張愛華+馬文麗+雷鋒杰+安寧波+張欣欣+劉志慶+張連學(xué)

[摘要] 該實驗采用平板對峙培養(yǎng)法和孢子懸滴萌發(fā)法探討了人參黑斑菌對精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸以及蘇氨酸在不同條件下化學(xué)趨向性響應(yīng)。結(jié)果顯示，人參黑斑菌對4種氨基酸化學(xué)趨向性響應(yīng)的最優(yōu)培養(yǎng)溫度均為25 ℃，不同質(zhì)量濃度和pH的培養(yǎng)條件下人參黑斑菌對4種氨基酸化學(xué)趨向性響應(yīng)有所差異，其中精氨酸、谷氨酸及蘇氨酸在質(zhì)量濃度為2 mg·L^-1，pH 7，天冬氨酸在20 mg·L^-1，pH 6時，化學(xué)趨向性均達到最強，其趨化率分別為1.24，1.38，1.27，1.31；生長速率分別為0.451 0，0.353 0，0.381 3，0.228 8；孢子萌發(fā)率分別為57.33%，63%，56.67%，58%；菌絲干重分別為372.9，348.5，314.4，390.2 mg·L^-1。氨基酸作為人參根系分泌物中的重要物質(zhì)對人參黑斑病菌表現(xiàn)出了高效的趨化性效應(yīng)，有的甚至出現(xiàn)了高濃度抑制的現(xiàn)象。

[關(guān)鍵詞] 人參黑斑病菌；根系分泌物；氨基酸；化學(xué)趨向性

[Abstract] Plate assay and spore germination method were used to study the chemotaxis response of Alternaria panax to arginine，glutamic acid，aspartic acid and threonine. The result showed that the optimum temperature of A. panax chemotaxis response to four amino acids were all 25 ℃. And chemotaxis responses of A. panax were different under conditions of different concentration and pH value. The chemotaxin reached to the highest under the condition of 2 mg·L^-1 and pH value was 7 for arginine，glutamic acid and threonine while 20 mg·L^-1 and pH value was 6 for aspartic acid . The data of chemotactic migration index （CMI） were 1.24，1.38，1.27，1.31 and chemotactic growth rates（CGR） were 0.451 0，0.353 0，0.381 3，0.228 8 and spores germination rates（SGR） were 57.33%，63%，56.67%，58% and the dry weight of mycelial （DWM） were 372.9，348.5，314.4，390.2 mg·L^-1 respectively. It indicated that the low and middle concentration of amino acid had significant promoting effect on chemotaxis response of A. panax. As important substances generated in ginseng root，amino acids exhibited an efficient chemotactic effect on A. panax，and some even show inhibition effect under high concentration .

[Key words] Alternaria panax；root exudates；amino acid；chemotaxis

人參Panax ginseng C.A.Mey.為五加科草本植物，享有“百草之王”的美譽。長期以來，由于原始生態(tài)環(huán)境的改變以及不斷的過度采挖致使我國野生人參資源匱乏。近年，我國人參栽培產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，人工栽培面積逐年擴大，栽培種類繁，但由于生長環(huán)境的改變以及人參病害的發(fā)生和流行導(dǎo)致人參產(chǎn)量大幅度下降，其中人參黑斑病菌是發(fā)生最普遍，危害最嚴重[1]，更是人參規(guī)范化生產(chǎn)的重要病害。根系分泌物是植物在生長的過程當中產(chǎn)生的并經(jīng)根的不同部位向外界環(huán)境分泌的物質(zhì)[2]，此類物質(zhì)作為趨化基質(zhì)在植物與真菌之間起著調(diào)節(jié)作用[3-4]，而這一趨化性運動是病原真菌對不同趨化物質(zhì)濃度、溫度、pH做出的反應(yīng)，使趨向有益刺激，逃避有害刺激[5-6]，并且與植物的生長有很密切的關(guān)系。張愛華、匙坤等通過研究人參根系分泌物中的人參皂苷對人參幾種病原菌的趨化作用，發(fā)現(xiàn)人參皂苷可作為趨化因子在人參和微生物種群之間起調(diào)控作用[7-9]。除此之外，據(jù)有關(guān)報道，其他很多種微生物對植物的根系分泌物也同樣具有趨化作用[10]。近年來，氨基酸作為一類重要的趨化物質(zhì)備受關(guān)注[11]?；羲嚨さ葓蟮懒巳藚⒌?6種氨基酸含量中精氨酸含量最高，其次為谷氨酸和天冬氨酸，蛋氨酸含量最低[12]。而前期實驗室在水相及正丁醇相人參根系分泌物中均檢測到了氨基酸成分，其中包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等15種氨基酸，這一成果為本實驗提供理論依據(jù)。迄今為止，有關(guān)人參根系分泌物產(chǎn)生的氨基酸對人參病原真菌的研究還鮮有報道，本實驗采用外源性氨基酸探索氨基酸對人參黑斑病菌的化學(xué)趨向性作用。這一實驗研究旨在為以后防治人參黑斑病菌提供參考。

1 材料

人參黑斑病菌Alternaria panax Whetz.由吉林省人參工程技術(shù)研究中心提供，并經(jīng)過吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)高潔教授鑒定確認。精氨酸（BR，純度99%）、谷氨酸（BR，99%）、天冬氨酸（BR，99%）及蘇氨酸（BR，99%）。孟加拉紅培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基及氨基酸種類的選擇

為了更清晰地觀察到菌絲生長的情況所以選擇孟加拉紅培養(yǎng)基進行趨化性實驗；而對于氨基酸的選擇是依據(jù)文獻確定此4種氨基酸在人參中的含量相對較高，且在人參根系分泌物中檢測到這些氨基酸。以無菌水為對照組來進行實驗。

2.2 菌液的制備

刮取適量人參黑斑病菌菌絲加入到裝有10 mL無菌水的EP管中（在無菌操作環(huán)境中進行），在漩渦混合器將其混勻，用血球計數(shù)板計算孢子濃度，最終得到濃度為1×10⁶ CFU·mL^-1的孢子懸浮液，待用。

2.3 不同氨基酸趨化液的制備

用滅菌后的蒸餾水分別配制精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及蘇氨酸，使其分別的濃度依次為0.2，2，20，200 mg·L^-1的趨化液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，待用。

2.4 化學(xué)趨向性試驗

根據(jù)匙坤等的方法[7]，在孟加拉紅固體培養(yǎng)基上依次等距離打3個孔，分別記為 A，B，C，每孔的間距為20 mm，兩孔之間用滅菌濾紙條連接，然后用移液槍吸取30 μL孢子懸浮液加到B孔中，吸取50 μL趨化液和無菌水分別加入到A，C孔中，每個處理5次，見圖1。

2.4.1 人參黑斑病菌化學(xué)趨向性最適培養(yǎng)條件的選擇

2.4.1.1 濃度對黑斑病菌化學(xué)趨向性的影響 將4種不同趨化物質(zhì)分別按2.3項配制成一定濃度梯度的趨化液，進行化學(xué)趨向性實驗，黑暗條件下培養(yǎng) 5 d。

2.4.1.2 溫度對黑斑病菌化學(xué)趨向性的影響 將質(zhì)量濃度為2 mg·L^-1的精氨酸，谷氨酸，蘇氨酸及質(zhì)量濃度為20 mg·L^-1趨化液分別置于15，20，25，30 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)5 d。

2.4.1.3 pH對黑斑病菌化學(xué)趨向性的影響 將趨化液的pH分別配制成5，6，7，8，進行化學(xué)趨向性實驗，將人參黑斑病菌置于 25 ℃ 、 黑暗條件下培養(yǎng) 5 d。

2.4.2 最優(yōu)趨化參數(shù)條件下測定指標

2.4.2.1 病原菌絲趨化移動指數(shù)（chemotactic migration index，CMI） 移動距離標準為大多數(shù)菌絲移動的最前端為測定標準，菌絲從B向A移動的距離為a，向C移動的距離為b。計算公式CMI=a/b。當 a/b>1時，趨化物質(zhì)對測定病原微生物有促進作用；當a/b<1時，則有抑制作用；當 a/b=1時，無趨化作用。

2.4.2.2 病原菌絲趨化生長速率 （chemotactic growth rate，CGR） 采用固體培養(yǎng)基法[13]，依次測定第2，3，4，5天共4 d的菌絲生長情況，計算公式CGR=（a-b）/d （d為培養(yǎng)天數(shù)）。

2.4.2.3 病原菌孢子萌發(fā)率 （spore germination rate，SGR） 參考李勇等[14]的孢子萌發(fā)懸滴法，在雙凹載玻片的左右凹槽內(nèi)分別滴加20 μL的趨化液和無菌水，載在2個凹槽內(nèi)分別滴加等體積的適量菌液，使不同處理后的菌液終濃度為1×10⁶ CFU·mL^-1，12 h后記錄10倍目鏡×40倍物鏡視野下300個孢子的萌發(fā)情況，每個處理5次，并計算孢子的萌發(fā)率。

2.4.2.4 病原菌菌絲干重（dry weight of mycelial，DWM） 參照樊慕貞的菌絲干重法[15]測定6 d人參黑斑菌在不同趨化液的條件下菌絲生長情況。

2.4.3 數(shù)據(jù)分析

采用2010版Excel對實驗數(shù)據(jù)進行處理，利用 SPSS 18.0中的單因素方差分析（One-Way ANOVA 結(jié)合LSD） 對統(tǒng)計結(jié)果進行顯著性方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 濃度不同的趨化液對人參黑斑菌的化學(xué)趨向性的影響

不同濃度的4種氨基酸分別對人參黑斑病菌表現(xiàn)出不同程度的化學(xué)趨向性。并且均隨著濃度的增加出現(xiàn)增加而后降低的現(xiàn)象，見表1。其中，人參黑斑病菌對濃度為2 mg·L^-1的精氨酸、谷氨酸、蘇氨酸及20 mg·L^-1的天冬氨酸表現(xiàn)出最強的化學(xué)趨向性（P<0.05），CMI分別為1.166 3，1.243 1，1.102 9，1.203 2。而對200 mg·L^-1的精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸均有不同程度的抑制作用。

3.2 溫度對人參黑斑病菌化學(xué)趨向性的影響

由表1可以看出，人參黑斑病菌在不同溫度條件下培養(yǎng)均表現(xiàn)出正趨化性，并且4種氨基酸都在25 ℃時候表現(xiàn)出高效的趨化性。精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和蘇氨酸的CMI分別是1.163 1，1.178 9，1.255 7，1.105 3。

3.3 pH對人參黑斑菌的化學(xué)趨向性的影響

通過對不同pH的比較顯示，4種趨化液的不同pH均表現(xiàn)出了不同程度的促進作用，其中精氨酸，谷氨酸及蘇氨酸在pH 7時，天冬氨酸在pH 6時有最大趨化性，CMI分別是1.163 7，1.236 2，1.075 1，1.178 9。

3.4 最優(yōu)趨化參數(shù)下人參黑斑病菌對不同趨化液的化學(xué)趨化性響應(yīng)

3.4.1 最優(yōu)趨化移動指數(shù)

人參黑斑病菌在溫度為25 ℃時對精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及蘇氨酸均表現(xiàn)出了高效的正向趨化作用，且對4種氨基酸之間的趨化作用差異不大，CMI分別為1.24，1.38，1.31，1.27，見圖2。

3.4.2 菌絲生長速率的測定

4種不同趨化液在最優(yōu)參數(shù)下對人參黑斑病菌菌絲生長速率有很強的促進作用，并且在一定的培養(yǎng)時間范圍內(nèi)，菌絲的生長速率都隨培養(yǎng)時間的增加而加快，見圖3。到第5天時，有最大的測定值，CGR分別為0.534 6，0.465 0，0.436 0，0.517 3。

3.4.3 菌絲生長量的測定

4種不同趨化液在最優(yōu)參數(shù)下對人參黑斑病菌菌絲生長量有所差異，并且均顯著高于對照組，見圖4。對照組的DWM為121.7 mg·L^-1，但在精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及蘇氨酸的DWM分別為372.9，388.5，390.2，335.4 mg·L^-1。

3.4.4 孢子萌發(fā)率的測定

4種不同趨化液在最優(yōu)參數(shù)下對人參黑斑病菌的孢子萌發(fā)率均高于對照組，其中對照組的SGR為19.33%，而實驗組的SGR分別為57.33%，63%，58%，56.67%，見圖5。由此說明，氨基酸能誘導(dǎo)人參黑斑病菌的病原孢子萌發(fā)，這能有效的促進人參黑斑菌的孢子生長。

3.4.5 初生菌絲生長狀況

A到D為人參黑斑病菌在精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及蘇氨酸的趨化影響下邊緣菌絲顯微鑒定圖，見圖6。與對照組比較，在趨化液的影響下病原菌菌絲生長密集、分枝多、菌絲體較長；然而很明顯的觀察到對照組的菌絲生長緩慢菌絲體相對較短，且無明顯的延伸。

4 結(jié)論與討論

目前研究藥用植物化學(xué)趨向性作用的常用方法為生物技術(shù)，通過觀察植物或土壤微生物對物質(zhì)不同程度的反應(yīng)，來確定物質(zhì)的活性[16]。藥用植物通過根分泌多種化合物可以調(diào)節(jié)在它附近的土壤微生物的群落，改變土壤的化學(xué)和物理性質(zhì)[17]，這可能表現(xiàn)出根系啟動效應(yīng)直接影響碳和氮循環(huán)[18]。由于根系分泌物的組成范圍廣泛，因此越來越多的學(xué)者對這一領(lǐng)域進行進一步研究，鐘榮順等研究了組氨酸、精氨酸、蘇氨酸等9種氨基酸作為氮源對大豆炭疽病菌菌絲的生長情況，得出部分如蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸等氨基酸對菌絲的生長有一定的促進作用[19]。

該文集中探討人參黑斑病菌對根分泌物成分精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸及蘇氨酸的化學(xué)趨向性響應(yīng)。通過實驗得出，氨基酸作為化感因子對人參黑斑病菌起著調(diào)控作用，此類物質(zhì)不僅對人參黑斑病菌的菌絲生長有促進作用，而且對病原菌在一定參數(shù)范圍內(nèi)有促進孢子萌發(fā)的作用。人參黑斑病菌對中低濃度的不同趨化液及高濃度的蘇氨酸有著不同程度的促進作用，對高濃度的精氨酸、谷氨酸及天冬氨酸均表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，這一結(jié)果可能與不同氨基酸在人參根系分泌物中百分含量不同有關(guān)。而對高濃度的蘇氨酸對4種氨基酸都在25 ℃時有較強的趨化效果，恰巧此溫度在人參黑斑病菌菌絲生長的最適溫度內(nèi)，并且該菌對中性及偏酸性的氨基酸表現(xiàn)出更強的化學(xué)趨向性響應(yīng)，這一特點與其自身生長的pH相吻合，因此，說明病原菌菌絲的化學(xué)趨向性與其自身的生物學(xué)特性有著密不可分的關(guān)系。

本實驗對于人參黑斑病的發(fā)生流行機理揭示有一定的理論參考，對合理有效地調(diào)控根系生態(tài)環(huán)境具有指導(dǎo)意義。同時，對于該人參病害的防治能提供新的思路和方向，化學(xué)趨向性是病害發(fā)作的前提，在此階段能夠減少降低該病菌所需要的營養(yǎng)物質(zhì)及改變其最適生長環(huán)境，將在以后的田間防治方面取得事半功倍的效果。另外，為生產(chǎn)中安全，高效防治人參病菌堅持預(yù)防為主、生物防治的原則，盡可能避免化學(xué)防治造成的負面影響。該實驗只考察了病原菌對單一氨基酸的化學(xué)趨向性研究，然而對多種氨基酸的混合液是否有更強的趨化效果有待進一步研究。

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[責任編輯 呂冬梅]