許甘霏+王晶晶+吳大強+官妍

[摘要] 細菌的群體感應及特異基因表達調控在細菌生物被膜形成中有十分重要的作用。luxS，agr均是表皮葡萄球菌群體感應調控中的關鍵基因，RNAⅢ是agr系統(tǒng)的效應器分子。為了評估魚腥草素鈉及其與紅霉素聯(lián)用對產膜表皮葡萄球菌轉錄水平的影響，采用連續(xù)稀釋法測定魚腥草素鈉、紅霉素、萬古霉素對表皮葡萄球菌的MIC；熒光定量PCR測定魚腥草素鈉及其與紅霉素聯(lián)用、萬古霉素、紅霉素等對表皮葡萄球菌作用后不同時間段luxS，agr/RNAⅢ的轉錄水平。結果表明1/2MIC，1/4MIC魚腥草素鈉，1/2MIC魚腥草素鈉+1/2MIC紅霉素，1/4MIC魚腥草素鈉+1/4MIC紅霉素，1/8MIC魚腥草素鈉+1/8MIC紅霉素等在作用于ATCC 35984伊始，就可迅速上調luxS 的表達，與陰性對照相比，存在顯著差異（P<0.05）；在作用6，12，48 h后，魚腥草素鈉依然存在對luxS的上調作用。魚腥草素鈉在MIC，1/2MIC濃度時對agr表達均有顯著下調作用（P<0.05），1/2MIC魚腥草素鈉與1/2MIC紅霉素聯(lián)用、1/4 MIC魚腥草素鈉與1/4MIC紅霉素聯(lián)用，在作用6，12，24 h等時間段對agr表達的下調作用也很顯著（P<0.05）。魚腥草素鈉在MIC濃度時，對RNAⅢ表達亦有顯著下調作用（P<0.05），1/2MIC魚腥草素鈉與1/2MIC紅霉素聯(lián)用對RNAⅢ表達的下調效果也很顯著（P<0.05）。提示魚腥草素鈉及其與紅霉素聯(lián)用，可以迅速上調表皮葡萄球菌luxS轉錄水平的表達，在特定濃度下可下調agr/RNAⅢ的表達，具有抑制表皮葡萄球菌生物被膜菌之間的相互黏附聚集、抑制膜內營養(yǎng)和輸水通道的形成、阻止膜內細菌脫離、并抑制細菌外毒素形成等作用的可能。

[關鍵詞] 表皮葡萄球菌；魚腥草素鈉；紅霉素；群體感應；luxS；agr/RNAⅢ；生物被膜

[Abstract] Quorum sensing of bacteria and its specific gene expression regulation have a very important role in bacterial biofilm formation. LuxS and agr are the key regulatory genes in quorum sensing of Staphylococcus epidermidis，and RNA Ⅲ is the effector molecule of agr system. In order to evaluate the effects of sodium houttuyfonate in combination with erythromycin on the transcription level of S. epidermidis，serial dilution method was used to determine the MIC of sodium houttuyfonate，erythromycin and vancomycin on S. epidermidis，and fluorescent quantitative PCR method was used to detect the transcription levels of luxS，agr/RNAⅢ in different time periods after treatment on S. epidermidis by sodium houttuyfonate in combination with erythromycin，vancomycin，and erythromycin alone. Our results showed that in treatment by 1/2MIC，1/4MIC sodium houttuyfonate，1/2MIC sodium houttuyfonate +1/2MIC erythromycin， 1/4MIC sodium houttuyfonate+1/4MIC erythromycin，and 1/8MIC sodium houttuyfonate+1/8MIC erythromycin for ATCC 35984，they could rapidly up-regulate the expression of luxS of S. epidermidis from the beginning as compared with negative control，with significant differences （P<0.05）；furthermore，sodium houttuyfonate can still up-regulate the expression of luxS even after treatment for 6，12 and 48 h. Sodium houttuyfonate in MIC and 1/2MIC concentration can significantly down-regulate the expression of agr （P<0.05）；1/2MIC sodium houttuyfonate+1/2MIC erythromycin，1/4MIC sodium houttuyfonate+1/4MIC erythromycin，can also significantly down-regulate the expression of agr in 6 h，12 h and 24 h（P<0.05）. Sodium houttuyfonate in MIC，can significantly down-regulate the expression of RNA Ⅲ （P<0.05），and 1/2MIC sodium houttuyfonate+1/2MIC erythromycin can also significantly down-regulate the expression of RNAⅢ（P<0.05）. Therefore，our presented results showed that sodium houttuyfonate in combination with erythromycin can rapidly up-regulate the transcription of luxS of S. epidermidis，and can down-regulate the expression of agr/RNA Ⅲ in certain concentrations，and suggested that sodium houttuyfonate in combination of erythromycin could inhibit mutual aggregation between S. epidermidis and biofilm bacteria，inhibit membrane nutrition and formation of water transport channels，prevent separation of bacterial cells in biofilm，and inhibit the formation of bacterial exotoxin of S. epidermidis.

[Key words] Staphylococus epidermidis；sodium houttuyfonate；erythromycin；quorum sensing；luxS；agr/RNAⅢ；biofilm

以表皮葡萄球菌Staphylococus epidermidis（Se）為代表的凝固酶陰性的葡萄球菌是臨床導致以生物材料為中心感染的主要致病菌之一，在假體植入、手術縫合部位、心臟瓣膜置換、留置導管、靜脈中心導管等醫(yī)源性感染灶中檢出率較高。表皮葡萄球菌能否形成生物被膜（biofilm），是目前用來評價其是否具有致病性的最重要的指標[1]。細菌生物被膜是指細菌黏附于惰性或活性實體表面，被自身分泌的胞外黏質物所包裹，具有高度組織化的多細胞細菌群體結構[2]。在難治性感染病灶中，幾乎都存在細菌生物被膜感染源。生物被膜結構受諸多因素影響，有很復雜的調節(jié)機制，如基因調控、生長的環(huán)境條件等。

群體感應（quorum sensing，QS）是指細菌通過自身產生的自誘導因子，去感知周圍同類細菌的密度或多寡并調控基因表達的系統(tǒng)[3]。自Davies等發(fā)現(xiàn)[4] 細菌的QS及特異基因表達調控在細菌生物被膜形成中有著十分重要的作用以來，干擾QS系統(tǒng)已成為研究新型抗菌藥的新方向，在新的抗感染治療發(fā)展中，是一種有吸引力的靶位點。葡萄球菌具有獨特和完善的QS系統(tǒng)，Xu等[5]通過構建和分析表皮葡萄球菌△luxS突變株，證實了luxS（luciferase，熒光素酶）通過AI-2（autoinducer-2，自誘導物-2）的細胞間信號轉導，下調ica操縱子，影響PIA（polysaccharide intercellular adhesion，多糖胞間黏附素）的產生，因而抑制了表皮葡萄球菌生物被膜的形成；agr（accessory gene regulator，附屬基因調節(jié)子）亦是表皮葡萄球菌QS調控中的關鍵基因[6]，RNAⅢ是agr系統(tǒng)的效應器分子。

由于在感染灶的細菌一旦形成生物被膜，不僅引發(fā)難以治療的感染，還易產生多重耐藥。因此，如何有效治療由生物被膜引起的相關感染，已成為臨床抗感染研究的重要課題。從中國傳統(tǒng)中藥中尋求有效抗生物被膜菌的相關藥物，研究中西藥聯(lián)用，以達到藥物減量增效、降低毒副作用等措施，目前被認為都是可行的途徑。

作者以往的研究[7]已證實，亞抑菌濃度的魚腥草素鈉及其與紅霉素聯(lián)用對表皮葡萄球菌生物被膜形成有顯著影響，對表皮葡萄球菌黏附和代謝均有抑制作用，因而選擇魚腥草素鈉及其與紅霉素聯(lián)用，在不同時間段觀察藥物對懸浮狀態(tài)下的產膜表皮葡萄球菌luxS，agr/RNAⅢ 轉錄水平的影響，以期從分子水平評估魚腥草素鈉及其與紅霉素聯(lián)用抗表皮葡萄球菌感染的效果，為中藥及中西藥聯(lián)用治療表皮葡萄球菌引起的相關感染，提供研究依據和實踐參考。

1 材料

1.1 菌株與培養(yǎng)基

ATCC 35984（表皮葡萄球菌產膜標準菌株，復旦大學上海醫(yī)學院瞿滌教授饋贈）；TSB培養(yǎng)基（胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司）；MH液體培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）。

1.2 藥品與試劑

萬古霉素標準品、魚腥草素鈉標準品、紅霉素標準品（中國食品藥品檢定研究院）；二甲基亞砜（天津市光復精細化工研究所）；SYBR GreenⅠRT-PCR試劑盒（寶生物工程有限公司）；SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（寶生物工程有限公司）；其余所用試劑均為國產分析純。

1.3 儀器

紫外-可見分光光度計（上海龍尼科儀器有限公司）；PCR儀（Eppendorf）；凝膠成像系統(tǒng) Tanon-1600（Tanon）；核酸電泳系統(tǒng)（Bio-Rad）；高速冷凍離心機（日立公司）；qRT-PCR儀（QuantStudio TM 6 Flex美國賽默飛世爾）：恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.4 引物合成

根據NCBI中 ATCC 35984 gryB和luxS，agr，RNAⅢ的序列設計、合成的擴增引物序列見表1。

2 方法

2.1 魚腥草素鈉、萬古霉素、紅霉素對產膜表皮葡萄球菌MIC的測定

用MH液體培養(yǎng)基，以連續(xù)稀釋法使每支試管2 mL培養(yǎng)基中藥物的終濃度分別為128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25 mg·L^-1，向各試管中加入200 μL 0.5 Mc菌液；另設空白對照（不含藥物和菌液的培養(yǎng)基），陰性對照（只含有菌液而不添加藥物的培養(yǎng)基），每組設置2個平行。37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h，分光光度計法測A₆₀₀，與空白對照比較得藥物的MIC。

2.2 藥物對懸浮狀態(tài)下產膜表皮葡萄球菌的作用

2.2.1 菌細胞制備 取2 mL 0.5 Mc菌液，按1%的接種量接種于200 mL TSB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，150 r·min^-1條件下培養(yǎng)；分光光度計測A₆₀₀達到1.6時，8 000 r·min^-1，4 ℃離心30 min，棄上清；分別用新鮮的TSB培養(yǎng)基200 mL重懸細胞。

2.2.2 藥物處理 不添加藥物（陰性對照），MIC萬古霉素（陽性藥對照），1/2MIC萬古霉素（陽性藥對照），MIC紅霉素，1/2MIC紅霉素，1/4MIC紅霉素，MIC魚腥草素鈉，1/2MIC魚腥草素鈉，1/4MIC魚腥草素鈉，1/2MIC魚腥草素鈉+1/2MIC紅霉素，1/4MIC魚腥草素鈉+1/4MIC紅霉素，1/8MIC魚腥草素鈉+1/8MIC紅霉素。

2.2.3 藥物處理后菌細胞的保存 陰性對照及加入藥物的各組菌液，繼續(xù)于37 ℃，150 r·min^-1培養(yǎng)；在1，6，12，24，48 h分別取樣10 mL于10 mL Ep管（DEPC水處理并滅菌）中，12 000 r·min^-1，4 ℃離心8 min，棄上清，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?

2.3 表皮葡萄球菌RNA抽提

取凍存于-70 ℃的菌體，加液氮研磨菌體至粉末狀；加入350 μL裂解液RL，渦旋振蕩30 s，12 000 r·min^-1，4 ℃離心5 min；取上清加入250 μL無水乙醇，轉入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12 000 r·min^-1，4 ℃離心1 min；向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12 000 r·min^-1，4 ℃離心1 min，棄廢液；再向吸附柱CR3中央加入80 μL DNaseⅠ工作液，放置10 min；加入350 μL去蛋白液RW1，12 000 r·min^-1，4 ℃離心1 min；加入500 μL漂洗液RW，放置2 min，12 000 r·min^-1，4 ℃離心1 min（重復該步驟1次），棄廢液。吸附柱放置5 min，徹底晾干吸附柱材料中殘余的漂洗液；將吸附柱CR3轉入一個新的RNase-Free離心管中，向吸附膜中央懸空滴加40 μL RNase-Free ddH₂O，放置2 min，12 000 r·min^-1，4 ℃離心2 min，得到RNA溶液。-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 目的基因表達的測定

采用熒光定量PCR檢測產膜表皮葡萄球菌ATCC 35984 的luxS，agr，RNAⅢ轉錄水平。

2.4.1 將RNA逆轉錄為DNA 去除基因組DNA反應：按SYBR GreenⅠRT-PCR試劑盒說明書操作。反應體系均為10 μL，包括：5×gDNA Eraser 緩沖液2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 小于1 μg，剩余用RNase Free dH₂O補至10 μL。反應條件為42 ℃反應2 min。

逆轉錄反應：逆轉錄反應體系均為20 μL，包括：上一步驟的反應液10 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1 μL，RT Primer Mix 4 μL，5×PrimeScript buffer 2（for Real time） 4 μL，RNase Free dH₂O 1 μL。反應條件為37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s。反應產物均為cDNA。

2.4.2 熒光定量PCR檢測表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株luxS，agr，RNAⅢ轉錄水平 分別用反轉錄獲得的cDNA作為模板，進行熒光定量PCR以檢測內參基因gryB和目的基因luxS，agr，RNAⅢ的轉錄水平。每樣本做3復孔，同時設置陰性對照。按照SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNase H Plus）試劑盒說明書操作，引物參照表1并配制成10 μmol·L^-1。反應體系為20 μL，包括：SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，10 μmol·L^-1引物（正向、反向）各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，RT反應液（cDNA溶液）2 μL，dH₂O（滅菌蒸餾水）6 μL。實時熒光定量PCR擴增儀QuantStudio TM 6 Flex進行檢測。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環(huán)，60 ℃收集熒光信號。最后做融解曲線分析，確定反應產物的單一性。

2.5 數據分析

2.5.1 qRT-PCR結果計算 自動調節(jié)基線（base line）至適宜處，各擴增曲線與閾值線的交叉點對應的橫坐標即為Ct值，根據標準曲線上濃度與Ct值的對應關系，可求出各待測標本的初始濃度。以gryB作內參基因，luxS/gryB，agr/gryB，RNAⅢ/gryB作為衡量luxS，agr，RNAⅢ轉錄水平的指標。

2.5.2 統(tǒng)計學分析 將設置的每個時間段未經藥物處理的ATCC 35984 luxS，agr，RNAⅢ 的表達量作為“1”，計算出相對量，再用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩樣本之間進行t檢驗，數據以±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 魚腥草素鈉、紅霉素、萬古霉素對產膜表皮葡萄球菌MIC的結果

魚腥草素鈉對ATCC 35984 MIC為64 mg·L^-1，萬古霉素對ATCC 35984 MIC為8 mg·L^-1，紅霉素對ATCC 35984 MIC為8 mg·L^-1。

3.2 藥物干預后目的基因表達的結果

3.2.1 藥物對luxS表達的影響 1/2MIC，1/4MIC魚腥草素鈉，1/2MIC魚腥草素鈉+1/2MIC紅霉素，1/4MIC魚腥草素鈉+1/4MIC紅霉素，1/8MIC魚腥草素鈉+1/8MIC紅霉素等在作用于ATCC 35984伊始，就可迅速上調luxS的表達，與陰性對照相比，存在顯著差異（P<0.05）；在作用6，12，48 h后，魚腥草素鈉依然存在對luxS的上調作用，見圖1。

3.2.2 藥物對agr表達的影響 MIC，1/2MIC的魚腥草素鈉在作用的各時間段對agr表達均有顯著下調作用（P<0.05），見圖2；1/2MIC魚腥草素鈉與1/2MIC紅霉素聯(lián)用、1/4 MIC魚腥草素鈉與1/4MIC紅霉素聯(lián)用，在作用6，12，24 h等時間段，對agr表達的下調作用也很顯著（P<0.05），見圖2。

3.2.3 藥物對RNAⅢ表達的影響 MIC的魚腥草素鈉在作用的各時間段對RNAⅢ表達亦有顯著下調作用（P<0.05），見圖3；1/2MIC魚腥草素鈉與1/2MIC紅霉素聯(lián)用對RNAⅢ表達的下調效果也很顯著（P<0.05），見圖3。

4 討論

表皮葡萄球菌生物被膜的形成是個動態(tài)過程。首先是由菌體表面疏水性蛋白或多糖黏附素對生物材料的初始附著，形成細菌群落；隨后細菌相互聚集，形成生物被膜[8]。其中，PIA是細菌生物被膜形成的聚集階段所必需的物質[9]。Ica基因座編碼PIA，由icaA，icaD，icaB，icaC 4種基因組成，形成操縱子icaADBC；其中，icaA在PIA的形成中起決定作用。

luxS在多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌中均高度保守，這些微生物能夠產生類似的AI-2信號分子，因此AI-2分子被認為是各種細菌進行中間交流的通用語言，luxS為AI-2形成的標志基因。Xu等[5]通過構建和分析△luxS突變株，研究了表皮葡萄球菌中的luxS/AI-2感應系統(tǒng)的活性；模型證實luxS通過AI-2的細胞間信號轉導下調ica操縱子，因而影響了PIA的產生，減少了細菌間黏附聚集，抑制生物被膜的形成，并減弱了它在動物體內的致病力。

生物被膜并不是細菌經常性的生活方式，生物被膜成熟后，膜內的細菌還會從膜內分散出來形成新的感染灶。細菌從生物被膜上的分離，是導致疾病擴散的生理基礎之一。目前已知的與細菌分散有關的因素包括：QS系統(tǒng)、表面活性劑、基質降解酶等；在葡萄球菌中，分散的機制是通過agr系統(tǒng)來調控的。葡萄球菌的致病能力和所致感染的嚴重程度還與其產生的毒素有關。葡萄球菌的agr亦是最重要的毒力因子調節(jié)系統(tǒng)，負責對毒力因子生長階段進行依賴性調節(jié)[10]；RNAⅢ是agr系統(tǒng)的效應器分子。RNAⅢ可編碼δ-毒素，δ-毒素具有去垢劑樣作用，可以幫助生物被膜形成輸水及營養(yǎng)通道，并可使生物被膜基質降解，有助于生物被膜中的細菌脫離等[11]；也有學者研究表明，RNAⅢ還可以上調細胞外毒性因子的產生和下調細胞壁表面相關蛋白的轉錄，促進外毒素的產生[12]。

針對生物被膜形成過程的治療方法包括阻止細菌起始黏附及細菌間相互黏附；阻斷QS機制所需的生物被膜組件基因的表達；抑制組成生物被膜基質多聚糖和胞外蛋白的生物合成；降解生物被膜基質所需酶類等[13]。目前，臨床抗葡萄球菌感染常使用的抗生素以紅霉素、環(huán)丙沙星為代表，但臨床耐藥性的問題還很突出；萬古霉素作為抗葡萄球菌有效的藥物，但臨床對其中度耐藥的表皮葡萄球菌也逐漸增多[14]。因此，尋求有效抗生物被膜菌的藥物，研究中西藥聯(lián)用以達到藥物減量增效、降低毒副作用等措施，已日益得到人們的重視。

魚腥草，性寒味辛，具有清熱解毒、行水消腫、祛瘀生新之功效，入肝肺二經。體外試驗已證明，魚腥草煎劑對多種革蘭陽性菌、革蘭陰性菌均有不同程度的抑制作用。魚腥草中抗致病微生物的主要成分是揮發(fā)油，揮發(fā)油中主要為癸酰乙醛。癸酰乙醛已能人工合成，被稱為魚腥草素，但該種物質性質不穩(wěn)定，而其亞硫酸氫鈉加成物（魚腥草素鈉），則性質穩(wěn)定而又保留其抗菌活性。

基于以往的研究[7]，發(fā)現(xiàn)包括亞抑菌濃度在內的魚腥草素鈉及與紅霉素聯(lián)用，對ATCC 35984的初始黏附及在生物被膜內的代謝均有明顯的抑制作用，并干預了生物被膜的形成。本實驗在不同時間段（時間段的設置主要參考表皮葡萄球菌生物被膜形成的一般規(guī)律[15]；0～4 h完成初始黏附，6 h黏附的細菌開始相互聚集，24 h生物被膜基本成熟，30～48 h部分生物被膜開始崩解），觀察各藥物對懸浮狀態(tài)下的產膜表皮葡萄球菌luxS，agr，RNAⅢ的轉錄水平的影響；結果顯示魚腥草素鈉及其與紅霉素聯(lián)用可以迅速上調luxS的表達，效果并不弱于萬古霉素、紅霉素等抗生素，從藥物作用的持久性來看，魚腥草素鈉的效果甚至優(yōu)于抗生素，提示魚腥草素鈉及與紅霉素聯(lián)用可調控luxS，因此具有抑制表皮葡萄球菌生物被膜的形成，并減弱其致病力的可能。魚腥草素鈉與紅霉素聯(lián)用在作用初期對luxS的上調作用尤為明顯，但作用持續(xù)時間較短，具體原因尚不清楚。

魚腥草素鈉在MIC，1/2MIC濃度時，對agr表達均有顯著下調作用（圖2）；1/2MIC魚腥草素鈉與1/2MIC紅霉素聯(lián)用、1/4 MIC魚腥草素鈉與1/4MIC紅霉素聯(lián)用，在作用6，12，24 h等時間段，對agr表達的下調作用也很顯著。同樣，也發(fā)現(xiàn)魚腥草素鈉在MIC濃度時，對RNAⅢ表達亦有顯著下調作用；1/2MIC魚腥草素鈉與1/2MIC紅霉素聯(lián)用對RNAⅢ表達的下調效果也很顯著；提示魚腥草素鈉及與紅霉素聯(lián)用，在特定濃度下，可顯著下調agr，RNAⅢ的表達；因此，就具有抑制表皮葡萄球菌生物被膜內營養(yǎng)和輸水通道的形成、阻止生物被膜基質降解和生物被膜內細菌脫離分散、并抑制細菌外毒素形成等作用的可能。

luxS，agr均是表皮葡萄球菌QS系統(tǒng)的關鍵基因；由于細菌的QS系統(tǒng)是調控非細菌生存所必須的基因，以其作為藥物靶標不會對細菌生存產生較大壓力，因此不易使細菌產生耐藥性[16]，從而對篩選抗表皮葡萄球菌藥物靶標有著重要指導意義。RNAⅢ分子是調控葡萄球菌毒力表達的關鍵分子，通過體外實驗研究已證實[17-18]，RNAⅢ抑制肽可以有效抑制金黃色葡萄球菌腸毒素和溶血素的產生，可以抑制表皮葡萄球菌對關節(jié)假體材料表面的黏附。本研究亦證實了特定濃度的魚腥草素鈉及與紅霉素聯(lián)用對luxS的上調和對agr，RNAⅢ的下調作用，為評估魚腥草素鈉及與紅霉素聯(lián)用成為抗表皮葡萄球菌生物被膜感染藥物，提供新思路及實踐依據，也可為臨床用藥提供參考。但細菌的QS系統(tǒng)畢竟是很復雜的調控系統(tǒng)，許多機制尚未被完全了解，并且作者發(fā)現(xiàn)藥物在對luxS，agr，RNAⅢ等調控隨藥物濃度的變化而改變，其規(guī)律需在以后實驗中進一步探究。另外，本實驗是以強產膜標準株ATCC 35984為實驗對象，今后還應擴大對臨床株樣本的實驗，以使結果更加客觀、可信。

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[責任編輯 張寧寧]