，3，3,2個無毒基因。Dodds 等(2004)對亞麻銹菌的2個親本菌系雜交及F1代自交后代，用AvrL567片段探針的cDNA與RNA雜交結(jié)果顯示，AvrL567家族的A、B、C 3個基因總是連鎖遺傳分離，在對煙草、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的轉(zhuǎn)染中，表現(xiàn)為單顯遺傳。Zambino等(2000)通過分子標記及圖譜技術(shù)，掌握了禾柄銹菌(Pucciniagraminis)無毒基因數(shù)量、顯隱性表達方式、連鎖遺傳及變異規(guī)律，并認為禾柄銹菌無毒基因有8個，其中6個主要表現(xiàn)為單顯性遺傳，2個表現(xiàn)為雙顯性自由分離，但其中一個表現(xiàn)為偏分離遺傳，可能和抑制子基因連鎖有關(guān)。Newcombe (1998)發(fā)現(xiàn)M.medusaef.sp.deltoidae的無毒基因Mmd1在Populusdeltoides×P.trichocarpa的自交F2代中表現(xiàn)為3∶1的分離方式，但抗病楊樹個體上夏孢子堆的直徑、密度有顯著差異，在變量主成分(PCA)分析中，夏孢子堆直徑、密度占了66.6%的貢獻率，超過壞死反應(yīng)、夏孢子堆周長，并推測與AvrMmdl連鎖的QTLs基因在夏孢子堆直徑和密度大小等方面發(fā)揮作用。松楊柵銹菌中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，在MER無毒基因家族中串聯(lián)的微效基因控制著小種數(shù)量性狀(Lefevreetal., 1998)。

青楊銹病(M.larici-populina)是青楊(Populuscathayana)、黑楊(P.nigra)和它們的雜交種楊樹上危害嚴重的一種病害。歐洲、北美地區(qū)先后選育出了許多針對該銹病的歐美楊(Populus×euramericana)垂直抗病性無性系，如‘Hoogvorst’，‘Hazeendans’，‘Luisa’，‘Donk’，‘Ghoy’，‘Beaupre’等(Pinonetal., 1997)，能對E3、E4小種具有垂直抗病性，極大地促進了歐美地區(qū)楊樹速生豐產(chǎn)林的發(fā)展。但栽植過程中，最嚴重的問題是銹菌小種毒性變異和楊樹品種抗性的喪失。至今北美、歐洲已相繼報道了MLP的5個生理小種(E1—E5)，7種毒性基因(Vir1—Vir7)(Pinonetal., 1997; Steenackersetal., 1998)，我國也報道了MLP的5個生理小種(曹支敏, 2005)。目前，中國松楊柵銹菌小種與歐美小種在遺傳上的差異還未見報道，小種無毒基因多樣性、結(jié)構(gòu)與功能并不清楚。本研究采用同源擴增技術(shù)和公共分子信息數(shù)據(jù)，試圖分析中國生理小種無毒基因序列與歐美小種無毒基因序列之間的差異和系統(tǒng)學(xué)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

松楊柵銹菌2號生理小種(MLP2，HF2369)來自秦嶺火地塘太白楊(Populuspurdomii)(No.2369，海拔1 700 m)，親和型； 2號生理小種(MLP2，HZ3542)采自秦嶺厚畛子太白楊(No.3542，海拔670 m)，不親和型。歐美菌系參考相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫，取其無毒基因序列進行比對(表1)。

1.2 人工雜交方法

取太白楊(No.2369)附近長白落葉松(Larixolgensis)上銹菌HF2369的性子器[雌性(♀)]，取太白楊(No.3542)附近落葉松上銹菌HZ3542的性子器[雄性(♂)]，待HZ3542的性子器成熟并有橘黃色的性孢子擠出時，將性子器連同落葉松針葉取下放在裝有無菌水保濕的濾紙的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置冰盒中帶到火地塘，并用HZ3524性子器涂抹HF2369的性子器，修剪枝條使涂抹針葉不受其他葉片銹菌干擾，用透明密封袋將枝條連體密封保濕，5天后，取成熟銹子器葉片按上面方法帶回溫室接種太白楊。

1.3 接種反應(yīng)型測定

取葉齡10天左右的離體葉片，放在裝有濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用100 mg·kg-1的氯霉素浸濕，葉片正面扣在濾紙上，噴灑無菌水后，用鉤針小心將銹孢子涂抹分散在葉背上，用Parafilm密封，光照恒溫培養(yǎng)并記錄潛育期，并用解剖鏡觀察測量夏孢子堆直徑大小、高度、數(shù)量，有無褪綠及壞死斑及周長等，記錄親和型和不親和型，圖1A。待夏孢子成熟，小心收集單個夏孢子堆獲得F1代夏孢子群體20個。將無壞死斑但具有褪綠斑的單個夏孢子堆按同樣方法接種離體葉片，獲得F2′代無性夏孢子群體。F1、F2′代無性夏孢子群體均按上述方法離體接種葉片并記錄反應(yīng)型。反應(yīng)型標準參照曹支敏等(2005)。

1.4 無毒基因型統(tǒng)計及遺傳分析

不親和型為顯性無毒基因表現(xiàn)型，親和型為不含無毒基因表現(xiàn)型。不親和型表型為： 有褪綠斑或壞死斑、相同接種孢子濃度下夏孢子堆密度小(<10個·cm-2)，潛育期在10天以上，接種反應(yīng)型為0、1、1+、2-，圖1B； 親和性表型為： 無褪綠斑和壞死斑、相同孢子濃度接種下產(chǎn)生夏孢子堆密度大(>10個·cm-2),潛育期在10天以下，接種反應(yīng)型為3+、4、4+，圖1C； 中間型： 無褪綠斑和壞死斑、相同孢子濃度接種下產(chǎn)生夏孢子堆密度大(6～12個·cm-2),潛育期在11天以下，接種反應(yīng)型為2+、3、3-。中間型再結(jié)合夏孢子堆直徑大小、密度、潛育期、夏孢子堆高度分別劃歸親和型和不親和型，進行統(tǒng)計。理論值根據(jù)公式(χ2=Σ實得數(shù)2/預(yù)測數(shù)-觀察總數(shù))計算，結(jié)果按孟德爾比例1∶1、1∶3、3∶1、15∶1和偏分離3∶13進行卡方檢驗，統(tǒng)計無毒基因數(shù)量和顯隱性。

1.5 DNA提取

收集無毒基因型夏孢子堆，在盆栽太白楊上進行隔離繁殖，收集成熟夏孢子堆提取DNA。DNA提取方法參考余仲東等(2005)的銹菌夏孢子DNA微量快速提取法。用鉤針從每個菌樣中取3～5個夏孢子堆，加入提取液100 μL[100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.8),40 μL 20% KOH]和2%(V/V)的chelex-100(Bio-Rad公司)于1.5 mL的離心管中充分研磨后，置90 ℃水浴中溫育30 min，冷卻后置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

A： 離體葉片接種方法Inoculation methods for detached leaf;B： 不親和型Incompatible phenotype; C： 親和型Compatible phenotype.圖1 離體葉片接種及表現(xiàn)型Fig.1 Inoculation and phenotype on detached leaf

1.6 無毒基因序列同源擴增

參考亞麻銹菌無毒基因AvrL576-A，AvrL576-B基因序列及末端串聯(lián)拷貝序列orf3(序列號： AAS66952)設(shè)計簡并引物2對，AvrPr1： 5′-TAATCC TCGTTGACATCAGTC-3′,5′-AAGCTTGAGAGCTCCG CTC-3′(Tm=53.5 ℃); AvrPr2∶5′-GTCGACCGATC TATATCGAG-3′,5′-GTCTCTTCGTCCTTCCAAG-3′(Tm=54.1 ℃)。按下面反應(yīng)條件進行PCR擴增： 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性2 min，退火50 s，延伸1 min 30 s，25個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，25 ℃終止反應(yīng)。反應(yīng)體系為： 模板DNA 2 μL，Taq酶1 U，dNTPs 2 μL (10 mmol·L-1),正反引物各1 μL(10 μmol·L-1),5.0 μL 10×buffer,2 μL 25 mmol·L-1MgCl2，雙蒸水配平至50 μL。

1.7 無毒基因序列分析

PCR產(chǎn)物純化后，利用ABI 3730型 DNA 分析儀進行雙向測序 (生工，上海)。 序列經(jīng)Chromas.exe修訂后，用軟件Clustalx 1.81進行比對。去除序列中堿基缺失形成的空格(Gap)，根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型進行遺傳距離計算，并參考NCBI (http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/)，Melampsoralarici-populinaV1.0 (http： //genome.jpi-psf.org), Basidomycetes yeast genomic (http： //www.tigr.org/)等數(shù)據(jù)庫中無毒基因序列信息 (表1)，構(gòu)建最大似然系統(tǒng)樹(maximum likehood,ML)，1 000次Bootstrap重抽樣統(tǒng)計評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工雜交結(jié)果

人工涂抹20個性子器，其中10個性子器正常發(fā)育并在徑向面形成銹子器，取相對成熟、無污染的銹子器7個，即雜交F1代銹孢子堆群體；F1代銹孢子涂抹離體太白楊葉片后，獲得20個夏孢子堆，即F1代夏孢子堆群體(表2)。F1代夏孢子堆群體中的FA2接種離體太白楊葉片后，獲得5個夏孢子堆群體，即F2′代夏孢子堆群體(無性系)(表2)。

2.2 家系群體接種反應(yīng)型及無毒基因表型統(tǒng)計

表1 供試無毒基因序列Tab.1 Tested avirulence gene sequences

表2 孢子接種太白楊反應(yīng)型 ① Tab.2 Reaction type of inoculation on P.purdomii by spores

續(xù)表Continued

菌系Isolate潛育期Latent/d孢子堆直徑Diameter/mm密度Density/cm-2壞死斑Necrosis壞死斑周長Necrosisperimeter/mm褪綠斑Chlorisis褪綠斑周長Chlorisisperimeter/mm孢子堆高度Pustuleheight/mm葉片正面夏孢子堆Uredinialonadaxialsurface反應(yīng)型Reactiontype F2'代無性夏孢子F2'urediosporesAE80.0523-0-00.05-4BE70.19-0-00.1-4CE80.028-0+0.10.02-3DE80.17-0-00.1-4FE50.1～0.29-0+0.30.15-3+

① +:有該表型Dominate phenotype； -：無該表型Recessive phenotype； ×:免疫 Immunity reaction.

2.3 無毒基因序列分析

在供試的2對引物中，引物對AvrPr1擴增產(chǎn)生穩(wěn)定的單一條帶，大小800～900 bp, 如圖2，AvrPr2擴增產(chǎn)物特異性不強而放棄使用。所有供試無毒基因型夏孢子堆均有PCR擴增產(chǎn)物，中間型菌系FC8也有微弱PCR產(chǎn)物，親和型FA3和中間型FC1無擴增產(chǎn)物。部分PCR產(chǎn)物測序后獲得6條無毒基因序列(GenBank接收號： JQ665873-78)。ML系統(tǒng)發(fā)育樹表明，供試的17條無毒基因序列可以分為2個大類群。第1類群包括了Melampsora,Puccinia，Ustilago等擔子菌真菌無毒基因序列， 第2群為黑粉菌、柄銹菌、新型隱球菌等無毒基因序列?？偟目磥恚瑹o毒基因序列間同源性較小，2個分支類群鞋帶值僅20%。中國松楊柵銹菌的5條無毒基因(JQ665873-8)同加拿大該菌2條無毒基因具有更高的相似性，被聚在同一個亞分支上，但二者之間仍然存在較大的差異,分支長度大(圖3)。另一條中國的無毒基因序列JQ665876.1與亞麻銹菌的AvrL567(AAS66952)，美國的M.medusaef. sp.deltoidae(DQ404337),法國的MLP(HG529590)等聚在另一個亞分支上。Blastn結(jié)果表明松楊柵銹菌無毒基因可能編碼銹菌RTP和NBP蛋白，在抗病信號傳導(dǎo)和夏孢子細胞壁骨架形成中發(fā)揮作用。

圖2 夏孢子堆無毒基因擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of avirulence gene by urediniaM：Marker；FA3(反應(yīng)型4 Reactive type 4)：親和型菌系Compatible with P. purdomii ； FC1(反應(yīng)型3Reactive type 3)、 FC8(反應(yīng)型3+Reactive3+)：中間型菌系，其余為不親和型菌系Middle type of compatible strains，the other lanes are of imcompatible strains； A-E、A-F、A-G：雜交后獲得銹孢子堆家系Progenies of cross-fertilization of pycnia by pycniospores； FA2、FA3、FA4、FA5、FA7、FC1、FC3、FC7、FC8、FC9：F1代夏孢子堆家系F1 progenies of urdinia； CE、FE：F2′代無性夏孢子堆家系A(chǔ)sexual F2′uredinia； FA3、FC1：無擴增產(chǎn)物Without PCR products；A-G、FC8：擴增產(chǎn)物弱With weak product band in respectively lane.

3 討論

圖3 無毒基因序列ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Maxium likehood phylogeny tree of tested averence genes

在“基因?qū)颉睂W(xué)說中，植物的1個抗病基因?qū)?yīng)著病原菌的1個無毒基因，無毒基因效應(yīng)蛋白和抗病基因產(chǎn)物結(jié)合引發(fā)植物過敏性壞死(Flor, 1971)。無毒基因是銹菌侵染時重要的小分泌蛋白基因之一，常以基因家族的形式出現(xiàn)和發(fā)揮作用(Doddsetal.， 2004； Linningetal., 2004； Nemnetal., 2014)。亞麻銹菌AvrL567包含AvrL567-A、AvrL567-B、AvrL567-C編碼蛋白基因，Avr567-A、Avr567-B基因是串聯(lián)重復(fù)拷貝基因，3′端含有2個重復(fù)子Sec14和Orf-3。它們在芽管吸器中表達，編碼一個127個氨基酸的分泌蛋白，可誘導(dǎo)寄主細胞過敏性壞死反應(yīng)，但需要和亞麻L5、L6或L7抗病基因共表達。AvrL567-C在串聯(lián)重復(fù)子3′末端，單拷貝，編碼致病蛋白，進化較快，與人工選擇壓力大小相關(guān)。本研究采用同源克隆技術(shù)獲得的6條avr基因序列均為AvrL567-A的同源序列，主要編碼銹菌細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白(RTP1)和核酸結(jié)合蛋白(NBP)，N段含有保守的短肽氨基酸序列，可能和抗病信號的傳遞有關(guān)。Hacquard等(2012)在研究MLP小分泌蛋白時發(fā)現(xiàn)，MLP的AvrL567同亞麻銹菌的AvrL567有較大差異，本研究中也發(fā)現(xiàn)MLP的5條無毒基因序列同亞麻銹菌都不在同一個亞分支上。無毒基因家族中各拷貝在接種表現(xiàn)型上發(fā)揮著不同的作用，AvrL567-C發(fā)揮致病性作用而與寄主選擇壓力相協(xié)調(diào)(Doddsetal., 2004)，往往具有更高的變異性； 禾柄銹菌(P.graminis)無毒基因中有一個抑制子，在壞死反應(yīng)中表現(xiàn)出抑制作用(Zambinoetal., 2000)。無毒基因在接種抗病反應(yīng)中通常表現(xiàn)出過敏性壞死，這些串聯(lián)因子有可能調(diào)控著壞死反應(yīng)的程度和數(shù)量。

太白楊是松楊柵銹菌的天然寄主，通常被認為是高度感病的而在研究中作為擴繁寄主使用(曹支敏等， 2005)。但在Burdon等(1997)的研究中，天然寄主黑楊是最容易發(fā)現(xiàn)銹菌致病性變異的地方，天然雜交后形成的銹菌家系群體首先在天然寄主上發(fā)生性狀分離。本研究在嚴格控制接種條件下獲得的家系群體，在太白楊上也發(fā)生了性狀分離，無毒基因型表現(xiàn)為單基因顯性遺傳，和Avr9(van Kanetal., 1991)、UhAvr1(Linningetal., 2004)等無毒基因的遺傳規(guī)律相似。但本研究中的MLP的F1代銹孢子堆家系接種時有明顯的壞死反應(yīng)且孢子堆直徑大，而F1和F2′代夏孢子堆家系壞死反應(yīng)不顯著而且褪綠斑大小出現(xiàn)分化，夏孢子堆的直徑和周長等也發(fā)生較大的變化，推測有QTLs基因發(fā)揮作用，或在家系分化中無毒基因部分片段發(fā)生重組或消失，需要進一步研究。

在對TD系列自交F2代接種反應(yīng)型研究中,Newcombe(1998)認為抗病基因Mmd1的QTLs性狀來自于祖父的隱性遺傳，M.medusaef.sp.deltoidae接種時的壞死反應(yīng)是對應(yīng)無毒基因的顯性表現(xiàn)，夏孢子堆的直徑大小是無毒基因型的最重要QTLs性狀。在大多數(shù)文獻中，寄主抗病表現(xiàn)型定義為人工接種反應(yīng)型0，1，2-等(田呈明等， 2002)，很難區(qū)分2+、3-等中間表現(xiàn)型和既無壞死也無褪綠斑但潛育期長的表現(xiàn)型。本研究以壞死斑、褪綠斑的有無和大小為主，結(jié)合密度、夏孢子堆直徑、潛育期等來判別無毒基因型，并通過PCR擴增檢測表明這種方法是可行的，對中間反應(yīng)型也是適用的。

單個夏孢子堆中夏孢子群體通常被認為是同質(zhì)的，在人工接種致病反應(yīng)型中可能會發(fā)生性狀數(shù)量大小的變化，但一般不會形成新的致病型(馬娥嬌等， 2014)。本研究中F1代夏孢子堆群體致病型類群和F1代銹孢子堆群體相似，是有性交配后第1代群體，均有性狀分離。而F2′夏孢子堆中孢子群體為無性群體，接種反應(yīng)型分化不明顯，卡方檢驗不顯著。Steenacker等(1998)報道松楊柵銹菌在寄主選擇壓力下或在夏孢子堆混合接種下，容易出現(xiàn)新的致病型。在沒有轉(zhuǎn)主寄主情況下，松楊柵銹菌可進行準性生殖，通過芽管融合和細胞核流動而產(chǎn)生新的致病菌系(Yuetal., 2009)。但新性狀形成需要較強的選擇壓力和較長的時間，試驗中采用的天然寄主太白楊葉片離體培養(yǎng)技術(shù)，可以保證家系群體接種致病性的穩(wěn)定，為無毒基因型的測定奠定了基礎(chǔ)。同時，該方法可減少傳統(tǒng)葉盤接種法對葉片的傷害，最大限度地延長離體葉片的生命力和防止孢子分散造成污染。

4 結(jié)論

MLP2小種無毒基因型表現(xiàn)為單顯性遺傳，雜合子(HZ3542)親本在F1代銹孢子堆、F1代夏孢子堆群體中性狀分離均為1∶1，符合孟德爾遺傳分離定律。無毒基因序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)樹表明，真菌無毒基因序列間總體上同源性較低，但同類群真菌無毒基因序列間具有更高的同源性，柵銹菌屬(Melampsoraspp.)無毒基因序列聚在同一個分支上，中國松楊柵銹菌無毒基因序列與加拿大菌系無毒基因序列聚在一個亞分支上，顯示出較高的同源性。

曹支敏,余仲東,潘彥平,等. 2005.中國落葉松-楊柵銹菌生理小種分化. 植物病理學(xué)報,35(2)： 184-186.

(Cao Z M, Yu Z D, Pan Y P,etal. 2005. Differentiation of physiological races inMelampsoralarici-populinaKleb. in China. Acta Phytopathologica Sinica,35(2)： 184-186. [in Chinese])

馬娥嬌,余仲東，胥生榮，等.2014. 落葉松-楊柵銹菌無性繁殖后代反應(yīng)型及接種研究.中國森林病蟲,33(2)： 1-3.

(Mao E J, Yu Z D, Xu S R,etal.2014. Reaction type and inoculation of asexual reproduced isolates fromMelampsoralarici-populinaKleb.Forest Pest and Disease, 33(2)： 1-3. [in Chinese])

田呈明,康振生,梁英梅,等.2002.青楊葉銹病菌(Melampsoralarici-populinaKleb)侵染過程的超微結(jié)果研究. 植物病理學(xué)報,32(1)： 71-78.

(Tian C M, Kang Z S, Liang Y M,etal. 2002. Ultrastructure of poplar leaf infected by rust fungi (Melampsoralarici-populinaKleb.). Acta Phytopathologica Sinica, 32(1)： 71-78. [in Chinese])

王建飛,鮑永美,李培富,等.2006. 基于無毒基因序列的稻瘟病菌指紋類型與致病型的關(guān)系初探.中國水稻科學(xué), 20(1)： 109-112.

(Wang J F, Bao Y M,Li P F,etal. 2006. Primary study on correlation between pathotypes and DNA fingerprintings based on avirulence gens sequences of rice blast fungusMagnaporthegrisea. Chinese J Rice Sci, 20(1)： 109-112. [in Chinese])

余仲東,曹支敏.2005.落葉松-楊柵銹菌DNA提取新法研究(英). 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,33(11)： 155-158.

(Yu Z D, Cao Z M.2005. A renewed DNA extraction method for molecular study ofMelampsoralarici-populina.Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry:Natural Science Edition, 33(11)： 155-158. [in English])

張德水,陳受宜.1997.植物抗病性的分子生物學(xué)研究進展.植物病理學(xué)報,27(2)： 97-103.

(Zhang D S, Chen S Y.1997.Molecular biology of plant disease resistance. Acta Phytopathologica Sinica, 27(2)： 97-103. [in Chinese])

Attard A, Gout L, Gourgues M,etal.2002. Analysis of molecular markers genetically linked to theLeptosphaeriamaculansavirulence geneAvrLm1 in field populations indicates a highly conserved event leading to virulence on Rlm1 genotypes. Molecular Plant-Microbe Interactions, 15(7)： 672-682.

Burdon J J, Silk J.1997. Source and patterns of diversity in plant-pathogenic fungi. Phytopathology,87(7)： 664-669.

Dangl J L.1994.The enigmatic avirulence genes of phytopathogenic bacteria. Current Topic Microbiology Immunology, 192(1)： 99-118.

Dodds P N, Lawrence G J, Catanzariti A M,etal.2004.TheMelampsoraliniAvrL567 avirulence genes are expressed in haustoria and their products are recognized inside plant cells. The Plant Cell, 16(3)： 755-768.

Duplessis S, Cuomo C A, Lin Y C,etal.2011. Obligate biotrophy features unravelled by the genomic analysis of rust fungi. Proceedings of the Natural Academy of Science U.S.A., 108： 9166-9171.

Fernandez D, Tisserant E, Talhinhas P,etal. 2012. 454-pyrosequence ofCoffeaarabicaleaves infected by the rust fungusHemileiavastatrixreveals in planta-expressed pathogen-secreted proteins and plant functions in a late compatible plant-rust interaction. Molecular Plant Pathology,13(1)： 17-37.

Flor H H. 1971.Current status of the gene-for-gene concept. Annual Review Phytopathaology,9(1)： 275-296.

Hacquard S, Joly D L, Lin Y C,etal.2012. A comprehensive analysis of genes encoding small secreted proteins identifies candidate effectors inMelampsoralarici-populina(poplar leaf rust). Molecular Plant-Microbe Interaction, 25(3)： 279-293.

Hauck P, Thilmony R, He S Y.2003.APseudomonassyingaetype III effecter suppresses cell wall-based extracellular defense in susceptibleArabidopsisplants. PNAS,100(14)： 8577-8582.

Innes R W, Bent A F, Kunkel B N,etal. 1993. Molecular analysis of avirulence gene avrRpt2 and identification of a putative regulatory sequence common to all knownPseudomonassyringaeavirulence genes. Journal of Bacteriology, 175(15)： 4859-4869.

Lawrence,G J, Dodds P N, Ellis J G.2010.Transformation of the flax rust fungus,Melampsoralini： selection via silencing of an avirulence gene.Plant Journal,61(2)： 364-369.

Lauge R, Wit P J.1998. Fungal avirulence genes： structure and possible functions. Fungal Genetic Biology, 24： 285-259.

Lefevre F, Goue-Mourier M C, Faivre-Rampant P,etal. 1998. A single gene cluster controls incompatibility and partial resistance to variousMelampsorelarici-populinaraces in hybrid poplars. Phytopathology, 88(2)： 156-153.

Linning R, Lin D, Lee N,etal.2004.Marker-based cloning of the region containing theUhAvr1 avirulence gene from the basidiomycete barley pathogenUstilagohordei. Gentics,166(1)： 99-111.

Nemn A, Saunders D G O, Anderson C,etal.2014. The genome sequence and effector complement of the flax rust pathogenMelampsoralini. Frontiers in Plant Science,5(98)： 1-14.

Newcombe G. 1998. Association ofMmdI, a major gene for resistance toMelampsoramedusaef.sp.deltoidaewith quantitative traits in poplar rust. Phytopathology,88(2)： 114-121.

Pallaghy P K, Norton R S, Nielsen K J,etal.1994. A common structural motif incorporating a cystine knot and a triple-stranded β-sheet in toxic and inhibitory polypeptides. Protein Science,3(10)： 1833-1839.

Pinon J, Frey P.1997.Structure ofMelamposoralarici-populinapopulations on wild and cultivated poplar. European Journal of Plant Pathology, 103(2)： 159-173.

Rafiqi M, Gan P H, Ravensdale M,etal.2010. Internalization of flax rust avirulence proteins into flax and tobacco cells can occur in the absence of the pathogen. Plant Cell,22(6)： 2017-2032.

Steenackers M, Steenackers V, De Cuyper B,etal.1998. Breeding and seleetion of poplars for durable resistance toMelampsoralarici-populina//Jalkanen, Crane P E, Walla J,etal. Proc First IUFRO Rust of Forest Tree WP Conf Finland： Rovaniemi Research Station, 97-104.

van den Hooven H W, van den Burg H A, Vossen P,etal. 2001. Disulfide bond structure of AVR9 elicitor of the fungal tomato pathogenCladosporiumfulvum： Evidence for a cystine knot. Biochemistry,40(12)： 3458-3466.

van Kan J A L, van Den G F, Ackerve K,etal.1991.Cloning and characterization of cDNA of avirulence geneavr9 of the fungal pathogenCladosporiumfulvum, causal agent of tomato leaf mold. Molecular Plant-Microbe Interaction,4(1)： 52-59.

Vivian A, Arnold D L.2002.Bacterial elicitor genes and their role in host-pathogen interaction. Journal of Plant Pathology,4(3)： 52-59.

Yu Z D, Liang J, Cao Z M,etal.2009.Nuclear behavior in the life cycle ofMelampsoralarici-populinaKleb. Journal of Food, Agriculture & Environment, 7(3/4)： 791-794.

Zambino P J, Kubelik A R, Szabo L J.2000. Gene action and linkage of avirulence genes to DNA markers in the rust fungusPucciniagraminis. Phytopathology, 90(8)： 819-828.

(責任編輯 朱乾坤)

Segregation Patterns and Phylogeny Analysis ofAvrL567 Gene inMelampsoralarici-populina

Yu Zhongdong1Chen Zujing2Cao Zhimin1Ren Zhengzheng3Feng Shiqiang4Zhang Yaoqi5

(1.Forestry College, Northwest A&F University Yangling 712100； 2.College of Forestry and Landscape Architecture,South China Agricultural University Guangzhou 510642； 3.Science College, Northwest A&F University Yangling 712100； 4.Liaoning Province Forest Pest Control and Quarantine Bureau Shenyang 110804； 5.Hunnan District Forestry Bureau of Shenyang Shenyang 110163)

Rust fungus ofMelampsoralarici-populina(abbr. MLP) is a great enemy of poplar industry in China, and it threatened short rotation forest seriously, including poplars of Sect.Tacamachacae, and Sect.Aigerios, and their hybrids. 【Objective】To understand the genetics of avirulence genes in their family, and to detect the phylogenic relationship of avirulence gene sequences between Chinese MLP and the other races in European and USA.【Method】 Population of F1aecia of MLP was harvested by cross-fertilization with spermogonia of physiologic race 2 (MLP2) collected from Houzhengzi (in which, isolate HZ3542 as a male maternal，incompatible withPopuluspurdomii) and Huoditang (in which, isolate HF2369 as a female maternal, compatible with purdomii poplar) in Qinling Mountain, and segregation pattern of avirulence genes in MLP2family as detected and inoculating aciospores and urediospores onP.purdomiileavesinvitro. Primers were designed and selected by referring toAvrL567(accession： AAS66952) inMelampsoralini. Avirulence genes were amplified by PCR homogenized technology and then sequenced. All putative sequences were revised and aligned with other avirulence genes in the related public molecular information data, and a maximum likehood (abbr.,ML) phylogeny tree was then constructed. 【Result】 Segregation of avirulence genes in MLP2was coincident to the Mendel′s law, and showed a single dominant heterozygous phenotype (Aa) in the incompatible isolate, and homozygote phenotype (aa) in the compatible isolate. Their F1population in both aeciospores (P=0.01) and urediospores (P=0.05) segregated by following 1∶1 with dominant to recessive phenotype. The certification for dominant avr phenotype is revised and confirmed by combination with quality traits of necrosis and chlorosis, quantitative trait loci (QTLs) including latent days, both diameter size and density of uredinia. PCR productions were also used to test and confirm avirulence phenotype under annealing by selected primer pair AvrPr1 (5′-TAATCCTCGTTGACATCAGTC-3′,5′-AAGCTTGAGAGCTCCGCTC-3′). ML phylogeny tree differentiated two groups from all tested sequences at a low bootstrap data. Among them, allMelampsorasequences were grouped together with a relatively high homology, and five of sixAvrL567 sequences from China MLP2isolates grouped into a sub-clad together with two Canada MLP sequences, and another one was grouped into another sub-clad with French MLP, USAM.lini, etc.【Conclusion】 Incompatible race 2 of MLP in China was a phenotype of Aa, and its avirulence gene sequences showed a high homology with that of tested Canada isolates.Key words：Melampsoralarici-populina; avirulence gene; segregation law; phylogeny tree

10.11707/j.1001-7488.20170511

2015-01-05；

2016-11-14。

國家自然科學(xué)基金項目(31670650);科技新“十三五”重點專項(SQ2017YFNC030122);高?？蒲谢緲I(yè)務(wù)費專項(ZL09021005)。

S718.81

A

1001-7488(2017)05-0088-09