吳立葉 王國(guó)梁 劉文德

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

稻瘟病菌不同生長(zhǎng)期蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)分析

吳立葉 王國(guó)梁 劉文德

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

精氨酸甲基化是一種廣泛存在于真核生物中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，其主要過(guò)程為蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Protein arginine methyltransferases，PRMTs）催化S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine，SAM）提供的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)精氨酸側(cè)鏈胍基基團(tuán)上。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染水稻引起的稻瘟病，每年均會(huì)為水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。近年來(lái)稻瘟病菌和水稻已成為研究植物病原真菌與寄主植物互作的理想模式生物。生物信息學(xué)分析表明，稻瘟病菌中含有4個(gè)PRMT基因（MoPRMT1-4），經(jīng)蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，它們均含有保守的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，表明稻瘟病菌PRMTs在絲狀真菌中高度保守；通過(guò)提取稻瘟病菌在不同生長(zhǎng)和侵染時(shí)期的mRNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析稻瘟病菌PRMTs基因的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)MoPRMT1在侵染后24 h表達(dá)量達(dá)到最高峰，而其他階段表達(dá)水平基本一致；MoPRMT2與其他3個(gè)基因相比，各階段表達(dá)量均較低，且各時(shí)期表達(dá)水平也沒(méi)有明顯變化；MoPRMT3在芽管和附著胞發(fā)育階段表達(dá)量較高，MoPRMT3和MoPRMT4在成熟附著胞時(shí)期表達(dá)量均達(dá)到最高，MoPRMT4在侵染后42 h也出現(xiàn)表達(dá)峰值。這些數(shù)據(jù)表明PRMTs基因?qū)τ诘疚敛【那秩局虏】赡芷鹬匾{(diào)控作用。

稻瘟病菌；PRMTs；表達(dá)分析

稻瘟病是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的水稻病害之一，每年造成嚴(yán)重的水稻產(chǎn)量損失。該病是由子囊菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染水稻引起的。稻瘟病菌具有許多植物病原真菌生命循環(huán)的重要特點(diǎn)，其侵染過(guò)程和致病分子機(jī)制在絲狀真菌中具有典型性。近年來(lái)稻瘟病菌和水稻已經(jīng)成為研究植物病原真菌與寄主互作的理想模式生物［1，2］。目前，科學(xué)家們對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究日趨深入，而由精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Protein arginine methyltransferases，PRMTs）催化的蛋白質(zhì)精氨酸甲基化近年來(lái)也有很多報(bào)道。蛋白質(zhì)精氨酸甲基化屬于一種典型蛋白質(zhì)翻譯后修飾，廣泛存在于真核細(xì)胞中并調(diào)控蛋白質(zhì)功能。精氨酸甲基化主要分為單甲基化、對(duì)稱和不對(duì)稱雙甲基化3種修飾類型。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化過(guò)程為催化S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine，SAM）提供的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到核質(zhì)蛋白包括組蛋白的精氨酸側(cè)鏈胍基基團(tuán)上。

目前為止，PRMTs基因已在多種生物體基因組序列中得到鑒定。人類含有9種確定的PRMTs，但是推測(cè)可能更多的PRMTs還未被鑒定到［3，4］。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中PRMTs可以分為3種類型：I型PRMT催化形成單甲基精氨酸和不對(duì)稱雙甲基精氨酸，包括PRMT1（主要的I型PRMT），PRMT2，PRMT3，CARM1/PRMT4，PRMT6和 PRMT8；II型 PRMT催化形成單甲基和對(duì)稱雙甲基精氨酸，主要包括PRMT5［5］和PRMT9［6］；III型只能催化胍基基團(tuán)的單甲基化，包括PRMT7［7］。PRMTs參與了眾多不同細(xì)胞水平的調(diào)控，如染色質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、PRMT1、PRMT2、CARM1、PRMT5、PRMT6和PRMT7可以甲基化組蛋白末端［8，9］；核糖體機(jī)制，PRMT3催化40S核糖體蛋白S2［10］；DNA修復(fù)和mRNA剪切［11］。

近年來(lái)，研究表明人的PRMTs與眾多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。常見(jiàn)腫瘤包括前列腺癌和乳腺癌受激素調(diào)控，而PRMTs則是核受體的共激活子，并且可能在腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，過(guò)量表達(dá)PRMT4與不依賴雄性激素的前列腺癌密切相關(guān)［12］，而抑制PRMT1和PRMT4的小分子能夠抑制雌激素和雄激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性［13］。另外，過(guò)量表達(dá)PRMT5能夠促進(jìn)不依賴于停泊位點(diǎn)的細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明PRMT5可能是通過(guò)抑制腫瘤抑制子的表達(dá)來(lái)負(fù)調(diào)控細(xì)胞形態(tài)的變化［14］。同時(shí)，PRMTs也間接地影響著心血管疾病的發(fā)生。Zhang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，靶向PRMT1可能會(huì)恢復(fù)巨核細(xì)胞的頂端分化，進(jìn)而找到治療急性巨核細(xì)胞白血病的有效方法。此外，甲基化水平對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響也是比較敏感。PRMT5可以對(duì)RNA聚合酶II亞基POLR2A羧基端的精氨酸殘基R1810進(jìn)行對(duì)稱地雙甲基化修飾，此修飾可能影響轉(zhuǎn)錄終止進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)退行性疾病［16］。

在釀酒酵母數(shù)據(jù)庫(kù)中只發(fā)現(xiàn)3種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，Hmt1、Hsl7和Rmt2［17］。Hmt1與哺乳動(dòng)物的PRMT1同源，屬于I型PRMT［18］。Hmt1對(duì)于酵母細(xì)胞生長(zhǎng)并非必需，但在NPL3或CBP80突變背景下HMT1缺失會(huì)導(dǎo)致酵母致死［19］；Hsl7與哺乳動(dòng)物PRMT5同源，屬于II型PRMT；Rmt2屬于Ⅳ型精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶［20］，該酶催化精氨酸δ氮原子發(fā)生單甲基化。Rmt2僅在釀酒酵母中被鑒定到，且以顆粒和點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)聚集在酵母細(xì)胞中［21］，其同源物尚未在哺乳動(dòng)物中報(bào)道。HMT1是酵母中主要的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其功能涉及核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄激活和延伸、mRNA剪切和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程［21-23］，底物主要是核不均一核糖核蛋白（hnRNPs），其C端常富含RGG重復(fù)序列并作為精氨酸甲基化位點(diǎn)［24］。

在植物中精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的研究較少，模式植物擬南芥中AtPRMT1a/b與AtPRMT4a/b分別是人PRMT1和PRMT4的同源蛋白，而研究比較清楚的是AtPRMT3、5、10。AtPRMT3突變體致使擬南芥生長(zhǎng)遲緩，并且對(duì)部分氨基糖苷類的抗生素耐受性增強(qiáng)，可以通過(guò)影響前體rRNA加工進(jìn)而控制核糖體生物合成［25］；AtPRMT5的缺失可導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻和晚花等，且與前體mRNA的剪切有關(guān)［26］；AtPRMT10屬于植物特有的I型PRMT，可催化H4R3，與擬南芥開(kāi)花有關(guān)［27］。

在植物病原真菌中PRMT基因也是高度保守的，但是其生物功能在稻瘟菌中尚未報(bào)道。王光輝等［28］2012年初步研究了禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）PRMT的生物學(xué)功能，4種PRMT基因中只有amt1突變體表型明顯，侵染力和毒力都大大降低，而其余3種突變體都與野生型無(wú)明顯差異。構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中已報(bào)道的有3種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，即RmtA、RmtB和RmtC。rmtA，rmtB和rmtC敲除突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖上都沒(méi)有明顯缺陷，但rmtA，rmtC突變體對(duì)過(guò)氧化氫的敏感性增強(qiáng)，且高溫處理下，rmtC突變體菌絲生長(zhǎng)明顯減慢［29］。黃曲霉（Aspergillus flavus）中rmtA的缺失可導(dǎo)致該菌分生孢子數(shù)增加，菌核數(shù)減少，并且影響黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生，進(jìn)一步影響其次級(jí)代謝［30］。白色念珠菌（Candida albicans）中所報(bào)道的與酵母HMT1、RMT2同源的CaHMT1和CaRMT2對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)都沒(méi)有影響，但是CaHMT1是該菌主要的功能性精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶［31］。

然而，精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶是否影響稻瘟病菌的致病性尚未可知。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法確定稻瘟病菌可能的編碼精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最后，通過(guò)熒光定量PCR方法分析稻瘟病菌PRMTs在各個(gè)生育階段的表達(dá)水平，旨為進(jìn)一步研究稻瘟病菌精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用稻瘟病菌Guy11菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物抗病功能基因組保存。

1.2 方法

1.2.1 菌絲的收集 在超凈工作臺(tái)中將干燥保存在濾紙片上的Guy11菌株置于燕麥培養(yǎng)基上，在25℃培養(yǎng)室中倒置暗培養(yǎng)2 d后，再光照培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)好的Guy11用滅菌水涂斷，接種到CM液體完全培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min黑暗條件下培養(yǎng)2 d，過(guò)濾即可得到新鮮菌絲。用濾紙吸干水分后液氮速凍，保存于-80℃待用。

1.2.2 孢子的收集 將Guy11接種到番茄燕麥培養(yǎng)基上，25℃光照培養(yǎng)7-10 d后，用滅菌水將培養(yǎng)基表面的菌絲洗去，晾干后用雙層紗布封口。待光照培養(yǎng)2-3 d后，可用一定量滅菌水充分洗下孢子，miracloth濾布過(guò)濾后，離心濾液即可得到新鮮的孢子。用濾紙吸干水分后液氮速凍，保存于-80℃待用。

1.2.3 附著胞的收集 用血球計(jì)數(shù)板觀察，將孢子懸浮液濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL，均勻噴在人工疏水表面上，25℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)3 h或12 h后卡片刮取，收集水珠，用3層濾紙過(guò)濾后即可收集到不同階段的附著胞。液氮速凍，保存于-80℃待用。

1.2.4 侵染菌絲的收集 用0.01%的Tween20把孢子懸浮液調(diào)至濃度為1×105個(gè)/mL，噴霧接種到大麥一葉平展期葉片背面，25℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)，24 h之后給予光照處理，分別在接種后18 h、24 h和42 h取樣。取樣時(shí)，小心撕下大麥葉片表皮，液氮速凍后，保存于-80℃待用。

1.2.5 RNA提取與qRT-PCR 本實(shí)驗(yàn)采用TRIzol法提取稻瘟病菌Guy11的7個(gè)不同生育階段（營(yíng)養(yǎng)菌絲、分生孢子、3 h/12 h附著胞和18 h/24 h/42 h侵染菌絲）的總RNA，通過(guò)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）獲得cDNA，稀釋后作為qRT-PCR模板。熒光定量PCR引物（表1）使用Primer5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 稻瘟病菌MoPRMTs基因qRT-PCR所用引物

本實(shí)驗(yàn)使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，以稻瘟菌Actin基因MGG_03982為內(nèi)參基因，并由MyiQ2雙色實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）完成，表達(dá)量的計(jì)算按照2-ΔΔCt進(jìn)行［32］。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 在NCBI網(wǎng)站上，利用已發(fā)表的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中3種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列［17］在稻瘟菌數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP搜索，得到4種與酵母PRMTs同源的稻瘟病菌PRMTs；利用ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)；利用同樣方法獲取其他物種中的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶序列；利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

圖1 稻瘟病菌MoPRMTs氨基酸序列比對(duì)分析

2 結(jié)果

2.1 MoPRMTs基因的克隆

根據(jù)釀酒酵母的3種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT1，RMT2和HSL7）的氨基酸序列，搜索比對(duì)（BlastP）稻瘟病菌全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://data.broadins titute.org/annotation/genome/magnaporthe_comparative/ MultiHome.html），得到4種稻瘟病菌精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，基因號(hào)為MGG_04584，MGG_17318，MGG_09290和MGG_03894，分別命名為MoPRMT1，MoPRMT2，MoPRMT3和MoPRMT4。MoPRMT1的cDNA全長(zhǎng)為1 038 bp，編碼一個(gè)含345個(gè)氨基酸的蛋白，與酵母HMT1相似性高達(dá)58%；MoPRMT2亦是同源HMT1而來(lái)，相似性為40%；經(jīng)序列比對(duì)可知，MoPRMT3和MoPRMT4均含有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族特有結(jié)構(gòu)域，且分別與RMT2和HSL7同源，序列相似性分別為37%和27%。

2.2 MoPRMTs基因的生物信息學(xué)分析

每個(gè)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶都包含一段非常保守的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能結(jié)合甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和蛋白底物的子域［33］。利用ClustalW進(jìn)行MoPRMTs氨基酸序列比對(duì)分析 發(fā)現(xiàn)，其保守結(jié)構(gòu)域包括Motif I、Motif Post I、Motif II和Motif III，而THW loop則是PRMTs特有結(jié)構(gòu)域（圖1）。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）來(lái)明確稻瘟病菌4種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶與其他物種中PRMTs的親緣關(guān)系，將稻瘟病菌MoPRMTs編碼的蛋白與人類（Homo sapiens）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、粗 糙 脈 孢 菌（Neurospora crassa） 和 構(gòu) 巢 曲 霉（Aspergillus nidulans）中的同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從進(jìn)化樹(shù)分析可得，釀酒酵母僅含3種PRMTs；稻瘟菌PRMTs同粗糙脈孢菌、禾谷鐮刀菌等絲狀真菌一樣，都含有4種精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，且親緣關(guān)系最近；而在人類基因組中發(fā)現(xiàn)9種PRMTs［6］。

圖2 不同物種PRMTs氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 MoPRMTs基因的表達(dá)分析

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究稻瘟病菌MoPRMTs基因在不同生長(zhǎng)和侵染時(shí)期的表達(dá)水平。分析結(jié)果（圖3）表明，稻瘟病菌中4個(gè) MoPRMTs基因的表達(dá)譜差異較大，且表達(dá)峰值也處于不同時(shí)間點(diǎn)。MoPRMT1在侵染后24 h表達(dá)量達(dá)到最高峰，而其他階段的表達(dá)水平基本一致；有趣的是MoPRMT2，MoPRMT3和MoPRMT4在侵染后24 h幾乎沒(méi)有表達(dá)，而在禾谷鐮刀菌中，與MoPRMT1同源的AMT1，其敲除突變體的致病力明顯下降［28］，可推測(cè)MoPRMT1對(duì)于稻瘟病菌侵染后侵染菌絲的生長(zhǎng)可能起重要作用。

MoPRMT2與其他3個(gè)基因相比，各階段的表達(dá)量都較低，且各時(shí)期的表達(dá)水平也沒(méi)有很明顯的變化；MoPRMT3和MoPRMT4在成熟附著胞時(shí)期表達(dá)量都達(dá)到最高（圖3），由此可推測(cè)，這兩個(gè)基因?qū)τ诟街某墒煊泻苤匾淖饔?，可能與侵染栓的形成密切相關(guān)。此外，MoPRMT3在芽管時(shí)期也有相對(duì)高的表達(dá)，可見(jiàn)MoPRMT3對(duì)于稻瘟病菌附著胞形成也有一定作用；MoPRMT4在侵染后42 h也出現(xiàn)表達(dá)峰值，推測(cè)該基因?qū)τ诘疚敛【秩揪z在寄主體內(nèi)擴(kuò)展起重要作用。

圖3 稻瘟病菌MoPRMTs基因在不同時(shí)期的表達(dá)分析

3 討論

精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化蛋白質(zhì)甲基化修飾在真核生物的多種細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌中含有4個(gè)PRMTs，將稻瘟病菌MoPRMTs基因編碼的蛋白與人類、釀酒酵母、禾谷鐮刀菌、粗糙脈孢菌和構(gòu)巢曲霉中的同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌與禾谷鐮刀菌親緣關(guān)系最近，與人類的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。MoPRMT1和MoPRMT2都與HMT1同源，而MoPRMT3和MoPRMT4分別與RMT2和HSL7同源。

最早研究的是釀酒酵母中的HMT1，HMT1對(duì)酵母的生長(zhǎng)并非必需，但其功能涉及廣泛。HMT1催化的底物主要是hnRNPs，包括Hrp1，Nab2和Npl3等，通過(guò)甲基化hnRNPs組分，進(jìn)而影響前體mRNA修飾，轉(zhuǎn)錄的延伸和終止［34-39］；RMT2主要催化核糖體蛋白R(shí)pl12［40］；Hsl7則對(duì)于出芽酵母的芽頸生長(zhǎng)、磷酸化和Swe1的降解至關(guān)重要［41］。

而禾谷鐮刀菌AMT1則是與HMT1和MoPRMT1同源的關(guān)鍵性精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，AMT1敲除突變體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)減慢，無(wú)性生殖和有性生殖都沒(méi)有變化，對(duì)氧化物和高滲溶液敏感性增加，毒素和侵染力都明顯降低；且定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，調(diào)控hnRNPs組分的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；而其他3種PRMT均無(wú)表型；amt1/amt2雙敲除突變體表型與AMT1相同，說(shuō)明二者不存在功能冗余［28］。在構(gòu)巢曲霉中，rmtA，rmtB和rmtC敲除突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖上都沒(méi)有缺陷［29］。以上真菌中PRMTs的研究結(jié)果可為稻瘟病菌中MoPRMTs基因功能研究提供借鑒。

稻瘟病菌侵染地上部分一般是通過(guò)分生孢子傳播途徑，擴(kuò)散到水稻葉片等組織，在適宜濕度環(huán)境下，分生孢子黏附在水稻葉片表面，依靠其自身營(yíng)養(yǎng)而萌發(fā)形成芽管，繼而芽管再進(jìn)行特異性分化產(chǎn)生具有黑色素的附著胞［42］，附著胞形成侵染栓并穿透葉片等組織的角質(zhì)層和表皮細(xì)胞壁，侵入表皮細(xì)胞。稻瘟病菌侵入后菌絲迅速擴(kuò)展蔓延，在水稻細(xì)胞中生長(zhǎng)并侵染鄰近細(xì)胞進(jìn)而深入葉肉細(xì)胞［43，44］。

在稻瘟病菌的不同發(fā)育階段，4個(gè)MoPRMTs基因的表達(dá)模式和表達(dá)量各不相同。MoPRMT1在24 h侵染菌絲中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他階段，在其他階段表達(dá)量幾乎一致，對(duì)照上述稻瘟病菌侵染過(guò)程，可推測(cè)MoPRMT1在稻瘟病菌侵入寄主細(xì)胞后的生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用；MoPRMT2與其他3個(gè)基因相比，各階段的表達(dá)量都較低，僅在成熟附著胞時(shí)期和侵染后18、24 h表達(dá)量略高；MoPRMT3在芽管和附著胞發(fā)育階段表達(dá)量明顯升高，說(shuō)明該基因可能參與附著胞的形成和成熟；MoPRMT3和MoPRMT4在成熟附著胞時(shí)期表達(dá)量都達(dá)到最高，由此可推測(cè)，二者參與了稻瘟病菌侵入寄主細(xì)胞的關(guān)鍵階段；MoPRMT4在侵染后42 h也出現(xiàn)表達(dá)峰值，推測(cè)該基因?qū)τ诘疚敛【秩揪z在寄主體內(nèi)的擴(kuò)展也可能起重要作用。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)與酵母的3個(gè)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，稻瘟病菌中含有4個(gè)PRMTs。序列比對(duì)分析表明，這4個(gè)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶都含有PRMTs家族保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明，稻瘟病菌PRMTs在絲狀真菌中非常保守，親緣關(guān)系最近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析這4個(gè)PRMTs在稻瘟病菌不同生長(zhǎng)和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜，表明MoPRMT1在侵染后24 h表達(dá)量達(dá)到最高峰，而其他階段的表達(dá)水平基本一致；MoPRMT2與其他3個(gè)基因相比，各階段的表達(dá)量都較低，且各時(shí)期的表達(dá)水平也沒(méi)有很明顯的變化；MoPRMT3在芽管和附著胞發(fā)育階段表達(dá)量明顯較高，MoPRMT3和MoPRMT4在成熟附著胞時(shí)期表達(dá)量都達(dá)到最高，MoPRMT4在侵染后42 h也出現(xiàn)表達(dá)峰值。

［1］Valent B, Chumley FG. Molecular genetic analysis of the rice blast fungus, Magnaporthe grisea［J］. Annual Review of Phytopathology, 1991, 29（29）：443-467.

［2］Dean RA, Talbot NJ, Ebbole DJ, et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea［J］. Nature, 2005, 434（7036）：980-986.

［3］ Petrossian TC, Clarke SG. Uncovering the human methyltransferasome［J］. Molecular & Cellular Proteomics Mcp, 2010, 10（1）：M110. 000976.

［4］Richon VM, Johnston D, Sneeringer CJ, et al. Chemogenetic analysis of human protein methyltransferases［J］. Chemical Biology & Drug Design, 2011, 78（2）：199-210.

［5］Branscombe TL, Frankel A, Lee JH, et al. PRMT5（Janus kinase-binding protein 1）catalyzes the formation of symmetric dimethylarginine residues in proteins［J］. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276（35）：32971-32976.

［6］Yang Y, Hadjikyriacou A, Xia Z, et al. PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145［J］. Nature Communications, 2015, 6：6428.

［7］Zurita-Lopez CI, Sandberg T, Kelly R, et al. Human protein arginine methyltransferase 7（PRMT7）is a type III enzyme forming ω-NG-monomethylated arginine residues［J］. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287（11）：7859-7870.

［8］Lorenzo AD, Bedford MT. Histone arginine methylation［J］. Febs Letters, 2011, 585（13）：2024-2031.

［9］Yang Y, Bedford MT. Protein arginine methyltransferases and cancer［J］. Nature Reviews Cancer, 2012, 13（1）：37-50.

［10］Swiercz R, Cheng D, Kim D, et al. Ribosomal protein rpS2 is hypomethylated in PRMT3-deficient mice［J］. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282（23）：16917-16923.

［11］Bedford MT, Clarke SG. Protein arginine methylation in mammals：who, what, and why［J］. Molecular Cell, 2009, 33（1）：1-13.

［12］Hong H, Kao C, Jeng MH, et al. Aberrant expression of CARM1, a transcriptional coactivator of androgen receptor, in the development of prostate carcinoma and androgen-independent status［J］. Cancer, 2004, 101（1）：83-89.

［13］Cheng D, Yadav N, King RW, et al. Small molecule regulators of protein arginine methyltransferases［J］. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279（23）：23892-23899.

［14］Pal S, Vishwanath SN, Erdjument-Bromage H, et al. Human SWI/SNF-associated PRMT5 methylates histone H3 arginine 8 and negatively regulates expression of ST7 and NM23 tumor suppressor genes［J］. Mol Cell Biol, 2004, 24（21）：9630-9645.

［15］Zhang L, Tran NT, Su H, et al. Cross-talk between PRMT1-mediated methylation and ubiquitylation on RBM15 controls RNA splicing［J］. Elife Sciences, 2015, 4. pii：e07938.

［16］Zhao DY, Gish G, Braunschweig U, et al. SMN and symmetric arginine dimethylation of RNA polymerase II C-terminal domain control termination［J］. Nature, 2015, 529（7584）：48-53.

［17］Sayegh J, Clarke SG. Hsl7 is a substrate-specific type II protein arginine methyltransferase in yeast［J］. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2008, 372（4）：811-815.

［18］ Cimato TR, Tang J, Xu Y, et al. Nerve growth factor-mediated increases in protein methylation occur predominantly at type I arginine methylation sites and involve protein arginine methyltransferase 1［J］. J Neurosci Res, 2002, 67（4）：435-442.

［19］Mcbride AE, Weiss VH, Kim HK, et al. Analysis of the yeast arginine methyltransferase Hmt1p/Rmt1p and its in vivo function. cofactor binding and substrate interactions［J］. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275（5）：3128-3136.

［20］Zobel-Thropp P, Gary JD, Clarke S. Delta-N-Methylarginine is a novel posttranslational modification of arginine residues in yeast proteins［J］. J Biol Chem, 1998, 273（45）：29283-29286.

［21］Bedford MT, Richard S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function［J］. Molecular Cell, 2005, 18（3）：263-272.

［22］Boisvert F, Chénard CA, Richard S. Protein interfaces in signaling regulated by arginine methylation［J］. Sci STKE, 2005, 2005（271）：re2.

［23］Yu MC, Bachand F, Mcbride AE, et al. Arginine methyltransferase affects interactions and recruitment of mRNA processing and export factors［J］. Genes & Development, 2004, 18（16）：2024-2035.

［24］Shen EC, Henry MF, Weiss VH, et al. Arginine methylation facilitates the nuclear export of hnRNP proteins［J］. Genes & Development, 1998, 12（5）：679-691.

［25］Hang R, Liu C, Ahmad A, et al. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111（45）：16190-16195.

［26］ Deng X, Dean C. Arginine methylation mediated by the Arabidopsis homolog of PRMT5 is essential for proper pre-mRNA splicing［J］. Proc Natl Acad Sci, 2010, 107（44）：19114-19119.

［27］Niu L, Lu F, Pei Y, et al. Regulation of flowering time by the protein arginine methyltransferase AtPRMT10［J］. Embo Reports, 2007, 8（12）：1190-1195.

［28］ Wang G, Wang C, Hou R, et al. The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum［J］. PLoS One, 2012, 7（5）：e38324.

［29］ Bauer I, Graessle S, Loioll P, et al. Novel insights into the functional role of three protein arginine methyltransferases in Aspergillus nidulans［J］. Fungal Genet Biol, 2010, 47：551-561.

［30］ Satterlee T, Cary JW, Calvo AM. RmtA, a putative arginine methyltransferase, regulates secondary metabolism and development in Aspergillus flavus［J］. PLoS One, 2016, 11：e0155575.

［31］Mcbride AE, Zuritalopez C, Regis A, et al. Protein arginine methylation in Candida albicans：role in nuclear transport［J］. Eukaryotic Cell, 2007, 6：1119-1129.

［32］Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））method［J］. Methods, 2001, 25（4）：402-408.

［33］Bachand F. Protein arginine methyltransferases：from unicellular eukaryotes to humans［J］. Eukaryotic Cell, 2007, 6：889-898.

［34］Green DM, Marfatia KA, Crafton EB, et al. Nab2p is required for poly（A）RNA export in Saccharomyces cerevisiae and is regulated by arginine methylation via Hmt1p［J］. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277（10）：7752-7760.

［35］Kessler MM, Henry MF, Shen E, et al. Hrp1, a sequence-specific RNA-binding protein that shuttles between the nucleus and the cytoplasm, is required for mRNA 3'-end formation in yeast［J］. Genes & Development, 1997, 11（19）：2545-2556.

［36］González CI, Ruiz-Echevarría MJ, Vasudevan S, et al. The yeast hnRNP-like protein Hrp1/Nab4 marks a transcript for nonsensemediated mRNA decay［J］. Mol Cell, 2000, 5（3）：489-499.

［37］Gross S, Moore CL. Rna15 interaction with the a-rich yeast polyadenylation signal is an essential step in mRNA 3'-end formation［J］. Mol Cell Biol, 2002, 21（23）：8045-8055.

［38］Hector RE, Nykamp KR, Dheur S, et al. Dual requirement for yeast hnRNP Nab2p in mRNA poly（A）tail length control and nuclear export［J］. Embo Journal, 2002, 21（7）：1800-1810.

［39］Wong CM, Tang HMV, Kong KYE, et al. Yeast arginine methyltransferase Hmt1p regulates transcription elongation and termination by methylating Npl3p［J］. Nucleic Acids Research, 2010, 38（7）：2217-2228.

［40］Chern MK, Chang KN, Liu LF, et al. Yeast ribosomal protein L12 is a substrate of protein-arginine methyltransferase 2［J］. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277（18）：15345-15353.

［41］Kucharczyk R, Gromadka R, Migdalski A, et al. Disruption of six novel yeast genes located on chromosome II reveals one gene essential for vegetative growth and two required for sporulation and conferring hypersensitivity to various chemicals［J］. Yeast, 1999, 15（10B）：987-1000.

［42］Howard RJ, Bourett TM, Ferrari MA. Infection by magnaporthe：an in vitro analysis［M］. Electron Microscopy of Plant Pathogens, 1991：251-264.

［43］Heath MC, Valent B, Howard RJ, et al. Correlations between cytologically detected plant-fungal interactions and pathogenicity of Magnaporthe grisea toward weeping lovegrass［J］. Phytopathology, 1990, 80（12）：1382-1386.

［44］Heath MC, Valent B, Howard RJ, et al. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass［J］. Can J Bot, 2011, 68（8）：1627-1637.

（責(zé)任編輯 李楠）

Expression Analysis of Protein Arginine Methyltransferase Genes in Magnaporthe oryzae

WU Li-ye WANG Guo-liang LIU Wen-de
（Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

Arginine methylation is a kind of post-translational modifications existing widely in eukaryotes，of which the main process is to transfer methyl groups provided by S-adenosylmethionine（SAM）to the guanidino group of protein arginine side chain while catalyzed by protein arginine methyltransferases（PRMTs）. Rice blast fungus（Magnaporthe oryzae）infects rice under the suitable conditions，causing severe rice blast and resulting in serious loss of rice yield per year. In recent years，rice blast fungus and rice have already become the ideal model for the study of interaction between plant pathogenic fungi and their host plants. Bioinformatics analysis showed that the rice blast fungus contained four PRMT genes（MoPRMT1-4），and PRMTs protein sequence alignment revealed that they contained conservative methyltransferase domains. The PRMTs were demonstrated to be very conservative in filamentous fungi through phylogenetic tree analysis. Extracting the mRNAs of MoPRMT1-4 at various growth and infection stages，we used real time fluorescence quantitative PCR to analyze the expression profiles of the genes，and discovered that the expression of MoPRMT1 reached peak at 24 h post infection，while almost the same at other stages. Compared with other three genes，the expression of MoPRMT2 was low and showed no obvious variation at each stage. MoPRMT3 expressed in high level at germ tube and appressorium developmental stages，while both MoPRMT3 and MoPRMT4 reached peak expressions at mature appressorium stage，and MoPRMT4 also presented peak at 42 h post infection. These data implied that PRMTs genes may play an important regulation role in the pathogenicity of M. oryzae.

Magnaporthe oryzae；PRMTs；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1142

2016-12-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31422045）

吳立葉，碩士，研究方向：分子植物病理學(xué)；E-mail：wuliye001@126.com

劉文德，博士，研究員，研究方向：分子植物病理學(xué)；E-mail：wendeliu@126.com