胡冬冬 趙亮 范里 劉旭平 鄧獻(xiàn)存 繆仕偉 譚文松

（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

酵母抽提物對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體表達(dá)的影響

胡冬冬 趙亮 范里 劉旭平 鄧獻(xiàn)存 繆仕偉 譚文松

（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

為了深入認(rèn)識(shí)酵母抽提物在中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞生長(zhǎng)及單克隆抗體表達(dá)過程中所發(fā)揮的作用，綜合考察了傳代培養(yǎng)和批式培養(yǎng)過程中，不同濃度酵母抽提物條件下CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及營(yíng)養(yǎng)物代謝的情況。傳代培養(yǎng)過程中，低濃度（1 g/L）的酵母抽提物能夠顯著促進(jìn)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)，高濃度（5-10 g/L）的酵母抽提物則會(huì)顯著抑制CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)；同時(shí)，傳代過程中添加酵母抽提物不會(huì)影響種子細(xì)胞在批式培養(yǎng)中的表現(xiàn)。批式培養(yǎng)過程中，抗體比生成速率隨酵母抽提物濃度的提高而升高，濃度為10 g/L時(shí)獲得最高抗體產(chǎn)量。通過采用細(xì)胞生長(zhǎng)階段低濃度、產(chǎn)物表達(dá)階段高濃度的添加策略，酵母抽提物在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中可發(fā)揮巨大的應(yīng)用價(jià)值。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)；CHO細(xì)胞；酵母抽提物；單克隆抗體；氨基酸代謝

抗體類藥物以其高特異性、高親和力且對(duì)人體低毒害性等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)今醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的主流研發(fā)產(chǎn)品。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以其生產(chǎn)的抗體類蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有正確的糖基化結(jié)構(gòu)而被產(chǎn)業(yè)界廣泛接受［1］。作為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵要素，培養(yǎng)基及其添加劑在抗體類藥物生產(chǎn)工藝中的作用毋庸置疑。蛋白水解物以其成本低廉、無毒害且效果顯著等優(yōu)勢(shì)，被廣泛作為血清替代物或營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑添加于細(xì)胞培養(yǎng)基中［2，3］。

作為蛋白水解物中的一個(gè)大類，酵母抽提物（YE）因具有顯著促進(jìn)重組蛋白表達(dá)的作用，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，且其批次間具有組分差異小、效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［4，5］。YE是以發(fā)酵得到的面包酵母或釀酒酵母為原料，經(jīng)細(xì)胞自溶、酶解等過程將胞內(nèi)蛋白、核酸等降解為多肽、氨基酸以及核苷酸等小分子，再通過超濾及干燥而得到的產(chǎn)品［6］。其中富含多肽、氨基酸、核苷酸、維生素以及微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［7］。盡管YE在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用很多，但系統(tǒng)性地研究其在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的作用以及使用策略的報(bào)道仍十分有限。因此，深入認(rèn)識(shí)YE在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何發(fā)揮作用及其對(duì)關(guān)鍵參數(shù)的影響特性，將有助于YE乃至其他蛋白水解物在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用推廣。

為此，本研究以表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞為研究對(duì)象，綜合考察了不同濃度YE對(duì)連續(xù)傳代、批式培養(yǎng)以及長(zhǎng)期連續(xù)傳代后批式培養(yǎng)等過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝及產(chǎn)物表達(dá)的影響，旨為YE在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物制藥產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用以及高效無血清培養(yǎng)基的開發(fā)提供借鑒和依據(jù)。

1.2.1.2 批式培養(yǎng) 取指數(shù)生長(zhǎng)期的種子細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心5 min，棄上清，用新鮮BM培養(yǎng)基進(jìn)行重懸。以1.0×106cells/mL左右的活細(xì)胞密度接種于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)管，接種體積為20 mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)額外添加所需的YE濃縮液（200 g/L）。將細(xì)胞培養(yǎng)管置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)過程中自第0天起每天取樣600 μL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)10 000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃保存，用于抗體產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)物及代謝物的檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方案 本研究所涉及的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為采用不同濃度YE的BM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代后接種于BM培養(yǎng)基進(jìn)行批式培養(yǎng)和采用BM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代后接種于不同濃度YE的BM培養(yǎng)基進(jìn)行批式培養(yǎng)兩大部分（圖1）。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用細(xì)胞株為表達(dá)單克隆抗體的重組CHO細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（BM）為實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)，所用的YE購自Kerry Group公司。其他培養(yǎng)基配制所用試劑均購自Sigma-Aldrich公司。培養(yǎng)基配制完后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜（Millipore）過濾除菌后使用。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1.1 種子細(xì)胞傳代培養(yǎng) CHO細(xì)胞從細(xì)胞庫中復(fù)蘇后，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸并接種于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)管（瑞士TPP AG公司），接種體積為20 mL，置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。每48小時(shí)進(jìn)行種子細(xì)胞傳代擴(kuò)增，傳代后活細(xì)胞密度控制在（4-6）×105cells/mL。

圖1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)和批式培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)流程示意圖

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞密度采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（CounterStar）進(jìn)行計(jì)數(shù)，并利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法確定細(xì)胞的活性。

1.2.3.2 抗體濃度檢測(cè) 抗體濃度采用親和色譜的方法［8］進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為POROS Protein A affinity column，4.0×50 mm（Applied Biosystems）。

1.2.3.3 葡萄糖、乳酸和氨的檢測(cè) 葡萄糖、乳酸和氨的濃度測(cè)定分別采用葡萄糖試劑盒（上?？菩郎锛夹g(shù)研究所）、乳酸測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）和 Berthelot 尿素氮測(cè)定試劑盒（上?？菩郎锛夹g(shù)研究所，不使用脲酶，改用NH4Cl作為銨離子標(biāo)準(zhǔn)液），操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3.4 培養(yǎng)上清中氨基酸的檢測(cè) 氨基酸檢測(cè)采用高效液相色譜法（安捷倫1260 HPLC）測(cè)定。樣品經(jīng)OPA按說明書設(shè)置程序在線柱前自動(dòng)衍生，經(jīng)反相色譜柱（ZORBAX Eclipse AAA）分離后，采用DAD紫外檢測(cè)器（激發(fā)波長(zhǎng)：338 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：390 nm）進(jìn)行檢測(cè)。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Thermo Fisher公司。

1.2.3.5 數(shù)據(jù)分析 比生長(zhǎng)速率μ通過以下公式計(jì)算：

XV為活細(xì)胞密度（106cells/mL），t為培養(yǎng)時(shí)間（day）。抗體的比生成速率qp通過以下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中qp為抗體的比生成速率（mg/109cells/day或pg/cell/day）；P為抗體濃度（mg/L）；IVCD為活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分（109cells·day/L）。

上清中營(yíng)養(yǎng)物及代謝物的比生成/消耗速率參考抗體的比生成速率計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算或采用濃度與IVCD進(jìn)行線性擬合求斜率的方法獲得。

2 結(jié)果

2.1 連續(xù)傳代過程中YE對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

為了研究細(xì)胞傳代過程中YE的添加對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，分別考察了0、1、2、5和10 g/L YE濃度條件下CHO細(xì)胞的傳代情況。

圖2-A是CHO細(xì)胞在不同YE濃度條件下的細(xì)胞傳代曲線。結(jié)果表明，單獨(dú)的BM培養(yǎng)基以及不同YE濃度條件下CHO細(xì)胞均能以穩(wěn)定的比生長(zhǎng)速率進(jìn)行生長(zhǎng)和連續(xù)傳代。同時(shí)，不同濃度的YE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有不同的影響。通過公式計(jì)算得到細(xì)胞平均比生長(zhǎng)速率如圖2-B所示。當(dāng)培養(yǎng)基中不含YE（0 g/L）時(shí)，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率維持在0.78±0.04/d。隨著YE添加量的提高，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。其中，當(dāng)YE濃度為1 g/L時(shí)，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率達(dá)到最高，為0.86±0.03/d；YE濃度為2 g/L時(shí)，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率與未添加YE組基本一致，為0.76±0.05/d；當(dāng)YE濃度繼續(xù)增加，細(xì)胞生長(zhǎng)開始受到抑制，比生長(zhǎng)速率顯著低于未添加YE組（P＜0.05），并于10 g/L時(shí)達(dá)到最低值，為0.53±0.06/d。

圖2 CHO細(xì)胞在不同YE濃度下的傳代曲線（A）以及比生長(zhǎng)速率（B）

2.2 添加YE的基礎(chǔ)培養(yǎng)基長(zhǎng)期傳代對(duì)CHO細(xì)胞的影響

通過以上連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)可知YE會(huì)顯著影響CHO細(xì)胞在傳代過程中的生長(zhǎng)情況。為了研究經(jīng)YE長(zhǎng)期傳代后的種子細(xì)胞在批式培養(yǎng)過程中的表現(xiàn)，采用BM培養(yǎng)基對(duì)上述連續(xù)傳代12-13次的CHO細(xì)胞進(jìn)行批式培養(yǎng)。

2.2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá) 圖3-A所示為經(jīng)不同YE濃度條件下連續(xù)傳代的CHO細(xì)胞接種至BM培養(yǎng)基中進(jìn)行批式培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。由圖可知，不同來源的CHO種子細(xì)胞經(jīng)離心接種后在相同培養(yǎng)基（BM）中的生長(zhǎng)情況基本一致，最大活細(xì)胞密度均在（4.9-5.2）×106cells/mL之間。圖3-B為批式培養(yǎng)過程中抗體的表達(dá)曲線。同細(xì)胞生長(zhǎng)情況類似，不同實(shí)驗(yàn)組中抗體表達(dá)也基本一致，均于第10天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到最大產(chǎn)物濃度，約為200 mg/L。

圖3 不同YE濃度下長(zhǎng)期傳代的CHO細(xì)胞在BM培養(yǎng)基中批式培養(yǎng)的生長(zhǎng)（A）及抗體表達(dá)（B）情況

2.2.2 營(yíng)養(yǎng)物和副產(chǎn)物代謝 表1所示為不同YE濃度下長(zhǎng)期傳代的CHO細(xì)胞在批式培養(yǎng)過程中葡萄糖（Gluc）、乳酸（Lac）和氨（Amm）的代謝數(shù)據(jù)?？傮w而言，與細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)類似，不同培養(yǎng)基傳代獲得的種子細(xì)胞在批式培養(yǎng)過程中的代謝特征基本一致，乳酸代謝同樣呈現(xiàn)先生成后消耗的趨勢(shì)。其中，在批式培養(yǎng)前期（0-2 d）乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)（YLac/YGluc）呈現(xiàn)一定趨勢(shì)，隨著YE濃度的提高，YLac/YGluc從單純BM條件下的1.67降低至10 g/L YE時(shí)的0.99。

以上結(jié)果表明，CHO細(xì)胞連續(xù)傳代過程中YE的添加對(duì)其生長(zhǎng)具有顯著影響。低濃度（1 g/L）的YE促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度（5-10 g/L）的YE抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。CHO種子細(xì)胞在含YE的培養(yǎng)基中長(zhǎng)期傳代對(duì)細(xì)胞在批式培養(yǎng)中的生長(zhǎng)、產(chǎn)物表達(dá)及營(yíng)養(yǎng)物代謝基本無影響。其中，僅YLac/YGluc隨YE濃度增加而降低。

2.3 YE對(duì)CHO細(xì)胞批式培養(yǎng)的影響

為了繼續(xù)研究YE作為培養(yǎng)基添加物在細(xì)胞批式培養(yǎng)過程中的影響，分別采用YE濃度為0、1、2、5和10 g/L的BM培養(yǎng)基進(jìn)行CHO細(xì)胞批式培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同YE濃度下長(zhǎng)期傳代的CHO細(xì)胞在批式培養(yǎng)過程中葡萄糖、乳酸和氨的代謝情況

2.3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá) 圖4-A所示為CHO細(xì)胞在不同YE濃度的BM培養(yǎng)基中進(jìn)行批式培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。由圖可知，細(xì)胞在不同YE濃度的BM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況存在較大差異。與傳代實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞生長(zhǎng)情況相似，隨著YE濃度的提高，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)YE濃度為1 g/L 時(shí)，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度最高，為4.7×106cells/mL。隨著YE濃度的進(jìn)一步提高（≥2 g/L），培養(yǎng)過程所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度逐漸下降。當(dāng)YE濃度為10 g/L時(shí)，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度下降到1.7×106cells/mL，細(xì)胞生長(zhǎng)被顯著抑制。

抗體的表達(dá)同樣呈現(xiàn)出較大差異（圖4-B）。未添加YE時(shí)，產(chǎn)物終濃度最低。隨著YE濃度的提高，產(chǎn)物終濃度逐漸增加。當(dāng)YE濃度為10 g/L時(shí)，產(chǎn)物終濃度最高，達(dá)到了330.4±5.4 mg/L。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物比生成速率在不同YE濃度條件下同樣具有顯著差異且隨著YE濃度的提高而升高（圖4-C）。當(dāng)YE濃度為10 g/L時(shí)，產(chǎn)物比生成速率最大，達(dá)到了25.8±0.2 pg/cell/d，為無YE條件下的4.3倍。

圖4 CHO細(xì)胞在不同濃度YE的BM培養(yǎng)基中批式培養(yǎng)的生長(zhǎng)（A）、抗體表達(dá)（B）以及產(chǎn)物比生成速率（C）情況

2.3.2 營(yíng)養(yǎng)物和副產(chǎn)物代謝 CHO細(xì)胞在不同YE濃度的BM培養(yǎng)基中進(jìn)行批式培養(yǎng)的葡萄糖、乳酸和氨的代謝情況如表2所示?？傮w來說，葡萄糖、乳酸及氨的比消耗/生成速率均隨著培養(yǎng)基中YE濃度的提高而增加。其中，當(dāng)YE濃度為10 g/L時(shí)，葡萄糖比生成速率最大，為2.24±0.01 mmol/109cells/d。同時(shí)，10 g/L條件下批式培養(yǎng)前期和后期的乳酸比生成和比消耗速率也均為最大，分別 達(dá) 到 了 4.20±0.02和0.73±0.01 mmol/109cells/ day；氨的比生成速率則達(dá)到了0.246±0.002 mmol/109cells/d，為無YE條件下的2.2倍。由于葡萄糖和乳酸比生成/消耗速率均隨著YE濃度提高而增加，最終計(jì)算得到的各YE濃度下批式培養(yǎng)前期和后期YLac/YGluc均基本一致。

YE中富含大量的小分子多肽及游離氨基酸。這些物質(zhì)被認(rèn)為是蛋白水解物中影響細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)物表達(dá)的主要有效成分［2］。因此，檢測(cè)培養(yǎng)體系中氨基酸的代謝情況有助于了解YE中這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在批式培養(yǎng)過程中所發(fā)揮的作用。圖5所示為批式培養(yǎng)過程中必需氨基酸（EAA，圖5-A）和非必需氨基酸（NAA，圖5-B）的代謝情況。當(dāng)YE濃度在0-5 g/L之間時(shí)，除Gly和Ala呈生成狀態(tài)外，絕大多數(shù)氨基酸比消耗速率均隨著YE濃度的提高而增加。當(dāng)YE達(dá)到10 g/L時(shí)，氨基酸代謝表現(xiàn)出較大差異。其中，Asn和Gln的比消耗速率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，Gly和Ala的比生成速率也顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組。必需氨基酸中Val、Ile和Lys出現(xiàn)了凈生成的狀態(tài)。同時(shí)，許多其他氨基酸，如Thr、Trp、His、Arg、Tyr以及Cys等，比消耗速率也出現(xiàn)了明顯下降，而由2.3.1的結(jié)果可知10 g/L條件下產(chǎn)物比生成速率卻是最高的。因此，猜測(cè)該條件下細(xì)胞可能更多地利用多肽中的氨基酸進(jìn)行代謝和物質(zhì)合成。

以上結(jié)果表明，批式培養(yǎng)過程中添加YE能夠顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物表達(dá)和營(yíng)養(yǎng)物代謝。低濃度（1 g/L）的YE促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度（10 g/L）的YE抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。產(chǎn)物比生成速率隨著YE濃度的提高而升高。綜合細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物比生成速率隨YE濃度的變化情況，10 g/L的添加量使得最終的產(chǎn)物濃度最高。同時(shí)，YE的添加能夠提高細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，尤其是降解和利用YE中的多肽組分。

表2 CHO細(xì)胞在不同YE濃度的批式培養(yǎng)過程中葡萄糖、乳酸和氨的代謝情況

圖5 CHO細(xì)胞在不同YE濃度的批式培養(yǎng)過程中必需氨基酸和非必需氨基酸的代謝情況

3 討論

在細(xì)胞長(zhǎng)期連續(xù)傳代方面，YE的添加對(duì)細(xì)胞比生長(zhǎng)速率影響顯著，低濃度（1 g/L）的YE有利于CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)，而高濃度（5-10 g/L）的YE則會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。YE源自于酵母細(xì)胞的自溶和酶解，其中包含多肽、氨基酸、寡糖、核苷酸、維生素以及微量元素等多種物質(zhì)［7］。諸多文獻(xiàn)報(bào)道，非葡萄糖碳源［9］、寡肽［10，11］、核苷酸［12，13］及微量元素［14］等物質(zhì)的添加均能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，低濃度的YE可能彌補(bǔ)了基礎(chǔ)培養(yǎng)基中缺乏的部分營(yíng)養(yǎng)物，從而有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。YE中同時(shí)富含高比例的小分子有機(jī)物和無機(jī)鹽類，1 g/L的添加量會(huì)使得培養(yǎng)體系的滲透壓提高6-10 mOsm/Kg［5］。本研究中YE濃度為5-10 g/L時(shí)，培養(yǎng)體系滲透壓達(dá)到了360-420 mOsm/Kg，故而過高的滲透壓可能是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的主要原因［15］。將在不同濃度YE的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中長(zhǎng)期傳代后的CHO細(xì)胞進(jìn)行批式培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，傳代過程中YE的添加量對(duì)細(xì)胞在批式培養(yǎng)過程中的生長(zhǎng)及產(chǎn)物表達(dá)均無顯著影響。這說明YE可安全應(yīng)用于種子細(xì)胞擴(kuò)增階段的培養(yǎng)基中。營(yíng)養(yǎng)物代謝方面，總體而言影響不顯著，僅乳酸對(duì)葡萄糖的得率系數(shù)（YLac/YGluc）隨YE添加量的提高而降低。這表示消耗單位葡萄糖生成的乳酸減少，進(jìn)入TCA循環(huán)的比例提高，其物質(zhì)代謝效率更高，能夠?yàn)榧?xì)胞供應(yīng)更多能量。

在細(xì)胞批式培養(yǎng)方面，YE對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響同連續(xù)傳代類似，低濃度（1 g/L）促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度（10 g/L）抑制細(xì)胞生長(zhǎng)?？贵w的比生成速率則隨著YE濃度的提高而增加。YE對(duì)重組蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用已有諸多報(bào)道［4，16，17］。研究發(fā)現(xiàn)，YE對(duì)蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用可能與mRNA轉(zhuǎn)錄水平的提高相關(guān)［5］。因YE中化學(xué)成分復(fù)雜，僅能結(jié)合相關(guān)研究猜測(cè)其中發(fā)揮效用的物質(zhì)可能為有機(jī)酸，如丁酸［18］、戊酸［19］，活性多肽［10］或者其他小分子物質(zhì)［20］等。同時(shí)，高濃度的YE能夠顯著提升培養(yǎng)體系的滲透壓，而高滲條件有利于CHO細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)重組蛋白的分泌［21］。因此，借助于高滲效應(yīng)，YE對(duì)CHO細(xì)胞表達(dá)重組蛋白的促進(jìn)作用更加突出。在營(yíng)養(yǎng)物代謝方面，YE的添加能夠提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取速率，促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用。同時(shí)YLac/YGluc基本維持一致，即消耗單位葡萄糖進(jìn)入TCA循環(huán)的比例相近，物質(zhì)代謝效率相似。因此，高YE濃度條件下細(xì)胞對(duì)葡萄糖比消耗速率較高，單位細(xì)胞分解葡萄糖獲取能量的速率較大，充裕的能量供給同樣有助于重組蛋白的表達(dá)。這一現(xiàn)象在文獻(xiàn)中也有所報(bào)道［22，23］。高濃度（10 g/L）的YE條件下，多種必需氨基酸出現(xiàn)了凈生成的情況。而細(xì)胞無法通過其他物質(zhì)自行合成這些氨基酸，可能的解釋是細(xì)胞利用了YE中的多肽并將其降解成了游離氨基酸［24］。這一現(xiàn)象說明YE中的多肽在過程中被細(xì)胞利用，也為文獻(xiàn)中所提及的細(xì)胞更傾向于利用水解物中寡肽的觀點(diǎn)提供了一個(gè)實(shí)例［25，26］。

傳代擴(kuò)增和批式培養(yǎng)是CHO細(xì)胞表達(dá)重組蛋白生產(chǎn)工藝中的兩個(gè)典型培養(yǎng)過程。傳代擴(kuò)增階段，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率的高低是其過程優(yōu)劣的重要指標(biāo)；而在批式培養(yǎng)過程中，較高的產(chǎn)物比生成速率往往意味著更高的體積產(chǎn)率和高效的產(chǎn)能?？傮w而言，這兩大過程的目標(biāo)和需求具有一定的“矛盾性”。本研究發(fā)現(xiàn)，YE可同時(shí)滿足這兩大過程的需求，但需要采用不同的添加策略。這也為以往研究文獻(xiàn)中YE添加濃度的差異［4，5，17］提供了合理的解釋。綜上所述，通過采用細(xì)胞生長(zhǎng)階段低濃度、產(chǎn)物培養(yǎng)階段高濃度的添加策略，可將YE高效應(yīng)用于表達(dá)重組蛋白的CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程。

4 結(jié)論

本研究綜合考察了YE在CHO細(xì)胞傳代擴(kuò)增階段以及批式培養(yǎng)階段對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體表達(dá)的影響。結(jié)果表明，低濃度（1 g/L）的YE在這兩個(gè)階段均能促進(jìn)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)而高濃度（5-10 g/L）時(shí)則顯著抑制其生長(zhǎng)；抗體的比生成速率則隨著YE濃度（0-10 g/L）的提高而增加。綜合而言，YE的使用宜選擇細(xì)胞生長(zhǎng)階段低濃度、產(chǎn)物表達(dá)階段高濃度的添加策略。YE在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和潛力。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Effects of Yeast Extract on Cell Growth and Antibody Production in CHO Cell Culture

HU Dong-dong ZHAO Liang FAN Li LIU Xu-ping DENG Xian-cun MIU Shi-wei TAN Wen-song
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

The objective is to get insights into the effects of yeast extract on Chinese hamster ovary（CHO）cell growth and monoclonal antibody production. We comprehensively investigated the cell growth，antibody production and nutrients metabolism at different yeast extract concentrations in continuous passage culture and batch culture. It was found that yeast extract significantly improved CHO cell growth at low concentration（1 g/L）and remarkably inhibited CHO cell growth at high concentration（5-10 g/L）during continuous passage culture. Additionally，the result of seed cells in batch culture was not influenced while adding the yeast extract during continuous passage culture. Supplementing yeast extract in batch culture medium，a positive correlation was found between specific antibody production rate and the yeast extract concentration with a maximal antibody titer achieved at yeast extract concentrations of 10 g/L. In conclusion，yeast extracts can make a great contribution on animal cell culture process with a strategy of low concentration added at cell growth phase and high concentration added at protein-production phase.

animal cell culture；CHO cells；yeast extract；monoclonal antibody；amino acid metabolism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1020

2016-11-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21406066），國家重大專項(xiàng)（2013ZX10004003-003-003）

胡冬冬，男，博士研究生，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞與組織工程；E-mail：dongdonghu@mail.ecust.edu.cn

趙亮，男，助理研究員，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞與組織工程；E-mail：zhaoliang@ecust.edu.cn

譚文松，男，教授，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞與組織工程；E-mail：wstan@ecust.edu.cn