汪 淼，李 張，孫 群*

（四川大學(xué)生命科學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

PCR-DGGE分析資中冬尖發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌多樣性

汪 淼，李 張，孫 群*

（四川大學(xué)生命科學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

目的：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)分析資中冬尖發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化。方法：從資中采集4 份不同發(fā)酵年份冬尖樣品，提取樣品總DNA，采用巢式PCR法擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物采用DGGE分離，對(duì)細(xì)菌主要優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果：冬尖在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌多樣性較豐富，且群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化。不同發(fā)酵時(shí)間樣品間，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性為9%～67%，其中第2年與第3年樣品相似性最高，達(dá)67%。資中冬尖發(fā)酵過(guò)程中，所涉及的細(xì)菌主要分為3 類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和非培養(yǎng)菌，其中厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，占53%；變形桿菌門占37%；非培養(yǎng)菌僅占10%。結(jié)論：采用PCR-DGGE技術(shù)能更全面、更真實(shí)地反映資中冬尖在發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的多樣性及其動(dòng)態(tài)變化，為冬尖的生產(chǎn)工藝和風(fēng)味物質(zhì)的形成提供理論支撐。

冬尖；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳；細(xì)菌多樣性

冬菜是我國(guó)傳統(tǒng)的蔬菜腌制品，在國(guó)內(nèi)外都頗有盛名，根據(jù)地域與加工方法的不同，主要分為川冬菜、京冬菜、津冬菜和上海五香冬菜等，其中四川冬菜主要以資中冬尖和南充冬菜最為著名[1]。資中冬尖選用薺菜為原料，其生產(chǎn)工藝特征是采用風(fēng)脫水生產(chǎn)法，即先在風(fēng)中晾曬，使之脫水，然后再進(jìn)行鹽漬，采用此加工方法可以減少蔬菜中所含可溶性物質(zhì)的流出。資中冬尖發(fā)酵周期較長(zhǎng)，一般1～4 a，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，其風(fēng)味及香氣越濃郁，質(zhì)量越好。成品冬尖呈褐黑色，味鮮細(xì)嫩，咸淡適口，回味帶甜，深受消費(fèi)者喜愛[2-4]。

冬尖發(fā)酵過(guò)程中，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化以及菌群間的相互作用對(duì)冬尖風(fēng)味的形成起著重要作用，目前對(duì)冬尖的研究主要集中在其加工工藝、病害防治、鹵水發(fā)酵、副產(chǎn)物等方面[5-7]，而對(duì)冬尖發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化研究甚少。早在1995年，萬(wàn)波等[8]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)資中冬尖發(fā)酵工藝中的微生物學(xué)問題進(jìn)行了研究，對(duì)冬尖發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化有了初步了解，但由于采用的是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，嚴(yán)重降低了樣品的微生物多樣性，不能準(zhǔn)確、全面地描繪發(fā)酵過(guò)程中微生物的概貌，且在此次研究中，分離培養(yǎng)出的微生物僅歸納到類，并未鑒定到種，因此有必要對(duì)資中冬尖發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化做進(jìn)一步研究。2012年，董玲等[9]采用16S rDNA-RFLP方法對(duì)腌制4 a的南充冬菜進(jìn)行了細(xì)菌群落組成及多樣性分析，但并未對(duì)發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究。

1993年，Muyzer等[10]首次將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）引入微生物生態(tài)領(lǐng)域，該技術(shù)可通過(guò)免培養(yǎng)法再現(xiàn)原始群落結(jié)構(gòu)，避免分離培養(yǎng)法造成的分析誤差[11-12]，目前該技術(shù)已成為研究微生物遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)和菌群差異的一種先進(jìn)手段，被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，如監(jiān)測(cè)食品中微生物在時(shí)間或空間上的動(dòng)態(tài)變化[13-15]、鑒定功能微生物和病原菌[16-18]、評(píng)價(jià)和控制食品質(zhì)量[19-20]等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者采用PCRDGGE技術(shù)對(duì)腌制蔬菜中的微生物多樣性進(jìn)行研究，但主要涉及酸菜[21]、泡菜[22-23]、榨菜[24-25]、芽菜[26]、韓國(guó)泡菜[27-29]、麻竹筍[30]等，對(duì)冬尖的研究鮮見報(bào)道。本研究以不同發(fā)酵周期的資中冬尖為對(duì)象，采用PCR-DGGE技術(shù)，分析冬尖發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化，為冬尖的生產(chǎn)工藝和風(fēng)味物質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵0（入池之前冬尖）、1、2、3 a的冬尖樣品，由匯源集團(tuán)資中佳釀食品廠提供。

PCR master mix、PMD19-T Vector 日本Takara公司；去離子甲酰胺 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；四甲基二乙胺、雙丙烯酰胺 美國(guó)Sigma公司；過(guò)硫酸銨 生工生物工程股份有限公司；凝膠回收試劑盒美國(guó)O m e g a公司；D H5 α感受態(tài)細(xì)胞、蛋白酶K（proteinase K，PK） 天根生化科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）成都貝斯特試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、溴化十六烷基三甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；PCR儀、凝膠成像儀、電泳儀、變性梯度凝膠電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 總DNA提取

[31-32]，在無(wú)菌條件下，將樣品剪碎后加入20 μL TENP緩沖液，180 r/min搖床20 min。取1 mL樣液加入EP管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清液收集菌體，此步驟重復(fù)3 次；向菌體中加入1 mL PBS液，吹打均勻，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，此步驟重復(fù)2 次；向EP管中加入少量小玻珠和適量石英砂，然后加入1 mL DNA提取液（100 mmol/L Tris、100 mmol/L EDTA、200 mmol/L NaCl、3% PVP，pH 9.0），旋渦振蕩2 min，吹散菌團(tuán)，再加入20 μL溶菌酶溶液充分混勻，37 ℃水浴30 min；向EP管中加入100 μL SDS和10 μL PK混勻，先37 ℃水浴30 min，再65 ℃水浴30 min，6 000 r/min離心15 min，收集上清液轉(zhuǎn)入新EP管；向上清液中加入100 μL5 mol/L NaCl和80 μL CTAB-NaCl混勻，65 ℃水浴10 min，再加入780 μL氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）混勻，4 ℃、15 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)上清液入新EP管；向EP管中加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）混勻，4 ℃、15 000 r/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)入新EP管中，再加入0.6 倍體積的異丙醇混勻，－20 ℃條件下靜置1 h；EP管中加入500 μL 70%乙醇洗滌，4 ℃、15 000 r/min離心10 min，棄上清液，室溫干燥10 min，加入50 μL 1×TE buffer，－20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增

采用巢式PCR與降落PCR相結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增，引物見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table1 PCR primers applied in this study

1.3.2.1 第1輪PCR擴(kuò)增

以總DNA為模板，采用引物27f和1492r對(duì)細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL，PCR master mix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序采用降落PCR模式：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，每個(gè)循環(huán)退火溫度依次降低0.5 ℃，72 ℃延伸2 min，20 個(gè)循環(huán)；當(dāng)退火溫度降至55 ℃，再以該溫度擴(kuò)增10 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。

1.3.2.2 第2輪PCR擴(kuò)增

以稀釋100 倍的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用引物GC357f和517r[23,33]對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：上下游引物各1 μL、PCR master mix 25 μL、DNA模板2 μL、滅菌ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。

1.3.3 DGGE及條帶測(cè)序

每個(gè)樣品取35 μL PCR產(chǎn)物與7 μL 6×loading buffer混勻后加入到點(diǎn)樣孔中。采用8%聚丙烯酰胺變性凝膠，變性梯度為45%～65%。在1×TAE緩沖液中，PCR產(chǎn)物在恒溫60 ℃、恒壓60 V條件下電泳12 h。電泳結(jié)束后取出膠放入SYBR GreenⅠ染液中浸染30 min，使用凝膠成像儀拍照。DGGE圖譜中條帶的亮度在一定程度上能反映菌種的數(shù)量，較亮的條帶即為樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)圖譜中較亮的條帶進(jìn)行切膠，條帶回收，回收的條帶進(jìn)行一次無(wú)GC夾板的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增子載入PMD19-T中進(jìn)行克隆，陽(yáng)性克隆子菌液送美吉生物公司測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將DGGE圖譜用Quantity One軟件進(jìn)行處理，分析各樣品條帶的灰度值、數(shù)量及遷移率，對(duì)各樣品相似性采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）法進(jìn)行聚類分析，同時(shí)根據(jù)香龍-威納多樣性指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（D）和均勻度指數(shù)（EH）評(píng)價(jià)各樣品的多樣性[34]，分別根據(jù)公式（1）～（3）計(jì)算：

式中：Pi為第i條條帶的灰度值占樣品總灰度值的比值；S為每一泳道中的總條帶數(shù)；N為條帶總數(shù)。

測(cè)序結(jié)果采用DNAstar和Cluster軟件進(jìn)行序列分析，下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用MEGA軟件，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)（Bootstrap）為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1 細(xì)菌巢式PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis profiles of bacterial nested PCR products

由圖1A可知，第1輪PCR對(duì)細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，目的產(chǎn)物大小約1.6 kb，所有樣品擴(kuò)增條帶均與目的條帶一致，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由圖1B可知，第2輪PCR對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，目的產(chǎn)物大小約230 bp，所有樣品擴(kuò)增條帶均與目的條帶一致，可用于DGGE分析。

2.2 細(xì)菌DGGE指紋圖譜

DGGE圖譜中條帶的多少能直接反映樣品中微生物的多樣性，條帶的亮度在一定程度上能反映菌種數(shù)量的多少[35]。從圖2可知，不同年份冬尖樣品電泳后分離出的條帶數(shù)目、遷移率及亮度均存在差異，說(shuō)明冬尖在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。從DGGE圖譜可以很直觀地看出發(fā)酵1 a的冬尖樣品其電泳條帶數(shù)目最多，豐度最大，而發(fā)酵2 a的冬尖樣品其條帶數(shù)目相對(duì)較少。多樣性指數(shù)是研究群落物種和個(gè)體數(shù)及其分布均勻度的綜合指標(biāo)[34]，為了更準(zhǔn)確地比較不同樣品的多樣性情況，根據(jù)1.4節(jié)計(jì)算各樣品的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)。第1年冬尖樣品其多樣性指數(shù)和豐度最高，分別為2.540和1.675，而第2年冬尖樣品其多樣性指數(shù)和豐度最低，分別為1.450和0.829，這個(gè)結(jié)果與DGGE圖譜直接觀測(cè)結(jié)果相一致。

圖2 冬尖發(fā)酵各階段細(xì)菌DGGE圖譜Fig.2 DGGE profiles of bacterial community in Dongjian at different fermentation stages

2.3 DGGE指紋圖譜聚類分析

在DGGE指紋圖譜中，不同樣品共有條帶數(shù)目的多少可以反映樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性，一般采用UPGMA對(duì)樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性進(jìn)行評(píng)估。資中冬尖0～3 a樣品的細(xì)菌聚類分析結(jié)果見圖3。從圖3可知，各樣品間的相似性在9%～67%，說(shuō)明冬尖在發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化。其中第2年和第3年冬尖樣品的相似性最高，為67%，而第1年與第2、3年冬尖的相似性最低，分別只有9%和17%。這可能是因?yàn)槎庠诎l(fā)酵過(guò)程中，第1年為好氧向厭氧轉(zhuǎn)變的階段，此時(shí)大部分微生物還能生長(zhǎng)繁殖，因此第1年冬尖樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)最豐富，從DGGE指紋圖譜中也能看出其條帶數(shù)目最多。當(dāng)發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行到第2、3年時(shí)，已完全轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬醐h(huán)境，且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也被大量消耗，使大部分微生物生長(zhǎng)繁殖受到抑制，只有一部分適應(yīng)此環(huán)境的特定菌群能很好的生長(zhǎng)，從而使第2年和第3年冬尖樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)具有一定趨向性，這也解釋了為什么第2、3年樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)相似性最高。

圖3 冬尖細(xì)菌DGGE指紋圖譜聚類分析Fig.3 Cluster analysis of DGGE profiles for bacterial communities of Dongjian

2.4 DGGE條帶測(cè)序及同源性分析

表2 細(xì)菌DGGE條帶測(cè)序結(jié)果Table2 Sequencing results from the bands excised from the bacterial DGGE gels

圖4 冬尖細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of bacterial species in Dongjian

將細(xì)菌DGGE圖譜上較亮的代表?xiàng)l帶，共19 條進(jìn)行切膠、克隆、測(cè)序，并構(gòu)建進(jìn)化樹，測(cè)序結(jié)果見表2，進(jìn)化樹圖譜見圖4。由表2結(jié)果顯示，所有序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rDNA序列的相似性在97%～100%之間，說(shuō)明均具有鑒定意義。從細(xì)菌N-J進(jìn)化圖可以看出，資中冬尖在發(fā)酵過(guò)程中，所涉及的細(xì)菌主要分為3 類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和非培養(yǎng)菌。其中厚壁菌門細(xì)菌類群為優(yōu)勢(shì)菌，占53%；其次是變形桿菌門，占37%；最少的為非培養(yǎng)菌，占10%。

3 討論與結(jié)論

資中冬尖是以芥菜為原料采用自然發(fā)酵制成的蔬菜腌制品，其風(fēng)味的形成受眾多因素影響，如原料、工藝、發(fā)酵時(shí)間、溫度等，其中發(fā)酵過(guò)程中微生物的菌群變化與代謝活動(dòng)是影響冬尖風(fēng)味的重要因素。目前關(guān)于資中冬尖發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性的研究較少，本研究以不同發(fā)酵周期的資中冬尖為對(duì)象，采用PCR-DGGE技術(shù)，對(duì)冬尖發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析。

結(jié)果表明，不同年份的冬尖樣品其電泳后分離出的條帶數(shù)目、遷移率及亮度均存在差異，說(shuō)明冬尖在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且發(fā)酵1 a的冬尖樣品其條帶數(shù)目最多，細(xì)菌多樣性較豐富，而發(fā)酵2 a的冬尖樣品其條帶數(shù)目相對(duì)較少。對(duì)DGGE指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，各樣品間的相似性在9%～67%，說(shuō)明冬尖在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌群落結(jié)果發(fā)生了較大改變，其中第2年和第3年冬尖樣品的相似性最高，為67%，而第1年與第2年冬尖的相似性最低僅9%。從DGGE圖譜上切割回收19 條條帶，測(cè)序結(jié)果表明，資中冬尖在發(fā)酵過(guò)程中，所涉及的細(xì)菌主要分為3 類，分別為厚壁菌門、變形桿菌門和非培養(yǎng)菌。其中厚壁菌門細(xì)菌類群為優(yōu)勢(shì)菌，占53%，其次是變形桿菌門，占37%，最少的為非培養(yǎng)菌，占10%。董玲等[9]采用16S rDNA-RFLP方法對(duì)腌制4 a的南充冬菜進(jìn)行了細(xì)菌多樣性分析，結(jié)果表明發(fā)酵4 a的南充冬菜，其細(xì)菌結(jié)構(gòu)也主要分為3類，分別為變形桿菌門、后壁門和放線菌門，其中以變形桿菌門細(xì)菌類群為優(yōu)勢(shì)菌群。從本研究分離菌株所屬類別可以看出，資中冬尖在發(fā)酵過(guò)程中，存在大量中度嗜鹽菌和芽孢桿菌科類群，這可能與資中冬尖發(fā)酵過(guò)程中形成的高鹽厭氧環(huán)境有關(guān)。芽孢桿菌可以產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的內(nèi)生芽孢來(lái)度過(guò)不利的生長(zhǎng)條件，因此即使是在高鹽厭氧這種惡劣的環(huán)境中也可以生長(zhǎng)繁殖，此外，芽孢桿菌具有較好的抑菌防病作用，有利于冬尖發(fā)酵的防腐。中度嗜鹽菌分布在很多屬中，主要生活在海洋、鹽場(chǎng)、鹽湖和腌制品等高鹽環(huán)境中[36]。資中冬尖的鹽濃度在16%左右，在這種高鹽環(huán)境中，大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)都受到了抑制，但卻非常適合中度嗜鹽菌的生長(zhǎng)，因此在冬尖發(fā)酵樣品中檢測(cè)出大量中度嗜鹽菌，包括：Halanaerobium fermentans、Alkalibacillus salilacus、抱川芽孢桿菌（Bacillus pocheonensis）、鹽脫硝枝芽孢桿菌（Virgibacillus halodenitrificans）、冰下鹽單胞菌（Halomonas subglaciescola）、沉積物枝芽孢桿菌（Virgibacillus sediminis）。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)DGGE指紋圖譜中條帶在不同樣品中出現(xiàn)的情況進(jìn)行分析。條帶1和3的測(cè)序結(jié)果分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（100%）和Azospirillum oryzae（99%）的近源種，結(jié)合DGGE指紋圖譜可以看出，條帶1和3在入池之前的冬尖樣品中出現(xiàn)，但條帶亮度均較暗，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，條帶在第1、2年冬尖樣品中消失，但在第3年樣品中又重新出現(xiàn)，且條帶3為第3年冬尖樣品中的優(yōu)勢(shì)菌。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是條帶1和3在第1、2年樣品中屬于弱勢(shì)菌群，而DGGE一般只能檢測(cè)出在總的微生物群落中占1%以上的種群，而對(duì)弱勢(shì)菌群不能檢測(cè)出。萬(wàn)波等[8]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)資中冬尖發(fā)酵1、2、3 a的樣品進(jìn)行了微生物群落的研究，結(jié)果表明乳酸菌在資中冬尖發(fā)酵過(guò)程中受到了抑制并不是主要菌群。條帶9和10測(cè)序結(jié)果分別為L(zhǎng)actobacillus rennini（99%）和消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）（99%）的近源種。資中冬尖的鹽含量在16.1%左右，而一般認(rèn)為鹽含量低于12%有利于乳酸菌的生長(zhǎng)，高于12%乳酸菌生長(zhǎng)受到抑制。從DGGE指紋圖譜可以看出，條帶9和10是入池之前冬尖樣品中的優(yōu)勢(shì)菌，條帶較亮，但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，條帶消失或者變暗，說(shuō)明乳酸菌在冬尖發(fā)酵過(guò)程中受到了抑制，此結(jié)果與萬(wàn)波等[8]研究結(jié)果相一致。條帶11為根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）（100%）的近源種，只存在于入池前冬尖樣品中，在發(fā)酵過(guò)程中消失。根癌農(nóng)桿菌是一種嚴(yán)重危害植物生長(zhǎng)的病害，能感染雙子葉植物的受傷組織，引起冠癭瘤，資中冬尖的原料芥菜屬于雙子葉植物，容易受根瘤農(nóng)桿菌的侵染，冬尖在發(fā)酵過(guò)程中形成了高鹽厭氧環(huán)境，可能正是這種惡劣的環(huán)境抑制了根瘤農(nóng)桿菌在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)。綜上所述，采用PCR-DGGE技術(shù)能更直觀、更全面地展現(xiàn)冬尖發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其動(dòng)態(tài)變化，為冬尖生產(chǎn)工藝及其風(fēng)味形成原理提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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PCR-DGGE Analysis of Bacterial Diversity during Fermentation of Zizhong Dongjian, a Chinese Traditional Fermented Vegetable Product

WANG Miao, LI Zhang, SUN Qun*
(Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

Objective： To investigate dynamic changes in the microbial community structure during the fermentation of Zizhong Dongjian, a Chinese traditional fermented vegetable product, by polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). Methods： Four samples of Dongjian with different fermentation times were collected from Zizhong, Sichuan province. Total bacterial DNA was extracted from the samples, and nested PCR was applied to amplify the V3 region of 16S rDNA for identification based on DGGE fingerprints. Meanwhile, the dominant bands were cloned, selected and sequenced, and a phylogenetic tree was constructed. Results： During the fermentation process of Dongjian, rich bacterial diversity was observed and the microbial community structure was changed greatly. The similarity of bacterial community between Dongjian samples with different fermentation times ranged from 9% to 67%. Among them, samples fermented for two and three years exhibited the highest similarity to each other, up to 67%. Furthermore, the bacteria involved in the fermentation process of Dongjian were mainly divided into3 categories： Firmicutes, Proteobacteria, and unculturable bacteria. Among these, Firmicutes was the most dominant species followed by Proteobacteria, which accounted for 53% and 37% of the total population, respectively, while unculturable bacteria accounted for only 10%. Conclusions：DGGE fingerprint can provide a comprehensive and true reflection of dynamic changes in the microbial diversity of Dongjian during fermentation. Meanwhile, it also provides a theoretical basis for the production process for Dongjian and the formation of flavor substances.

Dongjian; polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis; bacterial diversity

10.7506/spkx1002-6630-201712018

TS201.3

A

1002-6630（2017）12-0119-06

汪淼, 李張, 孫群. PCR-DGGE分析資中冬尖發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌多樣性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 119-124.

10.7506/ spkx1002-6630-201712018 http：//www.spkx.net.cn

WANG Miao, LI Zhang, SUN Qun. PCR-DGGE analysis of bacterial diversity during fermentation of Zizhong Dongjian, a Chinese traditional fermented vegetable product[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 119-124. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712018. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-07

汪淼（1987—），女，碩士，研究方向?yàn)槲⑸餀z測(cè)。E-mail：wangmiaosichuan@163.com

*通信作者：孫群（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锛夹g(shù)與食品安全。E-mail：qunsun@scu.edu.cn