包雨卓，楊 寧，蒼 晶，馮明芳，呂 巖，彭瞰看，田 宇，張 達，王軍虹，孟 婧

(東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

冬小麥東農冬麥1號在不同溫度下的代謝組學差異分析

包雨卓，楊 寧，蒼 晶，馮明芳，呂 巖，彭瞰看，田 宇，張 達，王軍虹，孟 婧

(東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

為明確東農冬麥1號耐寒越冬的生理機制，對不同溫度條件下的東農冬麥1號幼苗分蘗節(jié)進行GC-TOF/MS代謝組學檢測，并采用SIMCA軟件對獲得的代謝組學數據進行多元變量模式識別分析。結果表明，對溫度變化反應明顯的代謝產物有54個，對其進行KEGG分析發(fā)現，變化顯著的代謝通路為：精氨酸和脯氨酸代謝；甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸鹽代謝；丙酮酸代謝；糖酵解和糖異生以及肌醇磷酸鹽代謝。分析不同溫度下以上代謝通路中的差異化合物發(fā)現，室內培養(yǎng)組中，分蘗節(jié)中的γ-氨基丁酸、蔗糖-6-磷酸以及尿素等含量顯著提高，使植株保持了較高的氮素含量，揭示了較高溫度下(室內)小麥出現徒長的原因。研究結果可為進一步研究冬小麥越冬的生理特性提供新的研究思路。

東農冬麥1號；大田低溫；室內恢復；代謝組學分析

小麥是全世界種植面積最大的糧食作物之一，是全世界約40%人口的主食。我國小麥種植面積僅次于玉米和水稻。在全球極端氣候出現頻率較高的背景下，小麥凍(寒)害發(fā)生的潛在危險逐年加大[1]，因此，對其抗寒機制的研究十分重要。

代謝組學是Nicholson等[2]于1999年提出的概念，即對某一生物體組分或細胞在某一特定生理時期或條件下所有代謝產物同時進行定性和定量分析，以發(fā)現差異代謝物，進而明確某一時刻生物體組分或細胞的完整生理狀態(tài)。用于代謝組學的分析技術主要有氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、質譜(MS)、核磁共振(NMR)等[3]。根據色譜流動相的不同，可分為氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)和液相色譜-質譜聯用(LC-MS)技術。代謝組學在植物非生物脅迫方面的研究已有報道，Grimplet等[4]對釀酒葡萄的果實和種子分別在水分充足和干旱條件的代謝產物進行了組學分析；Rizhsky等[5]對植物干旱和熱脅迫下的代謝組學進行了分析；Kempa等[6]利用GC-MS和芯片技術探討了鹽芥和擬南芥對鹽脅迫時的代謝組學變化；Sung等[7]利用GC-MS、LC-MS對缺少氮、磷或鉀條件下的番茄幼苗進行了代謝組學分析，發(fā)現某些代謝反應在各個礦物質缺乏條件下有很大不同，同時還發(fā)現氮、磷或鉀缺乏時，根中棉子糖生物合成的代謝物急劇增加。

低溫環(huán)境是幼苗期東農冬麥1號的正常生長環(huán)境，本研究擬利用代謝組學技術(GC-TOF/MS)分析東農冬麥1號在不同溫度下的代謝變化，為后續(xù)深入探討其越冬期的抗寒機制提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設計

供試材料為冬小麥(Triticumaestivum)東農冬麥1號，為首例能在黑龍江省高寒地區(qū)安全越冬的冬小麥新品種，可耐受-30 ℃以下的低溫，返青率大于85%[8]。于2015年9月8日播種于黑龍江省哈爾濱市東北農業(yè)大學試驗田(45°7′N，126°6′E)，完全區(qū)組設計，小區(qū)行長150 cm,行距25 cm，每行播種150粒，播深5 cm。常規(guī)田間管理。分蘗期將部分麥苗移栽到直徑30 cm、深15 cm的花盆中，置于培養(yǎng)箱中(光暗16 h/8 h，溫度20 ℃/10 ℃)培養(yǎng)(室內培養(yǎng)組)。同時監(jiān)測室外田間溫度，當連續(xù)10 d最低溫度平均為5 ℃(白天最高溫度仍可達到15 ℃左右，冬小麥可正常生長；本課題組前期試驗證實，5 ℃是大田幼苗對于低溫適應的一個溫度節(jié)點，此時與抗寒相關的物質會開始積累)時進行樣品的采集。兩組材料隨機選取長勢一致的麥苗20株，蒸餾水洗凈并吸干水分后，將分蘗節(jié)剪成0.5 cm小段，用錫箔紙包裹后液氮速凍，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 代謝物萃取

取樣品50 mg于2 mL EP管中，加0.4 mL提取液(甲醇∶水=3∶1)，再加入20 μL核糖醇(內標)；加入鋼珠，40 Hz研磨儀(JXFSTPRP-24,上海凈信科技有限公司)處理4 min，超聲5 min(冰水浴)；4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；取0.2 mL上清液于2 mL進樣瓶(甲烷硅基化的)中。每個樣本各取9 μL，作為控制樣本。

1.2.2 代謝物衍生化

真空濃縮器干燥提取物后，加入60 μL甲氧胺鹽(甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶，20 mg·mL-1)，混勻后，放入烘箱，80 ℃孵育30 min；向每個樣品中迅速加入70 μL BSTFA(含有1% TCMS,V/V)混合物，70 ℃孵育2 h；冷卻至室溫，向混樣中加入7 μL FAMEs(飽和脂肪酸甲酯標準混合液)；混勻后檢測。

1.2.3 檢測

Agilent 7890B氣相色譜(USA)-飛行時間質譜(LECO Chroma TOF PEGASUS HT,USA)聯用儀配有Agilent DB-5MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。GC-TOF/MS具體分析條件如下：進樣量1 μL，不分流模式；載氣為氦氣(99.996%)；前進樣口吹掃流速為3 mL·min-1；柱流速為1 mL·min-1；柱溫50 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1的速率上升至300 ℃，保持14 min；前進樣口溫度280 ℃；傳輸線溫度270 ℃；離子源溫度220 ℃；電離電壓-70 eV；掃描方式50～500 m·z-1；掃描速率為20 spectra·s-1；溶劑延遲為460 s。

1.3 數據分析

采用LECO公司的Chroma TOF4.3X軟件和LECO Fiehn Rtx5數據庫進行峰提取、基線校正、峰對齊、解卷積、峰識別以及峰面積積分[9]。將缺失數據用最小值二分之一法填補，并用四分位數間距法濾除噪音數據，保留單組空值≤50%或所有組中空值≤50%的峰面積數據，用內標歸一法對過濾后的數據進行標準化處理。使用SIMCA軟件(V14)對歸一化后的數據進行多元變量模式識別分析。采用主成分分析(principal components analysis,PCA)后，進行正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，繼而對第一、第二主成分進行建模分析。模型的質量用7折交叉驗證進行檢驗，并得到相應的Q2值；通過排列試驗隨機多次(n=200)改變分類變量y的排列順序，得到相應的置換檢驗截距，對模型有效性做進一步檢驗。通過OPLS-DA分析，過濾掉不相關的正交信號，使獲得的差異性代謝物更加可靠。在京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫中進行映射，找出對應的代謝通路并計算P值。通路富集分析通過Metabo Analyst 3.0進行。用OriginPro 2015作熱圖，其他作圖用Office系列辦公軟件。

2 結果與分析

2.1 GC-TOF/MS檢測結果

通過GC-TOF/MS檢測，從冬小麥東農冬麥1號分蘗節(jié)提取物中共檢測到400多個代謝產物的峰。由圖1可看出，就代謝物種類而言，室內培養(yǎng)組的峰數量多于田間種植組。圖中6種顏色的離子流表示6次生物學重復；縱坐標表示峰強度，每個峰代表一個或多個代謝物，峰強度越高表明該物質含量越高；橫坐標為保留時間，是指物質從進樣開始到通過色譜柱后達到最大濃度時所需要的時間，時間越長表示物質從毛細管柱分離出來的時間越久。

圖1 室內培養(yǎng)(A)、田間種植(B)樣品的GC-TOF/MS檢測圖

2.2 化合物鑒定結果

整理檢測數據，根據離子峰匹配的命名條件，包括特征離子的相對分子質量、出峰時間、以及峰面積(即相對定量結果)，共得到419個非靶標的代謝產物。將儀器檢測所得峰的保留時間指數與Fiehn數據庫數值比較，如果與數據庫中的Fiehn RI(數據庫中該物質的保留時間指數)差值在±5 000以內，則認為被測峰定性為此物質是有意義的，然后再與CAS、KEGG、PubChem數據庫中的值比對，滿足了差值在±5 000間條件之后，按照數據庫中的匹配度從高到低排列，即可得到所要定性的目標代謝物。

根據以上篩選原則，共得到163個代謝產物，根據每種物質相對定量的結果，得到代謝產物相對含量的熱圖(圖2)，依據HMDB數據庫(http://www.hmdb.ca/)將得到的代謝產物分為6個組，分別為：(1)糖、糖醇、糖酸；(2)有機酸及衍生物；(3)氨基酸、肽和類似物；(4)含氮化合物；(5)核苷、核苷酸和類似物;(6)其他化合物。從圖2A可以看出，室內培養(yǎng)組樣品的大部分糖、糖醇、糖酸的含量高于田間種植組，有機酸及衍生物組分也有類似的表現。圖2B中，室內培養(yǎng)組與田間種植組相比，氨基酸含量有較大的差異，含氮化合物組中尿素和乙二胺差異較明顯，核苷，核苷酸和類似物組中胸苷和胞苷一磷酸差異較明顯，其他化合物組中含量差異也比較顯著。

2.3 數據降維處理結果

數據降維處理采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)以及置換檢驗(Permutation test)方法進行。處理結果如圖3所示。由圖3A可以看出，左上角綠色方框代表的質控樣本(Quality control)比較集中，表明儀器的穩(wěn)定性較好，檢測數據可靠，可進行后續(xù)試驗。由圖3B可以看出，室內培養(yǎng)與田間種植兩組間PCA得分差異顯著，在得分圖上相距較遠，且各組分的重復性較好，并處在95%置信區(qū)間以內。圖3C是對模型進行OPLS-DA分析的結果，從圖中可看出，在第一維預測主成分上，兩組間代謝產物的得分相差較大，表明兩個組分間的代謝產物存在較大的差異。

圖2 163個代謝產物的熱圖

模型質量用7折交叉驗證進行檢驗，得到模型的評價參數R2X、R2Y、Q2分別為0.425、1、0.949。其中，Q2接近1表明模型的可預測性較強。通過200次隨機重復試驗，得到了圖3D所示的結果，左側所有的點均低于最右側兩個相同顏色的原始點，同時，置換檢驗截距R2=0.951、Q2=-0.099 6可以很好體現模型的穩(wěn)健性。因此，本試驗建立的OPLS-DA模型可為后續(xù)的數據分析提供支持。

2.4 差異代謝物的篩選及通路富集分析

根據OPLS-DA分析過濾掉了不相關的正交信號，所以獲得的差異性代謝物更加可靠。本試驗采用 OPLS-DA 模型第一主成分的VIP(Variable importance in the projection)值(閾值>1)，結合t檢驗(t-test)的P值(閾值<0.05)，得到不同處理間差異較大的代謝產物54個(表1)。其中，糖代謝相關產物有20種，占差異物的37.0%，氨基酸代謝相關產物有8種，占差異物的14.8%。

將差異物對應的KEGG編號映射到KEGG網站中，可得到含有兩個以上差異物的代謝通路圖。采用此方法，共得到36幅代謝通路圖。為得到具有更顯著意義的代謝通路，利用通路富集分析得到了如圖4所示的富集結果，從圖4可以看出，變化較明顯的是：精氨酸和脯氨酸代謝；甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸鹽代謝；丙酮酸代謝；糖酵解和糖異生以及肌醇磷酸鹽代謝。

A：兩種樣本以及控制樣本的主成分分析總得分圖；B：兩組樣本比較的主成分分析得分圖；C：兩組樣本比較的正交偏最小二乘法-判別分析得分圖；D：兩組樣本比較建立的置換檢驗圖；a：室內培養(yǎng)組；b：田間種植組；qc：質控樣本。

A:PCA score plot of indoor culture,field planting and quality control; B:PCA score plot of indoor culture and field planting; C:OPLS-DA score plots of indoor culture and field planting; D:Permutation test result of OPLS-DA model established by the comparison between indoor culture and field planting; a:Indoor culture; b:Field planting; qc:Quality control.

圖3 數據降維處理結果

Fig.3 The result of data reduction

a:精氨酸和脯氨酸代謝；b:甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；c:丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸鹽代謝；d:丙酮酸代謝；e:糖酵解和糖異生；f:磷酸肌醇代謝。

a:Arginine and proline metabolism; b:Glycine,serine and threonine metabolism; c:Alanine,aspartate and glutamate metabolism; d:Pyruvate metabolism; e:Glycolysis and gluconeogenesis; f:Inositol phosphate metabolism.

圖4 代謝物的通路富集分析

Fig.4 Metabolite pathway enrichment analysis

2.5 差異顯著代謝物的通路分析

針對通路富集分析結果，以及代謝物相對含量的比較結果,得到了如圖5所示的代謝流程圖。左側代謝流程圖中黑色字體表示通路富集分析得到的變化量較大的代謝產物，灰色字體表示起承接作用的物質；右側為室內培養(yǎng)組(A)與田間種植組(B)代謝物比值，紅色表示室內培養(yǎng)組高于田間種植組，綠色表示相反的結果，紫色表示該物質只在室內培養(yǎng)組檢測到。綜合分析發(fā)現，與室內培養(yǎng)組相比，田間種植組中只有天冬氨酸、纈氨酸和肌醇含量高于室內培養(yǎng)組；而其他代謝產物的含量則明顯低于室內培養(yǎng)組，其中，γ-氨基丁酸(GABA)、6-磷酸蔗糖和尿素，只在室內培養(yǎng)組中檢測到，而在田間種植組中幾乎未檢出。

3 討 論

本試驗采用目前國內外比較先進的代謝組學研究方法，得到了強抗寒性品種東農冬麥1號的非靶標代謝產物400余個，得到變化較大的差異代謝產物54個，KEGG映射后得到36幅代謝通路圖，通路富集分析得到6個差異明顯的代謝通路。

表1 差異代謝物的鑒定結果

圖5 差異代謝物的循環(huán)途徑與變化倍數

大田植物的生長發(fā)育易受低溫影響，有些物種處于低溫逆境脅迫時，會通過改變蔗糖或由蔗糖衍生而來的寡糖的含量適應不利環(huán)境,可溶性糖是植物重要的滲透調節(jié)物質,蔗糖的積累可降低植物的冰點，增強細胞的保水力[10-12]。本試驗中，僅在室內培養(yǎng)組中測得蔗糖-6-磷酸，這可能因為田間種植的冬小麥幼苗在感知外界溫度降低后，將蔗糖-6-磷酸在蔗糖-6-磷酸水解酶的作用下轉化為蔗糖，以提高小麥幼苗對于低溫的適應。室內培養(yǎng)組的麥芽糖和異麥芽糖的含量高于田間種植組，這可能是低溫促進了麥芽糖和異麥芽糖向葡萄糖的轉化，磷酸化后的葡萄糖在低溫下更加活躍，一方面轉化為果糖-6-磷酸參與糖酵解反應；另一方面在肌醇-1-磷酸合成酶和堿性磷酸酶的作用下形成myo-肌醇[13-14]，而肌醇是一種在植物體內無處不在的必需成分[15]。張 夢等[16]認為植物體內肌醇代謝過程為：肌醇單體被氧化成 D-葡萄糖醛酸，最終聚合為果膠和半纖維素。本試驗結果顯示，室內培養(yǎng)組的肌醇含量明顯低于田間種植組，推測田間種植的冬小麥在平均最低溫度為5 ℃時，已經準備開始啟動抗寒相關的代謝，相對于室內培養(yǎng)組的小麥積累更多的肌醇作為信號轉導因子，將感受到的低溫在體內逐漸放大；同時積累大量的肌醇通過低溫誘導后進入氧化途徑，形成果膠和纖維素，增加細胞壁的機械強度和韌性，為即將到來的更低溫度做準備。

氨基酸是生物功能大分子蛋白質的前體和植物體中重要的氮代謝物。在外界環(huán)境脅迫下，植物組織中的游離氨基酸能直接或間接的做出相應的改變，以適應環(huán)境[17]。在游離氨基酸中，受環(huán)境影響變化較明顯的是脯氨酸(Pro)和γ-氨基丁酸(GABA)[18]。Ghoulam 等[19]研究認為，Pro是植物很好的滲透壓調節(jié)劑，但Kishor等[20]研究認為， Pro 是一種無效的滲透壓調節(jié)劑，實際上不同植物品種在遭受逆境時所表現的情況不盡相同。還有試驗表明，Pro累積可以影響許多與能量相關的代謝途徑和碳代謝，Pro合成提高了NADP+/NADPH的比值，該值的變化會影響到氧化磷酸戊糖途徑(OPPP)碳的流動，從而提供了赤蘚糖-4-磷酸，用于在脅迫條件下合成類苯丙醇或其他次級代謝物；而OPPP 的碳流量的變化可導致核苷酸的合成并促進細胞分裂[21]。高等植物中GABA代謝旁路在植物細胞響應逆境脅迫和增強植物抗逆適應性方面發(fā)揮著重要的作用[22]。GABA代謝旁路也被看作是最可能與脅迫抗性相關的代謝途徑之一，植物在正常生長條件下其體內GABA含量通常較低，其內源水平一般維持在0.03～32.50 μmol·g-1FW 范圍內，當植物受到逆境脅迫時，體內GABA會大量合成，其濃度能快速增加幾倍甚至幾十倍以上[23]。逆境(如鹽堿、干旱、冷熱脅迫以及機械損傷等)對谷氨酸脫羧酶(GAD)活性、谷氨酸脫羧酶基因的表達具有影響，可促進GABA的合成。Lancien等[24]研究發(fā)現，GABA、ABA 和乙烯等信號途徑之間存在相互作用，推測鹽脅迫時會誘導ABA增加，從而影響胞內Ca2+濃度變化來調控GAD的活性，進而誘導GABA的大量合成。對于逆境下GABA積累的另一種解釋為與腐胺降解途徑有關[25]，Dittami 等[26]證實了褐藻長囊水云在鹽脅迫下其體內 GABA 含量的增加主要是由胺降解途徑形成的，說明GABA的積累與多胺氧化降解有關，在植物抗逆生理中發(fā)揮作用。但對于逆境下GABA積累的真正作用還不是很清楚，有試驗表明植物在低氧脅迫時其體內會大量積累 GABA，同時丙氨酸(Ala)含量也顯著提高，而研究發(fā)現擬南芥的GAD突變體 gad1和GABA轉氨酶突變體 gaba-t1中，不僅GABA合成受到影響，Ala的合成也受到 gaba-t1抑制，說明GABA代謝旁路影響著低氧脅迫時Ala的代謝，也進一步說明植物在逆境條件下以 GABA為碳和氮的儲存庫[27]。在本研究中，室內培養(yǎng)組與田間種植組相比，其Pro含量增加了15.44倍，而GABA只在室內培養(yǎng)組中檢測到。田間種植組Pro的含量相對較少，推測是因為5 ℃的環(huán)境溫度是其生長過程中的正常溫度，此時東農冬麥1號剛剛啟動抗寒的響應，對于Pro的積累剛剛開始[8]，并沒有達到滲透脅迫以及作為信號轉導的濃度；而室內培養(yǎng)組由于受到相對高溫的影響，Pro的含量有所增高，從而引起OPPP的代謝循環(huán)加強，促進細胞分裂，使得室內培養(yǎng)冬小麥幼苗發(fā)生徒長。對于GABA只在室內培養(yǎng)組的出現，可能是室內溫度相對較高，使GAD活性增強，從而引起GABA含量的突然增加。試驗結果顯示Ala含量也高于田間種植組5.54倍，印證了逆境下GABA作為碳和氮的存儲庫的結論；在GABA 轉氨酶的作用下，GABA的含量增加促進了琥珀酸半醛的生成，本試驗的結果顯示琥珀酸半醛的含量相對于田間種植組高出7.03倍，在琥珀酸半醛脫氫酶的作用下，琥珀酸半醛可以生成琥珀酸，實現三羧酸反應的回補，從而促進三羧酸反應產生更多的中間產物，加速室內幼苗的生長。

依據代謝組學的分析，室內培養(yǎng)組出現徒長的原因，可能因為室內培養(yǎng)組的GABA、Urea、Pro以及其他游離氨基酸均處在一個含量較高的動態(tài)循環(huán)中，造成氮素的過多積累，從而導致室內培養(yǎng)組冬小麥幼苗徒長。

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Metabolomic Profiling of Winter Wheat Dongnongdongmai 1 Grown at Different Temperatures

BAO Yuzhuo,YANG Ning,CANG Jing,FENG Mingfang,Lü Yan,PENG Kankan,TIAN Yu,ZHANG Da,WANG Junhong,MENG Jing

(College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

To clarify the cold-resistant and cold hardening mechanism of Dongnongdongmai 1,the tillering nodes were collected from different temperature conditions for the study. The modern metabolomics research method(GC-TOF/MS) was employed to test the tillering nodes. Then the SIMCA software was used to analyze the data. The results showed that,54 metabolites which presented significant changes were detected. Significant changes of metabolic pathways were obtained through KEGG analysis,such as arginine and proline metabolism;glycine,serine and threonine metabolism;alanine,aspartate and glutamate metabolism;pyruvate metabolism;glycolysis or gluconeogenesis and inositol phosphate metabolism.As mentioned above,the γ-aminobutyric acid,sucrose-6-phosphate and urea were found to present the most significant changes in indoor culture group,which maintained the content of nitrogen at a high dynamic balance value. Therefore,these results could explain the phenomenon that the wheat at high temperature(room temperature) showed an excessive growth. In conclusion,the results of this study provided a new scientific research idea for further study of the physiological characteristics of winter wheat.

Dongnongdongmai 1; Field low temperature; Indoor recovery culture; Metabolomics analysis

時間：2017-05-12

2016-11-18

2016-12-06

國家自然科學基金項目(31471423，31601236)；國家自然科學基金人才培養(yǎng)科研訓練項目(J1210069)；黑龍江省自然科學基金項目(C201418)

E-mail：baoyuzhuo1230@163.com

蒼 晶(E-mail:cangjing2003@163.com)

S512.1；S311

A

1009-1041(2017)05-0647-09

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170512.2001.022.html