紀(jì)璐璐，熊國平，汪琳*

(1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，武漢 430071；2武漢市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430014)

高糖環(huán)境下beclin2介導(dǎo)的自噬增強絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡

紀(jì)璐璐1，熊國平2，汪琳1*

(1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，武漢 430071；2武漢市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430014)

目的探討高糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞早期凋亡及自噬水平的影響。方法取足月妊娠的正常及妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus, GDM）患者的胎盤組織，透射電鏡觀察滋養(yǎng)層細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。體外用不同濃度的含糖培養(yǎng)基培養(yǎng)滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/Svneo細(xì)胞24h，分為低糖組（1.57mmol/L或LG2 2.25mmol/L），正常對照組（5.57mmol/L）和高糖組（10.57mmol/L、15.57mmol/L或40.57mmol/L）；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率；q-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)beclin1、beclin2和ATG7等自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測Ⅱ型自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3-II）和p62蛋白表達(dá)水平。結(jié)果透射電鏡下可見GDM組滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在自噬小體且空泡數(shù)目明顯多于正常足月妊娠組，其游離面微絨毛出現(xiàn)明顯倒覆及坍塌現(xiàn)象；在體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞中，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示1.57mmol/L低糖組及40.57mmol/L高糖組較正常對照組HTR8/SVneo細(xì)胞的早期凋亡率均明顯增加；q-PCR分析發(fā)現(xiàn)40.57mmol/L高糖組beclin2及ATG7 mRNA表達(dá)水平較正常對照組升高，beclin1 mRNA表達(dá)無差異；Western blot檢測表明，與正常對照組比較，40.57mmol/L高糖組LC3-II蛋白表達(dá)水平升高，p62蛋白表達(dá)水平降低。結(jié)論高糖可通過beclin2介導(dǎo)的自噬信號途徑增強滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬水平進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并可能與不良的妊娠結(jié)局相關(guān)。

妊娠期糖尿??；HTR8/SVneo；自噬；凋亡；beclin2

妊娠期糖尿病（gestational diabetesmellitus, GDM）是一種伴有糖耐量異常的代謝性疾病，在妊娠期間出現(xiàn)或者被首次診斷出來[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖尿病可影響3%～30%的妊娠期婦女[2]。胎盤是一個非常特殊的器官，是給胎兒提供營養(yǎng)物質(zhì)、氣體交換及排除代謝物質(zhì)的主要場所，對維持正常妊娠非常重要。在妊娠早期，滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠侵入母體子宮蛻膜、重塑母體脈管系統(tǒng)以形成低抵抗、高容量的血管系統(tǒng)，這對正常胎盤的形成及正常妊娠的維持必不可少。而抗血管生成因子、促炎環(huán)境因素導(dǎo)致的GDM、子癇等妊娠期疾病會損害滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和遷移，引起淺的胎盤植入最終導(dǎo)致不利于胎兒生長及母胎界面形成的環(huán)境[3-5]。

在真核細(xì)胞中，自噬對細(xì)胞的存活、分化以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持必不可少[6]。在一些應(yīng)激狀況下，細(xì)胞內(nèi)的自噬會被上調(diào)，如細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激（錯誤折疊蛋白的累積、氧化應(yīng)激的增加、DNA受損），或是細(xì)胞外環(huán)境的影響（饑餓、缺氧、激素刺激）[7]。自噬對胎盤的形成、滋養(yǎng)層細(xì)胞的入侵必不可少，而且自噬能為不同階段的妊娠維持起保護(hù)作用[8,9]。與正常妊娠相比，子癇前期及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩的胎盤組織中自噬水平增高[10]。但是在GDM狀態(tài)下，自噬的水平及其對胎盤形成的影響目前尚不清楚。本研究通過透射電鏡觀察GDM和正常妊娠胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，并用HTR8/SVneo細(xì)胞株來探討高糖對人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞（HTR8/SVneo）早期凋亡及自噬水平的影響。

材料和方法

1 胎盤組織

2015年9月至2015年11月于武漢市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科取足月剖宮產(chǎn)分娩的正常（社會因素剖宮產(chǎn)）(NP)及GDM患者的胎盤組織各9例，平均年齡26 ± 2.7歲。

2 細(xì)胞

人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo購自ATCC細(xì)胞庫。

3 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol reagent購自Invitrogen公司，ATG7、beclin2、beclin1、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成，Prime ScriptT-MRT reagent Kit with gDNA Eraser購自日本Takara公司，SYBR?Green Realtime PCR Master Mix購自日本TOYOBO公司；GAPDH (內(nèi)參蛋白)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（二抗）、p62多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，LC3B抗體購自美國CST公 司，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit購自凱基生物公司。

4 胎盤組織電鏡術(shù)

胎盤樣本去除胎膜后，取約1mm×1mm×1mm胎盤組織塊，經(jīng)2.5%戊二醛固定、1%鋨酸固定、脫水、環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

5 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

HTR8/SVne細(xì)胞在普通RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素）中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，37℃。細(xì)胞接種到6孔板上時，用不含糖的RPMI-1640培養(yǎng)基并另外加葡萄糖至實驗所需不同的濃度。所有實驗細(xì)胞均取自對數(shù)生長期，臺盼藍(lán)拒染率均在95%以上。

實驗分為3組，低糖組：1.57mmol/L(LG1)和2.57mmol/L (LG2)；正常糖組：5.57mmol/L；高糖 組：10.57mmol/L (HG1)、15.57mmol/L(HG2)和40.57mmol/L(HG3)，均培養(yǎng)24h。

6 細(xì)胞總RNA的提取和q-PCR擴(kuò)增

根據(jù)說明書裂解細(xì)胞，所得總RNA用無RNase去離子水溶解，在Nana DropTM2000上測濃度并作為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的模板，反應(yīng)體系和操作步驟按TAKARA說明書進(jìn)行。各引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：Pattern 1：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)37℃15min，85℃ 5sec；Pattern 2：q-PCR反應(yīng)95℃ 5sec，60℃ 30sec，共40個循環(huán)；收集熒光信號。每1個樣本做3個平信管。基因表達(dá)的相對變化采用2-ΔΔCt法處理。

7 Western blot

收集細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解的細(xì)胞30min（6孔板，200μl/孔），收集裂解產(chǎn)物12000r/min、4℃離心10min，BCA法測定上清中蛋白濃度；經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至0.22μm的PVDF膜上（90min），然后用含5%脫脂奶粉室溫封閉2h，再用1∶1000稀釋的純化一抗4℃孵育過夜，再用1∶5000二抗室溫孵育2h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore公司，美國）顯色，UVP化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測目的蛋白的表達(dá)，ImageJ掃描分析灰度值。

表1 目的基因PCR引物序列Tab.1 The primer sequences of target genes for real-time PCR

8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩次（2000r/min、5min）收集的細(xì)胞密度為1×105/ml，加400μl 1×Binding Bufer重新懸浮細(xì)胞，加5μl Annexin V-FITC于細(xì)胞懸液中，混勻后4℃避光孵育20min，加10μl Propidium Iodide于細(xì)胞懸液中，混勻，4℃避光孵育5min，1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)值均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間差異性用LSD檢測，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 GDM胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞游離面微絨毛倒覆且胞內(nèi)有大量空泡結(jié)構(gòu)

透射電鏡術(shù)結(jié)果顯示，正常妊娠組胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰可見，胞質(zhì)內(nèi)未見明顯膜性空泡，滋養(yǎng)層細(xì)胞微絨毛排列密集整齊（圖1A）。GDM組滋養(yǎng)層細(xì)胞胞質(zhì)中觀察到自噬小體，且可見大量空泡狀結(jié)構(gòu)。此外，在GDM組的滋養(yǎng)層細(xì)胞上可見坍塌倒覆的微絨毛（圖1B）。

圖1 正常妊娠與GDM胎盤組織超微結(jié)構(gòu)。A，正常妊娠組；B，妊娠期糖尿病組；箭頭，胎盤游離面微絨毛；*，自噬小體；#，空泡狀結(jié)構(gòu)；比例尺，500nmFig.1 Placenta ultrastructure observed by transmission electron microscopy. A, normal group; B, GDM group; arrowheads, microvilli; *, autophagosome, #, vacuole; scale bar, 500nm

2 高糖及低糖組HTR8/SVneo細(xì)胞早期凋亡率增高

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與正常對照組相比，低糖組細(xì)胞凋亡增多，且隨著糖濃度的降低細(xì)胞早期凋亡增多（圖2A），糖濃度為1.57mmol/L（LG1）時，細(xì)胞凋亡率明顯增加（圖2B）；高糖組細(xì)胞較正常對照組細(xì)胞凋亡增加，糖濃度達(dá)到15.57mmol/L（HG2）時細(xì)胞早期凋亡開始增加（圖2A），當(dāng)濃度增加到40.57mmol/L（HG3）時，大部分處于凋亡狀態(tài)（圖2B）。

圖2 不同糖濃度對HTR8/SVneo細(xì)胞早期凋亡率的影響。A，細(xì)胞早期凋亡率的影響的流式細(xì)胞術(shù)檢測；B，細(xì)胞早期凋亡率的統(tǒng)計學(xué)分析；**，1.57mmol/L組與5.57mmol/L組比較，P ＜ 0.01；****，40.57mmol/L組與5.57mmol/L組比較，P＜0.0001Fig. 2 The efect of diferent glucose concentrations on the early apoptosis rate of HTR8/SVneo cells. A, fow cytometry assessment of early apoptosis rates; B, statistical analysis of early apoptosis rates; **, P＜0.01, 1.57mmol/L vs. 5.57mmol/L; ****, P＜0.0001, 40.57mmol/L vs. 5.57mmol/L

3 高糖增強HTR8/SVneo細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)

用含40.57mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h后，提取細(xì)胞總RNA，q-PCR檢測各組細(xì)胞中自噬相關(guān)分子（beclin1、beclin2和ATG7）的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與NC相比，HG3組細(xì)胞中beclin2及ATG7 mRNA表達(dá)水平顯著增高，但是beclin1 mRNA表達(dá)水平兩組之間無差異（圖3）。

圖3 高 糖 對HTR8/SVneo中ATG7、beclin1和 beclin2 mRNA表達(dá)影響的q-PCR檢測。NC, 5.57mmol/L正常對照組；HG3, 40.57mmol/L高糖組；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01Fig. 3 qPCR detection of the effect of high glucose on the levels of ATG7, beclin1 and beclin2 mRNA in HTR8/SVneo cells. NC, 5.57mmol/L normal control group; HG3, 40.57mmol/L high glucose group; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01

圖4 高糖對HTR8/SVneo中LC3-II和p62水平的影響。A，LC3-II和p62水平的Western blot檢測；B，LC3-II和p62水平的統(tǒng)計學(xué)分析；NC, 5.57mmol/L正常對照組；HG3, 40.57mmol/L高糖組；*，0.01＜P＜0.05, **，P＜0.01Fig.4 The efect of high glucose on the levels of LC3-II and p62 protein in HTR8/SVneo cells. A, western blot detection of LC3-II and p62. B, statistical analysis of the levels of LC3-II and p62. NC, 5.57mmol/L normal control group; HG3, 40.57mmol/L high glucose group; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01

4 高糖增強HTR8/SVneo細(xì)胞中LC3-II蛋白表達(dá)，降低p62蛋白表達(dá)

本研究同時檢測了自噬標(biāo)志蛋白LC3-II及p62蛋白表達(dá)水平。Western blot分析顯示，與NC相比，HG3組LC3-II蛋白表達(dá)水平顯著升高，p62蛋白表達(dá)水平降低（圖4）。

討 論

雖然許多研究表明自噬在胎盤形成的過程中所發(fā)揮的作用是必不可少的，但GDM中胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層的自噬水平及其功能還未知。我們推測高糖作為一種應(yīng)激因素，可能會增強胎盤的自噬水平。因此，我們在GDM胎盤組織和HTR8/SVneo中進(jìn)行了關(guān)于自噬的研究。首先，本研究通過透射電鏡對GDM患者的胎盤進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞胞質(zhì)中有大量的囊泡狀結(jié)構(gòu)存在，其游離面微絨毛出現(xiàn)了明顯的坍塌、倒覆及數(shù)目減少的現(xiàn)象。其次，用HTR8/SVneo模擬高糖環(huán)境的體外研究實驗表明：細(xì)胞中beclin2 、ATG7 mRNA和LC3-II蛋白高表達(dá)，p62蛋白低表達(dá)，但是在本研究中與自噬表達(dá)相關(guān)的beclin1基因表達(dá)水平并未升高。

作為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)過程，自噬可能參與高糖環(huán)境下細(xì)胞狀態(tài)的改變。有超過20多種自噬相關(guān)基因參與自噬形成的分子過程，其中ATG7在自噬小泡的形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[11]。在特異敲除肝臟ATG7基因的小鼠中，經(jīng)由糖異生作用把氨基酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖來維持血糖水平的途徑受到抑制，導(dǎo)致饑餓時低血糖狀態(tài)[12]。在胚胎早期植入的過程中檢測到了LC3，ATG7這些自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[13]。除了ATG7外，beclin2作為哺乳動物特有的蛋白和beclin1一樣通過與class IIIPI3K 復(fù)合物及Bcl-2相互作用來調(diào)節(jié)自噬，但是它的降解途徑卻異于beclin1。同時作為一個匯合的調(diào)節(jié)器，beclin2在自噬與G蛋白偶聯(lián)受體之間發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，它能夠增強beclin家族在自噬中功能和機(jī)制多樣性、胞內(nèi)溶酶體運輸和代謝的功能，并且在胎盤、子宮中高表達(dá)[14]。在本實驗中，高糖環(huán)境下滋養(yǎng)層細(xì)胞自噬水平的增高，是beclin2而不是beclin1發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度的變化，細(xì)胞凋亡程度呈現(xiàn)出不同的變化趨勢，當(dāng)糖濃度小于5.57 mmol/L時，凋亡率隨著糖濃度的減少而增多，而當(dāng)糖濃度大于5.57mmol/L至15.57mmol/L時細(xì)胞凋亡水平開始發(fā)生變化，至40.57mmol/L細(xì)胞凋亡水平顯著升高，這表明糖濃度對細(xì)胞凋亡發(fā)揮了非常重要的作用。在本實驗中我們著重觀察高糖對滋養(yǎng)層細(xì)胞的影響。有研究證實自噬在凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中發(fā)揮著一定的作用，抑制Hdac1而激活細(xì)胞自噬能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]；在哺乳動物細(xì)胞中過表達(dá)Beclin1也能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[16]，這些可能都與細(xì)胞過度自噬而激活細(xì)胞凋亡途徑最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡相關(guān)。近期的研究表明處于長期的自噬激活狀態(tài)能導(dǎo)致胚胎的凋亡[13]。因此，本研究表明：高糖環(huán)境下Beclin2介導(dǎo)的過度自噬與細(xì)胞凋亡相關(guān)；推測過度自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致胎盤淺植這一過程與妊娠期糖尿病的不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)。

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High glucose induces apoptosis of chorionic trophoblast cells via beclin2-mediated autophagy

Ji Lulu1, Xiong Guoping2, Wang Lin1*(1Department of Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences,Wuhan University, Wuhan 430071, China;2Department of Gynaecology and Obstetrics, The Central Hospital of Wuhan, Wuhan 430014, China )

ObjectiveTo investigate the efect of high glucose on the early apoptosis and autophagy of human chorionic trophoblast cells.MethodsFull-term placenta tissue was sampled from normal cases and gestational diabetes mellitus (GDM) cases, and the changes in the ultrastructure of trophoblast cells were observed by transmission electron microscopy. HTR8/SVneo trophoblast cells were cultured in vitro in low, normal and high glucose conditions (LG1∶ 1.57mmol/L, LG2∶ 2.25mmol/L, NC∶ 5.57mmol/L, HG1∶ 10.57mmol/L, HG2∶ 15.57mmol/L, HG3∶ 40.57mmol/L) for 24 hours. The early apoptosis rate was measured by fow cytometry. The mRNA levels of autophagy-related genes Beclin2, ATG7 and Beclin1 were analyzed by qPCR. The levels of LC3-II and p62 protein were detected by western blot.ResultsAutophagosomes were observed by transmission electron microscopy in trophoblast cells in the GDM group, as well as an increased number of vacuoles compared with that of the normal group. Remarkable collapse of microvilli on the free surface was also observed in the GDM group. The fow cytometry results showed that the early apoptosis rate was signifcantly higher in groups LG1 and HG3 than in group NC. The qPCR test displayed that the levels of beclin2 and ATG7 mRNA increased obviously in group HG3, while that of beclin1 mRNA showed no signifcant diference from group NC. The western blot results showed that the level of LC3-II protein was higher and that of p62 lower in group HG3 than in group NC.ConclusionHigh glucose promotes the autophagy of trophoblast cells via Beclin2-mediated signaling, which results in cell apoptosis and may lead to adverse fetal outcomes.

Gestational diabetes mellitus; HTR8/SVneo; autophagy; apoptosis; beclin2

R329.1

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.003

2017-01-11

2017-03-30

紀(jì)璐璐，女（1990年），漢族，醫(yī)學(xué)碩士

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：lin.wang@whu.edu.cn