白夢(mèng)洋，吳祖芳*，李若云，翁佩芳，張 鑫

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

混合培養(yǎng)條件下釀酒酵母菌與畢赤酵母菌的相互影響

白夢(mèng)洋，吳祖芳*，李若云，翁佩芳，張 鑫

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

為研究酵母菌混合培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)狀態(tài)的變化規(guī)律以及相互影響的因素，選取2 種酵母菌，釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae，Sc）131和畢赤酵母菌（Pichia fabianii，Pf）65，考察了初始糖含量、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)兩菌種混合培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，并通過氣相色譜-質(zhì)譜分析方法考察了2 種細(xì)胞脂肪酸組成的差異性。結(jié)果表明，相對(duì)于純培養(yǎng)，混合培養(yǎng)條件下，Pf對(duì)Sc產(chǎn)生明顯的抑制作用，在低糖和低pH值環(huán)境條件下，Sc受抑制作用加劇，當(dāng)初始糖含量2%時(shí)，Pf/Sc（菌體濃度比）為28，pH 3.5時(shí)，Pf/Sc達(dá)37；在外源添加乙醇時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，Pf受抑制程度較Sc嚴(yán)重，Sc生長(zhǎng)處于相對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，說明Sc較Pf耐乙醇，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，Pf/Sc為0.5。經(jīng)細(xì)胞脂肪酸組成分析，Sc主要為C16的棕櫚酸和棕櫚油酸，Pf主要為C18的油酸、亞油酸和亞麻酸，混合培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞脂肪酸組成主要為C18型脂肪酸，Pf細(xì)胞代謝產(chǎn)生的亞油酸和亞麻酸的積累釋放可能是抑制Sc生長(zhǎng)的因素之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄組水平研究混合酵母相互影響的機(jī)制，以及發(fā)酵質(zhì)量控制提供理論支持。

混合培養(yǎng)；初始糖含量；pH值；乙醇；脂肪酸

傳統(tǒng)果酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的多種微生物共同作用的過程，酵母在其中起著重要的作用，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，Sc）主要完成酒精發(fā)酵，發(fā)酵速率快，發(fā)酵力強(qiáng)，而非釀酒酵母（non-Saccharomyces）能將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)，如酯、酸、高級(jí)醇等產(chǎn)物，并合成多種酶，對(duì)果酒色澤、風(fēng)味的形成具有重要作用[1-2]。與單獨(dú)發(fā)酵相比，酵母的混菌發(fā)酵能表現(xiàn)出更好的特性，如酒中甘油含量增加、乙酸含量降低，產(chǎn)生酯類、揮發(fā)性酚類等特殊風(fēng)味物質(zhì)，能夠改善成品酒整體質(zhì)量和品質(zhì)，增強(qiáng)果酒風(fēng)味多樣性[3-5]。

在前期研究中，分別從熱帶水果中分離篩選了2 株優(yōu)良酵母菌株，分別為產(chǎn)酒精和發(fā)酵能力較強(qiáng)的Sc 131，以及對(duì)風(fēng)味有顯著貢獻(xiàn)的畢赤酵母菌（Pichia fabianii，Pf）65，通過不同類型酵母菌的混合培養(yǎng)以達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從而可加強(qiáng)產(chǎn)品的功能特性[6-7]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在混菌發(fā)酵時(shí)，酵母菌在其生長(zhǎng)過程中會(huì)受到毒性代謝物介導(dǎo)的抑制作用，其中高體積分?jǐn)?shù)的乙醇被認(rèn)為是Sc對(duì)非Sc形成優(yōu)勢(shì)地位的主要因素[8]。另有研究表明，Sc在發(fā)酵過程中產(chǎn)生除酒精外的代謝產(chǎn)物，如中長(zhǎng)鏈脂肪酸、寡聚肽、環(huán)化高級(jí)醇等會(huì)抑制其他菌種的生長(zhǎng)[9-10]。此外，酵母還會(huì)受到多種環(huán)境因素的影響，如高濃度糖導(dǎo)致的高滲透、pH值降低、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗等。Renault等[11]研究了混合發(fā)酵體系中戴爾凱氏有孢圓酵母和Sc的生長(zhǎng)變化，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞之間的接觸和可溶性致死分子的釋放似乎引發(fā)了戴爾凱氏有孢圓酵母的早期死亡。然而，混菌發(fā)酵過程菌種相互作用的影響因素較為復(fù)雜，不同酵母之間的作用也具有很大差異，對(duì)于其相互之間影響的本質(zhì)，國(guó)內(nèi)外至今沒有統(tǒng)一的定論。

本實(shí)驗(yàn)以前期篩選出的2 種優(yōu)良酵母菌株為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行單菌種及混合培養(yǎng)，通過考察酵母混菌發(fā)酵時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)變化規(guī)律，分析發(fā)酵環(huán)境變化和脂肪酸代謝產(chǎn)物，為后續(xù)研究酵母混菌培養(yǎng)相互影響的分子機(jī)制、指導(dǎo)果酒生產(chǎn)實(shí)踐等提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：Sc 131、Pf 65均保藏于寧波大學(xué)海洋學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、含山梨醇的基本培養(yǎng)基（蛋白胨5 g/L、酵母浸粉1 g/L、瓊脂15 g/L、山梨醇5 g/L，pH 5.5±0.2） 杭州微生物試劑有限公司；乙醇、NaOH、甲醇、正己烷 上海晶純生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-40BⅠ型立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；XPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；超聲波振蕩儀 昆山市淀山湖檢測(cè)儀器廠；QP 2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

取甘油保藏菌種，劃線于YPD固體培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取一環(huán)平板活化的菌體于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)24 h后于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.3.2 發(fā)酵方法及生長(zhǎng)的測(cè)定

將活化好的2 種酵母菌以1∶1（V/V）的比例接種于裝有50 mL滅菌YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，并分別接種2 種酵母菌作為純培養(yǎng)對(duì)照，30 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)?；旌吓囵B(yǎng)及純培養(yǎng)接種后培養(yǎng)液起始濃度均為2×105CFU/mL。

細(xì)胞數(shù)量測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法。在混合培養(yǎng)條件下，由于Sc和Pf生長(zhǎng)形態(tài)一致，肉眼難以區(qū)分，但Sc在含山梨醇的培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)，Pf可以正常生長(zhǎng)，故采用含山梨醇的基本培養(yǎng)基進(jìn)行選擇計(jì)數(shù)。

1.3.3 初始糖含量對(duì)混合培養(yǎng)酵母菌生長(zhǎng)的影響

將活化好的2 種酵母菌按1.3.2節(jié)所述分別接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基（葡萄糖含量分別為2%、5%、10%、15%和20%）中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后測(cè)定各菌株生長(zhǎng)量。

1.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)混合培養(yǎng)酵母菌生長(zhǎng)的影響

將活化好的2種酵母菌按1.3.2節(jié)所述分別接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基（乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為2%、5%、8%、10%和12%）中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后測(cè)定各菌株生長(zhǎng)量。

1.3.5 pH值對(duì)混合培養(yǎng)酵母菌生長(zhǎng)的影響

以YPD為發(fā)酵培養(yǎng)基，用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)其pH值分別為2.5、3.5、4.5、5.5和6.5，將活化好的2 種酵母菌，按1.3.2節(jié)所述分別接種到50 mL不同pH值的培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)定各菌株生長(zhǎng)量。

1.3.6 脂肪酸的檢測(cè)

參考Redón等[12]方法測(cè)定酵母胞內(nèi)脂肪酸含量，并略作調(diào)整。酵母細(xì)胞用凍融法破碎后取1 g濕樣，加入1 mL 5% NaOH-CH3OH/H2O溶液，100 ℃封閉水浴30 min，收集皂化液，加入2 mL6 mol/L HCl溶液，80 ℃密封水浴10 min。加入3 mL正己烷，30 s渦流振動(dòng)提取，3 000 r/min離心3 min收集有機(jī)層，提取3 次，合并有機(jī)層，氮吹至1 mL，待分析。

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)脂肪酸甲酯進(jìn)行分析，色譜柱：FFAP石英毛細(xì)管柱（30 mm×0.32 mm，0.25 μm）；柱溫：120 ℃維持2 min后以15 ℃/min升到150 ℃，再以5 ℃/min升溫至200 ℃保持5 min；氫火焰離子檢測(cè)器，溫度250 ℃，H2流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min；進(jìn)樣器溫度：250 ℃；載氣流速：N212 cm/s，進(jìn)樣量：0.5 μL；以商品化的脂肪酸甲酯為標(biāo)樣，氣相色譜數(shù)據(jù)處理采用歸一法。

脂肪酸不飽和度根據(jù)下式計(jì)算：

不飽和度=1×單烯數(shù)+2×雙烯數(shù)+3×三烯數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3 次，利用SAS 8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合培養(yǎng)條件下2 種酵母菌的生長(zhǎng)變化

圖1 不同培養(yǎng)方式下2 種酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic growth curves of two yeasts under different culture conditions

圖2 不同培養(yǎng)方式下2 種酵母菌生長(zhǎng)比率變化Fig.2 Changes in Pf/Sc ratio under different culture conditions

由圖1、2可知，在發(fā)酵過程中，Pf/Sc比值（菌體濃度比）均大于1，說明Pf生長(zhǎng)速率較Sc高，2 種酵母均在12 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期。純培養(yǎng)時(shí)，Pf和Sc分別在24 h達(dá)到最大生長(zhǎng)量，分別為2.3×108CFU/mL和4.5×107CFU/mL。在混合培養(yǎng)條件下，2 種酵母生長(zhǎng)量均未達(dá)到其純培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)量，這是由于混菌培養(yǎng)時(shí)相互競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)資源且相互抑制造成的[13]，可以看出，進(jìn)入穩(wěn)定期后，Pf/Sc比值迅速升高，說明Pf開始成為優(yōu)勢(shì)菌，大大抑制了Sc的生長(zhǎng)，在24 h時(shí)，Pf/Sc比值達(dá)到最高為28，Pf生長(zhǎng)量達(dá)到1.8×108CFU/mL，基本達(dá)到其純培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)量，而Sc此時(shí)生長(zhǎng)量為6.4×106CFU/mL，低于其純培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)量。據(jù)研究報(bào)道，Pf在葡萄酒發(fā)酵初始階段能夠較早生長(zhǎng)，消耗了氨基酸和維生素，并且能產(chǎn)生一種肽類毒素，限制后續(xù)Sc菌株的生長(zhǎng)[14-15]。此外Pf能耐受低pH值、低水分活度、高滲透壓、厭氧等極端環(huán)境，相比于Sc更能適應(yīng)外界環(huán)境脅迫[16]。在混菌培養(yǎng)時(shí)，Sc雖處于劣勢(shì)，但仍能保持一定生長(zhǎng)量，這可能是由于Pf在發(fā)酵初期生長(zhǎng)時(shí)蛋白水解造成培養(yǎng)基中氮源的富集，增強(qiáng)了Sc對(duì)一些氨基酸的吸收和消耗，形成一種氮源利用的協(xié)同機(jī)制，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙醇含量將逐漸增加，對(duì)Pf產(chǎn)生乙醇脅迫，一定程度上緩解了對(duì)Sc的抑制作用[17]。

2.2 初始糖含量對(duì)混合培養(yǎng)兩菌種生長(zhǎng)的影響

圖3 初始糖含量對(duì)酵母菌混合培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響Fig.3 Growth rate of yeasts at different initial glucose concentrations

圖4 不同初始糖含量條件下2 種酵母菌生長(zhǎng)比率Fig.4 Effect of initial glucose concentration on Pf/Sc ratio

從圖3、4可知，與純培養(yǎng)相比，Sc和Pf混合培養(yǎng)時(shí)Sc生長(zhǎng)受到明顯抑制，而Pf生長(zhǎng)基本保持不變，說明在碳源的競(jìng)爭(zhēng)中，Sc處于劣勢(shì)，故Pf/Sc比率最大。隨著糖含量的升高，可利用的碳源增加，一定程度上緩解了Pf對(duì)Sc的抑制，同時(shí)，高含量的糖會(huì)引起高滲透壓脅迫，使酵母細(xì)胞失水皺縮，改變細(xì)胞膜的雙層結(jié)構(gòu)，而其上的蛋白質(zhì)活性和離子通道受到影響，進(jìn)而延緩了酵母菌生長(zhǎng)的速率[18]，因此，Sc的生長(zhǎng)量逐漸提升，Pf/Sc逐漸降低，但Pf仍保持著優(yōu)勢(shì)以及對(duì)Sc的抑制。此外，Sc在糖含量達(dá)到20%時(shí)，混合培養(yǎng)生長(zhǎng)量仍未達(dá)到純培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)量。這可能是由于酵母細(xì)胞度過遲滯期后快速分裂，糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，以及高級(jí)醇、寡聚肽等毒性介導(dǎo)物造成酵母之間脅迫作用[19]。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)混合培養(yǎng)兩菌種生長(zhǎng)的影響

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酵母菌混合培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on yeast growth

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，酵母菌存活能力變差，這是由于乙醇結(jié)合到細(xì)胞膜的疏水區(qū)，降低疏水性的相互作用，造成酵母蛋白變性，細(xì)胞膜破裂，生長(zhǎng)量下降[20]。從圖5可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%、12%時(shí)Sc生長(zhǎng)量開始高于Pf，說明其耐受酒精能力強(qiáng)于Pf。

圖6 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下2種酵母菌生長(zhǎng)比率Fig.6 Effect of ethanol concentrations on Pf/Sc ratio

從圖6可以看出，低乙醇體積分?jǐn)?shù)下，混合培養(yǎng)時(shí)，Pf/Sc較高，Pf生長(zhǎng)處于優(yōu)勢(shì)，而高乙醇體積分?jǐn)?shù)下，Pf耐受能力變差，Pf/Sc變小，Sc開始占優(yōu)勢(shì)。這與一般發(fā)酵的初期由酒精耐受能力較弱但具有較高產(chǎn)香能力的Pf來完成，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷升高，Pf的這種優(yōu)勢(shì)逐漸被乙醇耐受能力較強(qiáng)的Sc代替情況相吻合。

2.4 pH值對(duì)混合培養(yǎng)兩菌種生長(zhǎng)的影響

從圖7、8可知，隨著酸脅迫的進(jìn)行，Sc耐酸性較Pf差，pH 2.5時(shí)已基本死亡，而Pf仍能保持較好的生長(zhǎng)，隨著pH值的升高，Sc生長(zhǎng)量開始提升，Pf/Sc降低。實(shí)際生產(chǎn)中，在發(fā)酵初始階段，酵母就會(huì)受到低pH值脅迫，而葡萄醪的pH值通常在2.75～4.20，低pH值會(huì)影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，改變質(zhì)膜構(gòu)型，導(dǎo)致其喪失完整性，從而影響Sc發(fā)酵速度和正常生理功能[21]。在混合培養(yǎng)體系中，在pH 3.5～6.5期間，Pf均能達(dá)到較高生長(zhǎng)量，能達(dá)到108CFU/mL，相對(duì)Sc優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，而與純培養(yǎng)相比，Sc受到明顯的抑制。Sc耐酸性較弱，也是其在混合培養(yǎng)中處于劣勢(shì)的主要因素之一。

圖7 pH值對(duì)酵母菌混合培養(yǎng)生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of pH on yeast growth

圖8 不同pH值條件下2 種酵母菌生長(zhǎng)比率Fig.8 Effects of pH values on Pf/Sc ratio

2.5 不同培養(yǎng)方式下細(xì)胞脂肪酸組成比較

表1 培養(yǎng)方式與培養(yǎng)時(shí)間酵母菌體細(xì)胞脂肪酸組成的比較Table1 Fatty acid composition of yeast cells cultured by different culture methods for different periods of time

脂肪酸作為酵母菌的結(jié)構(gòu)成分中的重要成分，有助于維護(hù)細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，影響細(xì)胞活性，在酵母共發(fā)酵反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[12]。對(duì)2種酵母菌分別純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)，并取其對(duì)數(shù)期和生長(zhǎng)穩(wěn)定期菌體，經(jīng)氣相色譜法分析脂肪酸組成，結(jié)果見表1。脂肪酸作為酵母細(xì)胞中含量豐富且穩(wěn)定的一種化學(xué)組分，在不同的酵母中分布有所差異，但絕大多數(shù)酵母脂肪酸多由C16脂肪酸和C18脂肪酸構(gòu)成，其中主要的飽和脂肪酸是棕櫚酸，不飽和脂肪酸是棕櫚油酸和油酸，與細(xì)胞膜的流動(dòng)性密切相關(guān)[22-23]。由表1可以看出，Sc和Pf的脂肪酸分布不同，Sc相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較多的是C16棕櫚酸和棕櫚油酸，其次是C18油酸，而Pf中C18油酸和亞油酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，其次是C16棕櫚酸和棕櫚油酸，兩種酵母脂肪酸分布集中于C16和C18，而十二烷酸、肉豆蔻酸、花生酸、二十碳五烯酸等其他不同碳數(shù)的脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)甚微。

在不同發(fā)酵階段的酵母脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生變化（表1），Sc在對(duì)數(shù)期脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是棕櫚油酸，占43.45%，其次是油酸占22.57%，但進(jìn)入穩(wěn)定期后，C16脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大幅增加，其中棕櫚油酸比例升高至61.43%，而C18脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)則減小，油酸比例下降至11.23%，這可能是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒精含量增高，乙醇脅迫時(shí)能夠使酵母的細(xì)胞脂質(zhì)構(gòu)成發(fā)生改變，且有研究證實(shí)酵母細(xì)胞中單不飽和脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，越有利于酵母在酒精沖擊下的存活率，特別是C16類型脂肪酸對(duì)發(fā)酵酒精耐性影響更大[24]，此外，酵母菌細(xì)胞在酒精脅迫時(shí)可通過不飽和脂肪酸及固醇相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加引起細(xì)胞膜整體流動(dòng)性增加，從而增加酵母菌的酒精耐性[25-26]。王川等[27]通過外源添加棕櫚油酸和油酸培養(yǎng)后的酵母發(fā)酵產(chǎn)生了較高的酒精體積分?jǐn)?shù)，體現(xiàn)出了高酒精耐性。而Sc中脂肪酸的不飽和度也由對(duì)數(shù)期的0.842 4上升到穩(wěn)定期的0.874 0，說明其自身產(chǎn)生的代謝機(jī)制促使其不飽和脂肪酸比例升高，以耐受發(fā)酵后期不良環(huán)境。Pf在穩(wěn)定期，脂肪酸比例顯著增加的是C18油酸和亞油酸，比例分別從47.52%、21.56%增加到49.61%和23.67%，其和酒精耐受性相關(guān)的C16脂肪酸比例都有所降低，這也可以驗(yàn)證Pf酒精耐受性較Sc差的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外，Pf不飽和度并未發(fā)生顯著改變，且不飽和度高于Sc，也說明了Pf雖對(duì)酒精耐受較差，但對(duì)于發(fā)酵后期產(chǎn)生的低pH值、低水分活度、營(yíng)養(yǎng)缺失、厭氧等極端環(huán)境的耐受程度較Sc高[17]。

有研究表明，以中長(zhǎng)鏈脂肪酸、乙酸、蛋白化合物為代表的生物活性物質(zhì)在酵母共發(fā)酵體系中發(fā)揮著重要作用，可能在相互之間產(chǎn)生不利影響[28]。從表1可知，在對(duì)數(shù)階段，混合培養(yǎng)細(xì)胞中脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多的是C18油酸和亞油酸，分別為45.18%和20.86%，而C16棕櫚油酸和棕櫚酸分別占12.64%和8.51%，進(jìn)入穩(wěn)定期后，C18脂肪酸比例有所下降，C16類型有所上升，但總體而言，占比例最高的仍是油酸31.72%，其次是亞油酸21.23%，亞麻酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也從2.63%升至4.46%。結(jié)合2.2節(jié)和2.4節(jié)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在高糖和低pH值等不良外界環(huán)境中，混合培養(yǎng)條件下Pf處于優(yōu)勢(shì)地位，Sc生長(zhǎng)受到明顯抑制；從細(xì)胞脂肪酸組成上可看出，混合培養(yǎng)條件下細(xì)胞脂肪酸組成和Pf單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞脂肪酸組成類似，C18型脂肪酸占比例最高，Pf細(xì)胞產(chǎn)生的亞油酸、亞麻酸積累釋放可能引起Sc細(xì)胞活性的變化，造成抑制作用。事實(shí)上，早有研究表明酵母細(xì)胞產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)中長(zhǎng)鏈脂肪酸如十二烷酸、亞油酸、亞麻酸等的積累釋放會(huì)對(duì)不同種屬的酵母生長(zhǎng)具有抑制作用[29]。為進(jìn)一步證實(shí)，在單獨(dú)培養(yǎng)情況下，外源添加1.0、2.0、3.0 mmol/L的亞油酸時(shí)，Sc存活率分別下降了13.2%、26.4%和42.7%，而Pf生長(zhǎng)存活率和未添加時(shí)基本一致，也說明了亞油酸對(duì)Sc的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制。

3 結(jié) 論

通過改變外界環(huán)境因素，比較了Sc和Pf純培養(yǎng)及混合培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)差異，結(jié)果表明，Pf對(duì)Sc產(chǎn)生明顯的抑制作用，在低糖、低pH值環(huán)境時(shí)，Pf/Sc增大，Sc受抑制作用加劇，其中在初始糖含量2%時(shí)，Pf/Sc為28，pH 3.5時(shí)，Pf/Sc為37；在外源添加乙醇時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，Pf受抑制程度較Sc嚴(yán)重，Sc生長(zhǎng)處于相對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，說明Sc較Pf耐乙醇，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，Pf/Sc為0.5。通過細(xì)胞脂肪酸組成分析，Sc細(xì)胞脂肪酸組成主要為C16棕櫚酸、棕櫚油酸，Pf主要為C18油酸、亞油酸和亞麻酸，且Sc在不同培養(yǎng)時(shí)期由于環(huán)境條件的改變其脂肪酸組成有所變化；混合培養(yǎng)體系中脂肪酸組成主要為C18型脂肪酸，Pf細(xì)胞代謝產(chǎn)生的亞油酸、亞麻酸的積累釋放可能為抑制Sc生長(zhǎng)的因素之一。通過對(duì)酵母混菌發(fā)酵外界環(huán)境因素影響及脂肪酸組成及變化的初步分析，為后續(xù)從轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)角度研究混合酵母相互影響的機(jī)制提供理論依據(jù)。

[1] GOBBI M, COMITINI F, DOMIZIO P, et al. Non-Saccharomyces yeasts in controlled mixed culture fermentation in wine making： the role of metabolic interactions[J]. Journal of Biotechnology, 2010, 150(1)： 299-300. DOI：10.1016/j.jbiotec.2010.09.258.

[2] CIANI M, COMITINI F. Non-Saccharomyces wine yeasts have a promising role in biotechnological approaches to winemaking[J]. Annals of Microbiology, 2011, 61(1)： 25-32. DOI：10.1007/s13213-010-0069-5.

[3] JOLLY N P, VARELA C, PRETORIUS I S. Not your ordinary yeast non-Saccharomyces yeasts in wine production uncovered[J]. FEMS Yeast Research, 2014, 14(2)： 215-237. DOI：10.1111/1567-1364.12111.

[4] CONTRERAS A, HIDALUO C, HENSCHKE P A, et al. Evaluation of non-Saccharomyces yeasts for the reduction of alcohol content in wine[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(5)：1670-1678. DOI：10.1128/AEM.03780-13.

[5] GOBBI M, de VERO L, SOLIERI L, et al. Fermentative aptitude of Saccharomyces wine yeast for reduction in the ethanol contentin wine[J]. European Food Research and Technology, 2014, 239(1)：41-48. DOI：10.1007/s00217-014-2187-y.

[6] SADINENI V, KONDAPALLI N, OBULAM V S R. Effect of cofermentation with Saccharomyces cerevisiae and Torulaspora delbrueckii or Metschnikowia pulcherrima on the aroma and sensory properties of mango wine[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(4)： 1353-1360. DOI：10.1007/s13213-011-0383-6.

[7] CLEMENTE J J M, MINGORANCE C L, MARTINEZ R S, et al. Influence of sequential yeast mixtures on wine fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 98(3)： 301-308. DOI：10.1016/j.ijfoodchem.2004.06.007.

[8] PRETORIUS I S. Tailoring wine yeast for the new millennium：novel approaches to the ancient art of winemaking[J]. Yeast, 2000, 16(8)： 675-729. DOI：10.1002/1097-0061(20000615)16：8＜675：AIDYEA585＞3.0.CO;2-B.

[9] BRANCO P, FRANCISCO D, CHAMB ON M, et al. Identification of novel GAPDH-derived antimicrobial peptides secreted by Saccharomyces cerevisiae and involved in wine microbial interactions[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(2)：843-853. DOI：10.1007/s00253-013-5411-y.

[10] COMITINI F, GOBBI M, DOMIZIO P, et al. Selected non-Saccharmyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Microbiology, 2011, 28(5)：873-882. DOI：10.1016/j.fm.2010.12.001.

[11] RENAULT P E, ALBERTIN W, BELY M. An innovative tool reveals interaction mechanisms among yeast populations under oenological conditions[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(9)：4105-4119. DOI：10.1007/s00253-012-4660-5.

[12] REDóN M, GUILLAMóN J M, MAS A, et al. Effect of lipid supplementation upon Saccharomyces cerevisiae lipid compostion and fermentation performance at low temperature[J]. European Food Research and Technology, 2009, 228(5)： 833-840. DOI：10.1007/ s00217-008-0996-6.

[13] HERSEN P, MCCLEAN M N, MAHADEVAN L, et al. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway[J]. PNAS, 2008, 105(20)： 7165-7170. DOI：10.1073/pnas.0710770105.

[14] ORO L, CIANI M, COMITINI F. Antimicrobial activity of Metschnikowia pulcherrima on wine yeasts[J]. Journal of Applied Microbiology, 2014, 116(5)： 1209-1217. DOI：10.1111/jam.12446.

[15] ANFANG N, BRAJKOVICH M, GODDARD M R. Co-fermentation with Pichia kluyveri increases varietal thiol concentrations in Sauvignon Blanc[J]. Australian Journal of Grape and Wine Research, 2009, 15(1)： 1-8. DOI：10.1111/j.1755-0238.2008.00031.x.

[16] WALKER G M. Pichia anomala： cell physiology and biotechnology relative to other yeasts[J]. Antonie van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology, 2011, 99(1)： 25-34. DOI：10.1007/s10482-010-9491-8.

[17] MEDINA K, BOIDOA E, DELLACASSA E, et al. Growth of non-Saccharomyces yeasts affects nutrient availability for Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2012, 157(2)： 245-250. DOI：10.1016/ j.ijfoodmicro.2012.05.012.

[18] HOHMANN S. Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002, 66(2)：300-372. DOI：10.1128/MMBR.66.2.300-372.2002.

[19] MATURANO Y P, NALLY M C, TORO M E, et al. Monitoring of killer yeast populations in mixed cultures： influence of incubation temperature of microvinifications samples[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(11)： 3135-3142. DOI：10.1007/s11274-012-1123-1.

[20] CHANDLER M, STANLEY G A, ROGERS P, et al. A genomic approach to defining the ethanol stress response in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Annals of Microbiology, 2004, 54(4)：427-454.

[21] MARTANI F, FOSSATI T, POSTERI R, et al. Different response to acetic acid stress in Saccharomyces cerevisiae wild-type and L-ascorbic acid producing strains[J]. Yeast, 2013, 30(9)： 365-378. DOI：10.1002/ yea.2969.

[22] 孫萬儒. 酵母菌[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2007, 42(11)： 5-10. DOI：10.3969/ j.issn.0006-3193.2007.11.005.

[23] KYUNG M Y, ROSENFIELD C L, KNIPPLE D C. Ethanol tolerance in the yeast Saccharomyces cerevisiae is dependent on cellular oleic acid content[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(3)： 1499-1503. DOI：10.1128/AEM.69.3.1499-1503.2003.

[24] DINH T N, NAGAHISA K, HIRASAWA T, et al. Adaptation of Saccharomyces cerevisiae cells to high ethanol concentration and changes in fatty acid composition of membrane and cell size[J]. PLoS ONE, 2008, 3(7)： e2623. DOI：10.1371/journal.pone.0002623.

[25] TEIXEIRA M C, RAROSO L R, MIRA N P, et al. Genome-wide identif i cation of Saccharomyces cerevisiae genes required for maximal tolerance to ethanol[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(18)： 5761-5772. DOI：10.1016/j.jelechem.2003.12. 022.

[26] 邢建宇, 李春榮, 林挺花, 等. 脂肪酸對(duì)釀酒酵母乙醇耐受性的影響[J]. 食品研究與開發(fā), 2009, 30(6)： 33-35. DOI：10.3969/ j.issn.1005-6521.2009.06.011.

[27] 王川, 羅惠波, 黃丹. 脂肪酸對(duì)釀酒酵母酒精耐性的影響[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(19)： 190-193. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201519034.

[28] COMITINI F, de INGENIIS J, PEPE L, et al. Pichia anomala and Kluyveromyces wickerhamii killer toxins as new tools against Dekkera/ Brettanomuces spoilage yeasts[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 241(1)： 235-240. DOI：10.1016/j.femsle.2004.07.040.

[29] EDWARDS C G, BEELMAN R B, BARTLEY C E, et al. Production of decanoic and other volatile compounds and the growth of yeast and malolactic bacteria during vinification[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1990, 41(1)： 48-56.

Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Pichia fabianii in a Mixed Culture

BAI Mengyang, WU Zufang*, LI Ruoyun, WENG Peifang, ZHANG Xin
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In order to investigate the changes in the growth state of different yeast species in a mixed culture and the factors affecting their interaction, the effects of initial glucose concentration, pH, and ethanol concentration on the growth of Saccharomyces cerevisiae (Sc) and Pichia fabianii (Pf) when cultured together were investigated, and the differences in the fatty acid composition of both yeasts were also determined by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that Pf had an obvious inhibitory effect on the growth of Sc during their co-culture under normal conditions. At relatively low sugar concentration and low pH, the growth of Sc was more restrained. At an initial glucose concentration of 2%, the Pf/Sc ratio（the ratio of colony numbers) was 28, and the value was 37 at pH 3.5. With increasing concentration of exogenous ethanol, the growth of Pf was more restrained than that of Sc, and Sc became dominant, suggesting it to be more resistant to ethanol than Pf. The Pf/Sc ratio was 0.5 under 12% ethanol stress. The fatty acid composition of Sc mainly consisted of palmitic acid and palmitoleic acid while that of Pf mainly consisted of oleic acid, linoleic acid and linolenic acid. In the mixed culture, the fatty acid composition was dominated by C18fatty acids, and the linoleic acid and linolenic acid produced by Pf could inhibit the growth of Sc. These results could provide a basis for further research on the interaction of different yeasts in the mixed culture at the transcriptome level and the quality control of fermented products.

mixed culture; initial glucose concentration; pH; ethanol; fatty acid

10.7506/spkx1002-6630-201712002

TS261.1

A

1002-6630（2017）12-0009-06

白夢(mèng)洋, 吳祖芳, 李若云, 等. 混合培養(yǎng)條件下釀酒酵母菌與畢赤酵母菌的相互影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 9-14.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201712002. http：//www.spkx.net.cn

BAI Mengyang, WU Zufang, LI Ruoyun, et al. Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Pichia fabianii in a mixed culture[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 9-14. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201712002. http：// www.spkx.net.cn

2016-09-13

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471709）

白夢(mèng)洋（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：mengyang_bai@qq.com

*通信作者：吳祖芳（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wzfwpf@163.com