李凌凌 呂早生 左振宇 楊忠華 劉曜寧 宋采薇

（武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，武漢 430081）

酮還原酶中立體選擇性還原位點(diǎn)的突變及其產(chǎn)物分析

李凌凌 呂早生 左振宇 楊忠華 劉曜寧 宋采薇

（武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，武漢 430081）

為驗(yàn)證糖多孢紅霉菌聚酮合成酶中酮還原酶（EryKR）的LDD模式序列是否為控制2-甲基環(huán)己酮立體選擇性還原的位點(diǎn)，構(gòu)建了分別異源表達(dá)聚酮合成酶模塊1的酮還原酶（EryKR1）、模塊2的酮還原酶（EryKR2）、LDD殘基替換為PQQ（LDD→PQQ）的EryKR1及PQQ替換為LDD（PQQ→LDD）的EryKR2的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21（pET28a-eryKR1）、E.coli BL21（pET28a-eryKR2）、E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）和E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后4個(gè)重組菌中都表達(dá)出相應(yīng)的酮還原酶。粗酶液的比酶活分別為1.49 U/mg、0.37 U/mg、0.94 U/mg和0.31 U/mg。利用氣相色譜分別檢測4個(gè)重組菌還原2-甲基環(huán)己酮體系中產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示與野生型EryKR1的還原產(chǎn)物以順式-2-甲基環(huán)己醇為主不同，LDD→PQQ的突變型EryKR1催化2-甲基環(huán)己酮的還原產(chǎn)物主要為反式-2-甲基環(huán)己醇，而PQQ→LDD的突變型EryKR2的主要還原產(chǎn)物也由野生型EryKR2的反式-2-甲基環(huán)己醇轉(zhuǎn)變成順式-2-甲基環(huán)己醇，證實(shí)了LDD模式序列確實(shí)為酶中控制2-甲基環(huán)己酮立體選擇性還原的位點(diǎn)。

聚酮合成酶；酮還原酶；2-甲基環(huán)己酮；突變；立體選擇性

含有環(huán)己基的手性醇是很多醫(yī)藥、農(nóng)藥、有機(jī)化工產(chǎn)品及材料的重要中間體［1］，譬如，合成酸增殖劑的關(guān)鍵前體1-苯基-cis-1，2-環(huán)己二醇，合成手性藥物的手性砌塊光學(xué)純的β-氨基環(huán)己醇等。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建不對(duì)稱還原取代環(huán)己酮的生物催化劑，為合成這類手性醇提供了一種安全性、環(huán)境相容性、立體選擇性均高的方法，但是，目前關(guān)于這方面的報(bào)道較少［2］。糖多孢紅霉菌聚酮合成酶的6個(gè)模塊中有5個(gè)酮還原酶（EryKR），是一個(gè)催化羰基不對(duì)稱還原的天然酶庫。酮還原酶表現(xiàn)出廣泛的底物譜：酮還原酶不僅能還原天然底物鏈?zhǔn)骄弁溂芭c其相似的底物如（2R，S）-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酸酯等［3，4］，而且還能以完全不同于鏈?zhǔn)骄弁湹暮h(huán)己基結(jié)構(gòu)的化合物作為底物［5，6］，如環(huán)己酮、2-甲基環(huán)己酮和2-烯丙基環(huán)己酮等，顯示了EryKR有望成為立體選擇性還原取代環(huán)己酮的手性生物催化劑的巨大潛力。

Ⅰ型聚酮合成酶的酮還原酶根據(jù)對(duì)鏈?zhǔn)骄弁湹牧Ⅲw選擇性還原情況分為A型和B型，糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1的酮還原酶（EryKR1）為B型酮還原酶，在第88-103個(gè)氨基酸處有一個(gè)LDD模式序列，而糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊2的酮還原酶（EryKR2）為A型酮還原酶，其中沒有這個(gè)模式［7］。多種聚酮合成酶的酮還原酶對(duì)包括（2R，S）-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酸酯在內(nèi)的若干α-替代的β-羰基雙酮化合物進(jìn)行的立體選擇性還原研究，發(fā)現(xiàn)若這些位點(diǎn)發(fā)生了突變，酮還原酶對(duì)這些底物的立體選擇性會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，證實(shí)了這些酶中存在有控制立體選擇性還原的模式序列［7，8］。

考慮到除了鏈?zhǔn)骄弁湥€原酶還能以含環(huán)己基結(jié)構(gòu)的化合物為底物。為了探討LDD模式序列是否也是控制含環(huán)己基結(jié)構(gòu)的化合物立體選擇性還原的位點(diǎn)，本研究利用重疊PCR技術(shù)將EryKR1（B型KR）中控制立體選擇性還原的LDD模式序列突變成EryKR2（A型KR）中的相應(yīng)位點(diǎn)PQQ，并且將EryKR2中的PQQ突變成EryKR1中的LDD，通過比較突變型酮還原酶與野生型酮還原酶以2-甲基環(huán)己酮為底物的酶活以及還原產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)，分析2-甲基環(huán)己酮的主要還原產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變與LDD模式序列的變化之間的關(guān)聯(lián)，確定LDD模式序列是否為酶中負(fù)責(zé)控制2-甲基環(huán)己酮立體選擇性還原的位點(diǎn)，旨在為指導(dǎo)催化不對(duì)稱還原取代環(huán)己酮的手性生物催化劑的構(gòu)建及開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 糖多孢紅霉菌（Saccharopolyspora erythraea）、大腸桿菌表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒及重組菌E.coli BL21（pET28a-gdh）為本實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌BL21（E.coli BL21（DE3））為本實(shí)驗(yàn)宿主菌，購買于康為世紀(jì)生物科技有限公司。LB培養(yǎng)基［9］：酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L，pH7.0，用于培養(yǎng)大腸桿菌BL21，篩選抗性菌株時(shí)，加卡拉霉素終濃度為100 μg/mL；TSB培養(yǎng)基：Tryptic Soy Broth 30 g/L，用于糖多孢紅霉菌的液體培養(yǎng)。

1.1.2 酶和化學(xué)試劑 Lysozyme、蛋白酶K、pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ、T4DNA連接 酶、DNA ladder Marker、Protein Marker、DNA Loading Buffer、微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及高純度質(zhì)粒小提試劑盒均為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，2-甲基環(huán)己酮（98%）和反式-2-甲基環(huán)己醇（97%）為Alfa Aesar公司的產(chǎn)品，順式-2-甲基環(huán)己醇（98%）購自Aldrich。

1.2 方法

1.2.1 野生型及突變型eryKR1或eryKR2基因的克隆及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 糖多孢紅霉菌A226基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)［5］報(bào)道的EryKR1和EryKR2的邊界，設(shè)計(jì)擴(kuò)增野生型eryKR1基因和eryKR2基因（或突變型eryKR1即TeryKR1基因和突變型eryKR2即TeryKR2基因）的兩端引物，為便于克隆，在正向引物和反向引物前分別加上NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，其中用于擴(kuò)增野生型和突變型eryKR1基因的兩端引物為LKR1：5'-gcc atatggacgaggtttccgcgctgcg-3'（gc為保護(hù)性堿基，catatg為NdeⅠ酶切位點(diǎn)）；RKR1：5'-ggaattctcacgcgcccacc cgcggttcggc-3'（g為保護(hù)性堿基，gaattc為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）。

為了采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增TeryKR1基因，設(shè)計(jì)中間的將EryKR1酶中的LDD對(duì)應(yīng)的堿基突變成EryKR2酶中的PQQ相應(yīng)的堿基的正反向引物分 別 TKR1-L：5'-cacgccgccgccacgccgcagcagggcaccg tggacaccctcacc-3'，TKR1-R：5'-ggtgtccacggtgccctgctg cggcgtggcggcggcgtggaacac-3'；而用于擴(kuò)增野生型和突變型eryKR2基因的兩端引物為LKR2：5'-gccatatgg acgagctcgacggctggttc-3'（gc為保護(hù)性堿基，catatg為NdeⅠ酶切位點(diǎn)），RKR2：5'-ggaattctcaccggtcgcgcag gctctccgtc-3'（gaattc為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，前面g為保護(hù)性堿基）。

為了采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增TeryKR2基因，設(shè)計(jì)中間的將EryKR2酶中的PQQ突變成EryKR1酶中的LDD的正反向引物分別為TKR2-L：5'-cacgcgg cgggactgctcgacgacgtcgcgatcaac gacatggac-3'；TKR2-R：5'-gtcgttgatcgcgacgtcgtcgagcagtcccgccgcgtgcaccac-3'；PCR擴(kuò)增體系和條件參考文獻(xiàn)［6］。

獲得的PCR特異片段產(chǎn)物按照微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的產(chǎn)品說明書回收純化后，按照文獻(xiàn)［9］，雙酶切連接到載體pET28a上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。從篩選到的陽性克隆中利用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取出重組質(zhì)粒，經(jīng)武漢擎科公司測序后，再利用NCBI數(shù)據(jù)庫提供的核苷酸比對(duì)功能進(jìn)行比對(duì)，檢測質(zhì)粒中克隆的基因片段與目標(biāo)基因的一致性。

1.2.2 重組酮還原酶的誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測定 按照1%的接種量將構(gòu)建的重組菌種子液接種到含100 μg/mL 卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)3 h左右加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4 h［10］。離心（4℃，10 000 r/min，10 min）收集菌體沉淀，用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH7.0）洗滌重懸后，超聲波破碎（破胞強(qiáng)度60%，工作3 s間歇5 s，10 min）。離心（4℃，10 000 r/min，10 min）收集上清液（即粗酶液），測定其酶活、蛋白質(zhì)含量及進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。測定酶活的反應(yīng)體系（3 mL）：粗酶液20 μL、2 mmol/L NADPH 500 μL、2-甲基環(huán)己酮50 μL和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH7.0）。該體系置于37℃反應(yīng)30 min，期間在340 nm條件下測量NADPH的吸光值變化曲線，根據(jù)曲線斜率代入NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的公式（y=0.004 83x+ 0.004 53，R2=0.999 82，其中y為 340 nm處的吸光值，x為NADPH濃度（μmol/L）），計(jì)算NADPH含量變化情況。酶活單位U定義為在本實(shí)驗(yàn)條件下，1 min催化氧化1 μmol NADPH到NADP+所需要的酶量。采用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量［9］，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白的濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.005 79x-0.064，R2=0.997 01，y為595 nm處的吸光值，x為蛋白質(zhì)含量（μg/mL）），計(jì)算上清液中蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)文獻(xiàn)［9］進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.2.3 雙重組菌耦合全細(xì)胞催化2-甲基環(huán)己酮的還原 雙重組菌耦合的發(fā)酵體系（10 mL）：0.4 g E.coli BL21（pET28a-eryKR1）（或E.coli BL21（pET28a-ery-KR2）、E.coli BL21（pET28a- TeryKR1）、E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）），0.1 g E.coli BL21（pET28a-gdh），0.1 mol/L葡 萄 糖，0.2 mmol/L NADPH，10 mmol/L 2-甲基環(huán)己酮，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.0）。該體系置于30℃、120 r/min振蕩反應(yīng)6 h。反應(yīng)液離心（4℃，10 000 r/min，10 min）收集上清并用等體積乙酸乙酯萃取，得到的上層有機(jī)相采用Agilent6890型氣相色譜儀檢測分析底物和產(chǎn)物的濃度，并按照文獻(xiàn)［6］計(jì)算轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物收率及對(duì)映體過量值（e.e值）。色譜條件為：采用毛細(xì)管柱CYCLODEXB（30 m×0.25 mm×0.25 m），載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣量為1 μL，F(xiàn)ID檢測器。氣化溫度為250℃，檢測器溫度為300℃；色譜柱初始溫度90℃，維持4 min；升溫速度20℃，終溫為180℃，維持6 min；柱前壓為0.27 MPa，分流比為50∶1。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

eryKR1基因和eryKR2基因的突變位點(diǎn)兩側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TeryKR1-L、TeryKR1-R、TeryKR2-L和TeryKR2-R分別進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1和圖2，可見TeryKR1-L和TeryKR2-L均位于1 000 bp附近，與兩個(gè)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)左側(cè)的序列長度分別為965 bp和893 bp吻合，而片段TeryKR1-R和TeryKR2-R都略高于500 bp，與兩個(gè)目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)右側(cè)的序列長度分別為550 bp和553 bp吻合。

突變型eryKR1基因（命名為TeryKR1）和突變型eryKR2基因（命名為TeryKR2）的重疊PCR產(chǎn)物，野生型eryKR1基因和eryKR2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別以1.0 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖3-圖6。產(chǎn)物片段的大小都位于1 000 bp和2 000 bp之間，與目標(biāo)eryKR1基因和eryKR2基因的序列長度分別為1 461 bp和1 395 bp吻合。

將基因片段eryKR1、eryKR2、TeryKR1和Tery-KR2分別克隆到pET28a載體上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-eryKR1、pET28a-eryKR2、pET28a-TeryKR1和pET28a-TeryKR2。對(duì)獲得的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切鑒定（圖7），證實(shí)了4個(gè)重組質(zhì)粒中克隆的基因片段均在1 000和2 000 bp之間，與目標(biāo)片段的大小一致。含有這4個(gè)質(zhì)粒的重組大腸桿菌分別命 名 為E.coli BL21（pET28a-eryKR1）、E.coli BL21（pET28a-eryKR2）、E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）和E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）。

圖1 eryKR1基因的突變位點(diǎn)兩側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 eryKR2基因的突變位點(diǎn)兩側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 突變型eryKR1基因（TeryKR1）的PCR產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖4 突變型eryKR2基因（TeryKR2）的PCR產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖5 野生型eryKR1基因的PCR產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖6 野生型eryKR2基因的PCR產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖7 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

利用NCBI數(shù)據(jù)庫提供的核苷酸比對(duì)功能，對(duì)重組質(zhì)粒的測序結(jié)果進(jìn)行序列分析，得出測序結(jié)果中克隆的野生型和突變型eryKR1基因、野生型和突變型eryKR2基因與登錄號(hào)為AM420293.1報(bào)道的糖多孢紅霉菌NRRL2338的基因組DNA中792 285-793 727 bp、796 692-798 068 bp的堿基序列的相似度分別達(dá)到100%、99%、100%和99%。

突變型eryKR1和eryKR2基因序列的核苷酸比對(duì)結(jié)果分別如圖8和圖9，突變型eryKR1基因中對(duì)應(yīng)AM420293.1序列中的第793 209-793 218個(gè)堿基ctcgacgac（編碼的氨基酸殘基為LDD）已替換成測序結(jié)果中的ccgcagcag（編碼的氨基酸殘基為PQQ）；而突變型eryKR2基因中對(duì)應(yīng)AM420293.1序列中的第79 7547-797 556個(gè)堿基ccgcagcag（編碼的氨基酸序列為PQQ）已替換成測序結(jié)果中的ctcgacgac（編碼的氨基酸序列為LDD），說明質(zhì)粒pET28a-TeryKR1和pET28a-TeryKR2中克隆的突變型eryKR1和eryKR2基因編碼的氨基酸序列，其中調(diào)控底物的立體選擇性還原的氨基酸殘基發(fā)生了LDD?PQQ互換。

圖8 重組質(zhì)粒pET28a-TeryKR1的核苷酸比對(duì)結(jié)果（截圖）

圖9 重組質(zhì)粒pET28a-TeryKR2的核苷酸比對(duì)結(jié)果（截圖）

2.2 野生型和突變型酮還原酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)情況

以E.coli BL21（pET28a）菌為陰性對(duì)照，SDSPAGE檢測經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組菌E.coli BL21（pET-28a-eryKR1）、E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）、E.coli BL21（pET28a-eryKR2）和E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。如圖10和11所示，與陰性對(duì)照中的蛋白質(zhì)條帶不同，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌在45.0 kD和66.2 kD之間都有酮還原酶的表達(dá)條帶（目標(biāo)蛋白的相對(duì)分子量為57 kD，包括了pET28a載體表達(dá)的His tag片段）。

利用BandScan 5.0軟件分析這些重組菌的總可溶性蛋白的SDS-PAGE圖，可知，重組菌E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的8.49%（圖10中的孔道4），E.coli BL21（pET28a-eryKR1）中EryKR1的表達(dá)量為5.66%（圖10中孔道2），而重組菌E.coli BL21（pET28aeryKR2）（圖11中孔道3）和E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）（圖11中孔道5）中表達(dá)出來的EryKR2分別占全菌可溶性蛋白質(zhì)的5.92%和5.04%。取這些孔道對(duì)應(yīng)的重組菌進(jìn)行后續(xù)的酶活和生物催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原實(shí)驗(yàn)。

圖10 野生型和突變型酮還原酶EryKR1的SDS-PAGE檢測圖

圖11 野生型和突變型酮還原酶EryKR2的SDS-PAGE檢測圖

2.3 野生型和突變型酮還原酶的活性

E.coli BL21（pET28a-eryKR1）、E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）、E.coli BL21（pET28a-eryKR2）和E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）的重組酮還原酶的粗酶液酶活分別為187.02 U/L、192.94 U/L、51.02 U/L和35.43 U/L，其中的蛋白質(zhì)濃度分別為125.73 μg/mL、205.52 μg/mL、138.26 μg/mL和 115.68 μg/ mL，由此得出粗酶液的比酶活分別為1.49 U/mg、0.94 U/mg、0.37 U/mg和0.31 U/mg。根據(jù)野生型或突變型酮還原酶粗酶液的酶活和比酶活數(shù)據(jù)，可知控制立體選擇性還原的位點(diǎn)（motif）處的氨基酸序列LDD突變成PQQ（LDD→PQQ）的突變型EryKR1的比酶活，比起野生型EryKR1的略微有所下降，這說明突變對(duì)酶的活性有所影響。另外，與EryKR1相比，EryKR2當(dāng)以2-甲基環(huán)己酮作為底物時(shí)，酶活較低，而PQQ→LDD的突變型EryKR2與野生型EryKR2的比酶活相較，變化不大。

2.4 雙重組菌耦合催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原實(shí)驗(yàn)

氣相色譜檢測構(gòu)建的四個(gè)重組大腸桿菌分別與E.coli BL21（pET28a-gdh）耦合還原2-甲基環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化液（圖12），根據(jù)底物和產(chǎn)物的峰面積，利用外標(biāo)法計(jì)算底物及產(chǎn)物的濃度，進(jìn)而得出轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物產(chǎn)率及對(duì)映體過量值（e.e值），數(shù)據(jù)見表1，可知：與陰性對(duì)照的轉(zhuǎn)化液中沒有還原產(chǎn)物檢出不同（圖12-E），野生型EryKR1催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原的產(chǎn)物以順式2-甲基環(huán)己醇為主，產(chǎn)率為8.05%，e.e值為58.14%（圖12-A），而突變型EryKR1催化不對(duì)稱還原的產(chǎn)物主要為反式，產(chǎn)率為8.54%，e.e值為27.16%（圖12-B）；野生型EryKR2催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原，產(chǎn)物以反式2-甲基環(huán)己醇為主，產(chǎn)率僅為4.00%，e.e值為8.89%（圖12-C），而突變型EryKR2催化不對(duì)稱還原的產(chǎn)物主要為順式，產(chǎn)率2.94%，e.e值為13.92%（圖12-D），說明EryKR1和EryKR2中分別發(fā)生LDD→PQQ和PQQ→LDD的突變時(shí)，催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原生成的主要產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這擴(kuò)展了LDD 模式序列為酮還原酶中控制鏈?zhǔn)骄弁溋Ⅲw選擇性還原的位點(diǎn)的理論，得出該位點(diǎn)也是控制2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原的模序。

另外，根據(jù)酮還原酶催化鏈?zhǔn)骄弁溋Ⅲw選擇性還原的情況，EryKR1為B型酮還原酶，而EryKR2為A型KR，本研究結(jié)果還擴(kuò)展了該理論，即EryKR1和EryKR2催化含環(huán)己基結(jié)構(gòu)的化合物還原時(shí)形成的主要產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)也是不同的。

3 討論

對(duì)聚酮合成酶的特殊結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制的研究，有助于了解酶的催化、分子識(shí)別及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的分子機(jī)制［11］，其中聚酮合成酶中的酮還原酶如何控制底物的立體選擇性還原的機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。Ⅰ型聚酮合成酶的酮還原酶域（ketoreductase，KR）根據(jù)鏈?zhǔn)骄弁溋Ⅲw選擇性還原的情況分為A型和B型，這兩種KR在第88-103和第134-149個(gè)氨基酸處的兩個(gè)模式序列（motif）有很大區(qū)別。B型KR如EryKR1，在第88-10個(gè)氨基酸處有一個(gè)LDD模式序列，而A型KR如 EryKR2，沒有這個(gè)模式。另外，在第134-149個(gè)氨基酸處，B型KR有個(gè)P144、N148，而A型KR中是W141。若這些位點(diǎn)發(fā)生了突變，酶域?qū)Γ?R，S）-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酸酯的立體選擇性會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，證實(shí)了這些酶域中存在有控制立體選擇性還原的模式序列［4，7，8］。另外，A型和B型KR的晶體結(jié)構(gòu)分析顯示A型KR中的W殘基與B型KR中的LDD序列分別位于這兩種KR的活性中心裂縫的兩側(cè)，說明這兩種類型的KR中底物是從不同的方向被引至酶的活性中心，導(dǎo)致底物中的β-羰基以不同方向結(jié)合NADPH，從而生成不同立體結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物［12］。而且，與B型KR不同，A型KR的活性中心處于一種井然有序、隨時(shí)準(zhǔn)備好催化的Lys-2’-O-核糖-Tyr的氫鍵結(jié)合的狀態(tài)。在底物和輔酶結(jié)合時(shí)，A型KR會(huì)關(guān)閉蓋子環(huán)（lid loop），限制底物只從一個(gè)方向進(jìn)入活性中心，導(dǎo)致生成的產(chǎn)物具有特定的立體結(jié)構(gòu)［13］。在這個(gè)過程中，酶的一些殘基能夠有助于底物的定位［14］。

圖12 雙重組菌耦合還原2-甲基環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化液的氣相色譜檢測圖譜

表1 雙重組菌耦合還原2-甲基環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化液的氣相色譜檢測結(jié)果

聚酮合成酶的酮還原酶域可以還原的底物類型多種多樣，不僅能對(duì)類似天然底物——鏈?zhǔn)骄弁湹聂驶孜镉休^好的還原能力，如（2R，S）-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酯［3］，而且還能以那些結(jié)構(gòu)不同于鏈?zhǔn)骄弁湹幕衔镒鳛榈孜?，如?RS）-反式-1-萘烷酮［3］、脂環(huán)酮［5］等。但是，目前針對(duì)聚酮合成酶酮還原酶域的控制立體選擇性還原的機(jī)理研究，多以（2R，S）-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酸酯、（9RS）-反式-1-萘烷酮為研究底物，對(duì)聚酮合成酶的酮還原酶域?yàn)楹文芙Y(jié)合潛手性取代環(huán)己酮以及如何控制此反應(yīng)的立體選擇性機(jī)理還未見報(bào)道。本研究基于LDD模式序列可能也負(fù)責(zé)控制取代環(huán)己酮類底物的立體選擇性還原的假設(shè)，構(gòu)建了分別異源表達(dá)聚酮合成酶模塊1的酮還原酶（EryKR1）、模塊2的酮還原酶（EryKR2）、LDD殘基替換為PQQ（LDD→PQQ）的EryKR1及PQQ替換為LDD（PQQ→LDD）的EryKR2的重組大腸桿菌，考察了野生型模塊1和模塊2的重組酮還原酶對(duì)2-甲基環(huán)己酮的不對(duì)稱還原能力，結(jié)果顯示在底物濃度為10 mmol/L的條件下，EryKR1的還原產(chǎn)物主要為順式-2-甲基環(huán)己醇，產(chǎn)率為8.05%，e.e值為58.14%，而EryKR2的還原產(chǎn)物主要為反式-2-甲基環(huán)己醇，產(chǎn)率為4.00%，e.e值為8.89%，說明即使以2-甲基環(huán)己酮為底物，模塊1和模塊2的酮還原酶的立體選擇性還原情況也是不同的。通過比較突變前后的重組EryKR1和EryKR2以2-甲基環(huán)己酮為底物的酶活及產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然突變對(duì)酶活的影響不大，但是突變后的重組EryKR1催化還原2-甲基環(huán)己酮的主要產(chǎn)物由突變前的順式-2-甲基環(huán)己醇轉(zhuǎn)變成反式-2-甲基環(huán)己醇，而突變后的重組EryKR2催化的主要還原產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)則由突變前的反式變成了順式，說明酮還原酶催化2-甲基環(huán)己酮還原的主要產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)變化與酶中LDD模式序列的突變之間存在關(guān)聯(lián)，得出LDD模序確實(shí)為酶中控制取代環(huán)己酮類底物立體選擇性還原的位點(diǎn)。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了分別異源表達(dá)聚酮合成酶模塊1的酮還原酶（EryKR1）、模塊2的酮還原酶（EryKR2）、LDD殘基替換為PQQ（LDD→PQQ）的EryKR1和PQQ替換為LDD（PQQ→LDD）的EryKR2的重組大腸桿菌，比較突變型和野生型重組大腸桿菌還原2-甲基環(huán)己酮的主要產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)，得出LDD→PQQ的突變使得EryKR1的主要還原產(chǎn)物從順式-2-甲基環(huán)己醇轉(zhuǎn)變成反式-2-甲基環(huán)己醇，而PQQ→LDD的突變可使EryKR2的主要還原產(chǎn)物2-甲基環(huán)己醇的立體結(jié)構(gòu)由反式變成順式，確定了聚酮合成酶的酮還原酶的LDD模式序列為控制2-甲基環(huán)己酮立體選擇性還原的位點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Mutation of Amino Acid Motif Involved in Stereoselectivity by Ketoreductases and Analysis of Its Product

LI Ling-ling Lü Zao-sheng ZUO Zhen-yu YANG Zhong-hua LIU Yao-ning SONG Cai-wei
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430081）

In order to identify whether LDD motif in ketoreductase domain of polyketide synthase from Saccharopolyspora erythraea（EryKR）can account for the stereocontrol of 2-methylcyclohexanone reduction，we constructed the 4 recombinants，Escherichia coli BL21（pET28a-eryKR1）with heterologous expressing ketoreductase in the first module（EryKR1）of polyketide synthase， E.coli BL21（pET28aeryKR2）with heterologous expressing ketoreductase in the second module（EryKR2）of polyketide synthase，E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）of the site-mutated EryKR1 in which the nucleotide sequence coding for amino acid residues LDD replaced by PQQ，and E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）of the site-mutated EryKR2 while PQQ replaced by LDD. SDS-PAGE demonstrated that ketoreductases were expressed in these 4 recombinants after induction by IPTG. Specific activity of crude enzyme was 1.49 U/mg，0.37 U/mg，0.94 U/mg and 0.31 U/mg，respectively. Gas chromatography analyses of 2-methylcyclohexanone reduction catalyzed by 4 recombinants showed that mutated recombinant E.coli BL21（pET28a-TeryKR1）mainly reduced 2-methylcyclohexanone to trans-2-methylcyclohexanol，unlike the main product of cis-2-methylcyclohexanol catalyzed by wild-type recombinant Escherichia coli BL21（pET28a-eryKR1）. Furthermore，main reduction product of mutant E.coli BL21（pET28a-TeryKR2）was cis-2-methylcyclohexanol，rather than the trans-2-methylcyclohexanol by wild-type recombinant E.coli BL21（pET28a-eryKR2），confirming the key role of LDD motif in controlling the stereoselectivity of 2-methylcyclohexanone reduction.

polyketide synthase；ketoreductase；2-methylcyclohexanone；mutation；stereoselectivity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1195

2017-01-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21376184），湖北省科技廳基金項(xiàng)目（2009CDA006），武漢科技大學(xué)青年科技骨干培育計(jì)劃項(xiàng)目（2016XZ014），武漢科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金研究項(xiàng)目（16ZRA044）

李凌凌，女，博士，副教授，研究方向：生物催化及微生物浸礦技術(shù)；E-mail：moonletsmile@163.com