陳計芳，段江燕

(山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041000)

鹽脅迫下木炭對小麥幼苗根系蛋白表達的影響

陳計芳，段江燕

(山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041000)

為明確木炭對小麥鹽脅迫的緩解效應，以冬小麥品種臨汾6339為材料，對小麥幼苗分別進行鹽和木炭單因素處理及二者復合處理，應用蛋白質雙向電泳與質譜聯(lián)用技術對小麥根系差異表達蛋白進行了分析。結果表明，相對鹽處理，在鹽和木炭復合處理的小麥根系中共檢測到豐度變化在2倍以上的差異表達蛋白點12個。經過MALDI-TOF-TOF分析及數(shù)據(jù)庫檢索,被鑒定的12個蛋白點按其功能大致可歸為5類。其中，第Ⅰ類為與能量代謝相關的蛋白質,包括ATP合酶和ATP酶；第Ⅱ類為與糖代謝相關的蛋白質，包括磷酸甘油醛異構酶、磷酸丙糖異構酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶以及烏頭酸水合酶；第Ⅲ類為與氨基酸代謝相關的蛋白質,如半胱氨酸合成酶；第Ⅳ類為與遺傳物質有關的蛋白質,如染色體的結構蛋白；第Ⅴ類為未知功能蛋白質。

小麥；根系；鹽脅迫；木炭；蛋白表達

土壤鹽漬化影響植物正常生長發(fā)育[1]，因而一直是世界農業(yè)發(fā)展研究關注的問題。研究表明，NaCl等環(huán)境脅迫條件會使植物部分蛋白發(fā)生變性[2-7]。施用NO供體SNP[8]、稀土元素鈰[9]、赤霉素[10]等物質可緩解鹽脅迫對植株的傷害，但這些材料都普遍存在著價格貴、稀缺、難制備、不易用于生產等缺點。木炭是一種碳含量極其豐富的生物炭。它富含微孔，不但可以提高土壤有機質含量，還可以有效地保存水分和養(yǎng)料，提高土壤肥力，已廣泛應用于固碳減排、水源凈化、重金屬吸附、土壤改良等方面。有研究發(fā)現(xiàn)，生物炭對土壤鹽分表聚現(xiàn)象有顯著的影響,但影響效果與生物炭添加量密切相關。當添加量較低(不超過5%)時,抑制土壤蒸發(fā),降低土壤表層返鹽量；當添加量較大時(不小于10%),增強土壤蒸發(fā)能力,加劇表層土壤鹽堿化的程度[11]。生物炭浸提液可以提高鹽脅迫下水稻幼苗的抗氧化能力和對鹽脅迫的耐受性[12]。施用棉稈碳可有效改良新疆鹽漬化土壤的理化性質,改善土壤特性,在提高土壤質量的同時增加作物產量[13]。在回收利用的廢水污泥土壤中，加入木炭能減少溫室氣體排放，并能促進小麥生長和增產[14]。Díaz-Rojas等[5]的研究也得出同樣的結論。施用0.05%的木炭對甜椒的小孢子花粉粒胚的形成有明顯促進作用[16]。在木薯培養(yǎng)過程中，加入木炭可促進木薯的萌發(fā)和細胞的分化。然而，有關木炭對植物抗氧化酶活性、蛋白質含量及表達等方面的影響[17],目前尚未見報道。本研究擬借助蛋白質組學技術,分析在NaCl脅迫下加入木炭后小麥幼苗根部蛋白的差異表達,以期從蛋白質水平揭示木炭對小麥受到的鹽脅迫傷害的緩解效應。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試冬小麥為品系6339，種子由山西省農科院小麥研究所提供。木炭為市場上比較普遍的闊葉木炭。

1.2 試驗設計

選取飽滿、大小均一的冬小麥種子,將其用70%～75%的酒精表面消毒0.5～1.0 min后，用無菌水漂洗數(shù)次，用MilliQ水浸種24～48 h,待其露白后,腹溝朝下,均勻排列于鋪有兩層濾紙的大培養(yǎng)皿里,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天光照10 h[18]。

根據(jù)預試驗結果，將NaCl、木炭分別按照1.0%和4.0%的比例與營養(yǎng)土混勻后裝入花盆，以不加鹽和木炭為對照，共形成4個處理，即CK、NaCl、木炭及NaCl+木炭處理。待小麥長到兩葉一心時移栽到花盆中，9 d后取出小麥幼苗,剪根稱量待用。

1.3 方法

1.3.1 小麥幼苗根部總蛋白的提取與制備

尿素/硫脲法為本實驗室提取蛋白的常用方法，具體提取過程參照劉偉霞[19]的報道，但略有改善，即把提取液組分中的DTT省略掉。

1.3.2 小麥幼苗根部蛋白質的雙向電泳

第一向固相pH 梯度等電聚焦電泳(Isoelectricfocusing，IEF)：取出IPG預制膠條(7 cm,pH 3～10)，將上樣蛋白量和水化上樣液混勻。等電聚焦程序:50 V水化16 h，100 V線性除鹽1.5 h，300 V除鹽升壓1.5 h，1 000 V線性升壓30 min，3 000 V快速升壓30 min，6 000 V聚焦20 000 Vh，500 V保持。

第二向SDS-PAGE 電泳：聚焦完畢后,取出膠條,在10 mL平衡緩沖液Ⅰ(6 mol·L-1Urea、2% SDS、1.5 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.8)、20%Glycerinum、2% DTT)和10 mL平衡緩沖液Ⅱ(6 mol·L-1Urea、2%SDS、1.5 mol·L-1Tris-HCl、20%Glycerinum、2.5%Iodoacetamide)的溶脹盤里搖晃15 min。將膠條放到第二向SDS-PAGE凝膠的上表面,將凝膠轉移至電泳槽中,開始選用80 V,待觀測到蛋白樣品條帶成一條較平緩的直線后改換電壓120 V繼續(xù)電泳，等到溴酚藍指示劑的藍色出現(xiàn)在膠底部時,停止電泳。

1.3.3 考馬斯亮藍染色

電泳結束后,取出膠條轉入500 mL固定液(95%Alcoho，10.0%Glacial acetic acid.)固定30 mim后，選用考馬斯亮藍染色法(0.1%Coomassie brilliant blue R-250、95% Alcohol、10.0%Glacial acetic acid 定容至1 000 mL)染色2 h,后轉至1 000 mL脫色液(95%Alcohol、5.0%Glacial acetic acid)，期間不斷更換脫色液,直至條帶清晰可見。

1.3.4 雙向電泳圖譜分析

將已染色的凝膠用掃描儀進行掃描,并使用PDQuest 8.0.1軟件對圖像進行分析，將經過裁剪、標記的各實驗組圖像進行自動檢測和匹配,以2倍表達差異為標準 (如2倍上升表達和2倍下降表達) 選擇差異蛋白點進行質譜鑒定。

1.3.5 質譜鑒定與數(shù)據(jù)庫檢索

切下膠點,利用質譜儀MicrOTOF-QII(BrukerDaltonics)鑒定蛋白質。用Data Analysis Software和Mascot search engine version 2.3.01對質譜數(shù)據(jù)進行分析和搜索(通常使用軟件MASCOT在TAIR數(shù)據(jù)庫中檢索,對所搜索結果進行分析鑒定,得分低于60者,定位為假陽性蛋白，應舍棄)。

1.3.6 生物信息學分析

依據(jù)UniProtKB數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)提供的蛋白質注釋信息對蛋白質進行功能分類。

2 結果與分析

2.1 不同處理下小麥根部差異蛋白點的比較

通過2-DE技術，共檢測出100多個蛋白點，這些蛋白點pH值和分子量分別主要集中于3.5～7.5和30～85 kD范圍(圖1、圖2)。其中,與CK相比,木炭處理(C)蛋白點表達上調8個,表達下調10個,未表達10個；NaCl處理(Y)蛋白點表達上調1個，表達下調18個，未表達11個；NaCl+木炭復合處理(F)蛋白點表達上調5個，表達下調12個，未表達13個。而與Y處理相比，F(xiàn)處理蛋白點表達上調15個，表達下調0個，未表達4個。

C：木炭；Y：NaCl；F：NaCl+木炭。圖2同。

C: Charcoal; Y: NaCl; F: NaCl+Charcoal.The same in Fig.2.

圖1 不同處理的蛋白表達圖譜

Fig.1 Images of protein spots under different treatments

2.2 小麥根部差異表達蛋白點的質譜鑒定

選取復合處理中豐度變化相對于鹽處理在2倍以上的12個差異表達蛋白點進行MALDI-TOF-TOF/MS質譜鑒定(表1)。依據(jù)UniProtKB數(shù)據(jù)庫中對應蛋白點的信息資料，將所鑒定的12個差異表達的小麥幼苗根系蛋白按其功能歸為五類。第Ⅰ類為與能量代謝相關的蛋白，即ATP酶(Vacuolar proton-ATPase subunit A，SSP1901和SSP1701)；第Ⅱ類為與糖代謝相關的蛋白，包括磷酸甘油醛異構酶(Phosphoglycerate kinase，SSP1902和SSP2903)、磷酸丙糖異構酶(Triosephosphate isomerase， SSP1401)、6-磷酸葡糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,decarboxylating，SSP1502)、蘋果酸脫氫酶(Malic enzyme，SSP4801)以及烏頭酸水合酶(Aconitate hydratase，SSP4901)；第Ⅲ類為與氨基酸代謝相關的蛋白，如半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase，SSP1503)；第Ⅳ類為與遺傳物質相關的蛋白，如染色體的結構蛋白(Chromosome 3B,genomic scaffold,cultivar Chinese Spring，SSP0501、SSP1903和SSP3601)；第Ⅴ類為未知功能的蛋白質。

圖2 不同處理的蛋白點命名圖譜

3 討 論

3.1 鹽脅迫及木炭對小麥幼苗根部形態(tài)結構和生理生化的影響

鹽脅迫能導致植株矮化,降低干重和鮮重,影響植物的光合作用,使植物提前發(fā)育并過早衰老[20]，引起作物減產[21]，影響植物體內離子運輸。這是因為在鹽脅迫的應答過程中，高濃度的NaCl改變碳水化合物代謝和能量代謝、離子的膜轉運和平衡，使細胞骨架重組和細胞壁重構[22]。研究發(fā)現(xiàn)，少量的鹽脅迫能促進植物抗氧化酶系統(tǒng)增強，提高SOD、POD和CAT活性；而過高含量的鹽分則使植物體內抗氧化酶活性受到抑制。這一現(xiàn)象被很多學者已證實。周丹丹研究表明，5%鹽濃度脅迫下，隨著鹽脅迫時間的延長，滲透調節(jié)物質(可溶性糖、脯氨酸和可溶性蛋白質)含量有所下降，SOD、POD、CAT 活性隨著脅迫時間的延長先升高后降低[23]。NaCl對冬小麥的抗氧化酶活性的抑制作用與植物體內ROS含量劇增有關[24-25]。而木炭是近幾年來迅猛發(fā)展起來的對環(huán)境無二次污染的新型肥料[15]。木炭的添加能增加植物新生根的數(shù)目，提高植物鮮重、株高和葉面積，促進植物器官分化，提高作物產量[14]，同時也使植物體內MDA含量下降，顯著增加SOD、POD和CAT活性。同時冬小麥在鹽脅迫下根部可溶性糖有所積累，這可能是對鹽脅迫的適應性表現(xiàn)，或是起信號物質的作用[26]，還有待進一步研究。

表1 鹽脅迫及木炭處理下小麥幼苗根部差異蛋白點的MALDI-TOF-TOF/MS鑒定結果

3.2 木炭對鹽脅迫下小麥幼苗根部差異蛋白表達的影響

本實驗共成功鑒定出12個蛋白點，按其功能可歸為五類蛋白質。

第Ⅰ類為與能量代謝相關蛋白質,即ATP酶(Vacuolar proton-ATPase subunit A，SSP1901和SSP1701 )。ATP酶廣泛分布于線粒體內膜、葉綠體類囊體及異養(yǎng)菌和光合菌的質膜上,參與氧化磷酸化和光合磷酸化,在Na+的轉運和亞細胞分布以及離子平衡中具有重要作用[27]。ATP合成酶與能量代謝緊密相關。這些蛋白質在鹽脅迫下表達下調或不表達，而在木炭處理下有部分上調。研究表明，干旱條件下，ATP合酶表達下調，這將不可避免地影響光合磷酸化的產生，進一步影響卡爾文循環(huán)，這可能是干旱脅迫條件下植物凈光合速率下降的一個主要原因[28]。

第Ⅱ類為與糖代謝相關蛋白質,包括磷酸甘油醛異構酶(Phosphoglycerate kinase，SSP1902，SSP2903)、磷酸丙糖異構酶(Triosephosphate isomerase，SSP1401)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,decarboxylating，SSP1502)、蘋果酸脫氫酶(Malic enzyme，SSP4801)以及烏頭酸水合酶(Aconitate hydratase，SSP4901)。這些蛋白在受到鹽脅迫時會表達下調或不表達，而木炭則可緩解這些脅迫，使部分蛋白點恢復上調。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是磷酸戊糖途徑的限速酶。磷酸戊糖途徑存在于細胞質中,是葡萄糖在體內生成5-磷酸核糖的唯一途徑。后者是合成核苷酸輔酶及核酸的主要原料,故在損傷后修復及脅迫處理的細胞中,磷酸戊糖途徑比較活躍。該蛋白的特異性表達可能對其修復鹽脅迫造成的損傷具有一定作用[27]。磷酸丙糖異構酶是生物體中重要的異構酶之一，存在于多種組織中，其主要參與糖酵解過程，對于 ATP 的儲存與生成是必不可少的[28]。研究發(fā)現(xiàn)，干旱逆境條件下，磷酸丙糖異構酶的表達量下調，說明在鹽脅迫條件下，糖酵解途徑受到了阻礙，影響了細胞內糖代謝和能量代謝的正常進行。

第Ⅲ類為與氨基酸代謝相關的蛋白質，如半胱氨酸合成酶(Cysteine synthase，SSP1503),鹽脅迫抑制了其表達，而復合處理組則表達上調，表明鹽脅迫阻礙了氨基酸相關蛋白質的合成。該蛋白的特異性表達說明鹽脅迫下,氨基酸合成明顯提高,促進了氮代謝，從而提高了它的耐鹽能力[27]。

第Ⅳ類為與遺傳物質相關的蛋白質，如染色體的結構蛋白(Chromosome 3B,genomic scaffold,cultivar Chinese Spring，SSP0501，SSP1903和SSP3601)這些蛋白點能夠控制遺傳表現(xiàn)，使染色質保持一定的結構。

第Ⅴ類為未知功能蛋白質。在后續(xù)的研究中，將對其進行進一步探討。

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Effect of Charcoal on Protein Expression of Wheat Seedling Root under Salt Stress

CHEN Jifang，DUAN Jiangyan

(College of Life Science,Shanxi Normal University,Linfen,Shanxi 041000,China)

Winter wheat Linfen 6339 was used to determine the effect of charcoal on wheat seedling root under salt stress.The wheat seedlings were treated with single factor (salt or charcoal) and two factors (salt and charcoal). The differential expression proteins in wheat roots were analyzed by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The results showed that compared with single factor treatment,with the increase of NaCl and charcoal concentration,a total of 12 differentially expressed protein spots were detected in the root system of wheat with abundance variation more than 2 times. The identified 12 protein spots could be classified into 5 categories according to their functions through MALDI-TOF-TOF analysis.Among them,ATP synthase and ATP enzymes belonged to ClassⅠ,which are relative to energy metabolism. Class Ⅱ contained sugar metabolism related proteins,including phosphoglycerate kinase,triosephosphateisomerase,6-phosphogluconate dehydrogenase,malic enzyme and aconitatehydratase. Class Ⅲ contained cysteine synthase belonging to amino acid metabolism related proteins. Class Ⅳ contained structural proteins of chromosome,belonging to hereditary substance related proteins. Class Ⅴ contained unknown function proteins.

Wheat; Root;Salt stress; Charcoal;Protein expression

時間：2017-05-12

2016-12-04

2017-01-12

E-mail：2575814547@qq.com

段江燕(E-mail：506777055@qq.com)

S512.1；S311

A

1009-1041(2017)05-0705-07

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170512.2001.038.html