劉玉彪 許馨 曹山虎 孫紹光

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，石家莊 050017）

技術(shù)與方法

基因編輯技術(shù)最新研究進(jìn)展

劉玉彪 許馨 曹山虎 孫紹光

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，石家莊 050017）

基因編輯是一種對(duì)基因組及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定點(diǎn)修飾、定向敲除或插入目的基因的基因編輯技術(shù)。近年來(lái)，基因編輯技術(shù)發(fā)展日新月異，不僅極大的推動(dòng)了基因功能研究進(jìn)程，同時(shí)為人類(lèi)遺傳疾病的治療帶來(lái)了曙光。綜述了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、Ago/gDNA和SGN等技術(shù)的作用原理、優(yōu)缺點(diǎn)、應(yīng)用等，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考。

基因編輯；CRISPR/Cas9；CRISPR/Cpf1；Ago/gDNA；Structure-guided Nuclease

基因編輯技術(shù)是一種可以對(duì)基因組或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行精確修飾的技術(shù)，可完成基因定點(diǎn)突變、片段的敲除或敲入等。在后基因組時(shí)代，基因編輯技術(shù)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容。傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)以胚胎干細(xì)胞和基因重組為基礎(chǔ)進(jìn)行生物基因組定向修飾，但是該技術(shù)存在打靶效率低，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)及應(yīng)用范圍窄等缺點(diǎn)［1，2］。隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，人工核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)開(kāi)始被廣泛應(yīng)用，該技術(shù)通過(guò)特異性地識(shí)別并裂解靶DNA雙鏈，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)基因定向改造，與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)打靶效率高、構(gòu)建成本低、應(yīng)用范圍廣，極大地促進(jìn)了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)程［3，4］。目前基因組編輯新技術(shù)主要包括以下幾種：人工核酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）技術(shù)［5，6］、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effectors nuclease，TALEN） 技 術(shù)［7］、成簇規(guī)律的間隔短回文重復(fù)相關(guān)蛋白9核酸酶（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein-9 nuclease，CRISPR/Cas9）技術(shù)、CRISPR/Cpf1技術(shù)、Ago/gDNA技術(shù)以及結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的核酸酶（Structure-guided nuclease，SGN）技術(shù)?，F(xiàn)對(duì)上述幾種新型技術(shù)的作用原理、優(yōu)缺點(diǎn)、應(yīng)用等進(jìn)行比較分析。

1 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9從對(duì)真菌和古菌宿主免疫防御研究的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，屬于CRISPR/Cas蛋白家族中的Ⅱ型，該系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，僅由Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA及RNaseⅢ 4種成分組成［8］。其中Cas9蛋白本身既具有核酸內(nèi)切酶活性，又能與tracrRNA：crRNA復(fù)合物結(jié)合，該蛋白含有兩個(gè)獨(dú)特的活性位點(diǎn)，分別是位于氨基末端的RuvC和蛋白中部的HNH，這兩個(gè)位點(diǎn)在crRNA的成熟及雙鏈DNA的剪切過(guò)程中發(fā)揮重要作用。反式激活crRNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）與pre-crRNA的重復(fù)序列互補(bǔ)，在pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時(shí)轉(zhuǎn)錄出來(lái)，且促使Cas9利用其活性位點(diǎn)對(duì)pre-crRNA進(jìn)行加工。另外，RNaseⅢ核酸酶也參與pre-crRNA的加工剪切過(guò)程。加工得到的crRNA與tracrRNA形成tracrRNA：crRNA復(fù)合物并結(jié)合于Cas9蛋白組成CRISPR/Cas9系統(tǒng)，tracrRNA：crRNA復(fù)合物引導(dǎo)Cas9識(shí)別靶序列DNA的PAM序列，隨后crRNA與互補(bǔ)鏈結(jié)合形成RNA：DNA雜合鏈；另一條非互補(bǔ)DNA鏈游離，最后由Cas9蛋白的RuvC和HNH位點(diǎn)分別切割互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈進(jìn)而引入DNA雙鏈斷裂，然后通過(guò)體內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制將DNA雙鏈修復(fù)完整，目前的CRISPR/Cas9通常將用人工設(shè)計(jì)的sgRNA替換tracrRNA：crRNA復(fù)合物（圖1-A）。盡管Cas9蛋白分子量較大且長(zhǎng)短不一，但都是用Ruvc核酸酶結(jié)構(gòu)域和HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域行使切割靶序列的功能，使靶DNA雙鏈斷裂［9，10］，這樣大大降低了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)難度。

由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建簡(jiǎn)單、成本低廉，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和動(dòng)物模型的快速制備、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及遺傳性疾病的治療等。Niu等［11］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功對(duì)食蟹猴進(jìn)行了精確的基因編輯，在該項(xiàng)研究中，實(shí)驗(yàn)人員以食蟹猴胚胎中的Nr0b1、Ppar-r和Rag1等基因作為靶位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ppar-r和Rag1出現(xiàn)突變，隨后經(jīng)代孕生出的子代孿生猴也被證實(shí)存在Ppar-r和Rag1基因突變。Liang等［12］利用CRISPR/Cas9成功編輯人類(lèi)三核受精卵中的地中海貧血相關(guān)基因HBB，這也是首次發(fā)表有關(guān)人類(lèi)基因編輯的研究。研究選取了54個(gè)三核受精卵（其發(fā)育止步于囊胚階段無(wú)法發(fā)育為人類(lèi)胚胎）樣本作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中28個(gè)樣本中的HBB基因被成功編輯，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)某些樣本出現(xiàn)了脫靶突變。Kang等［13］利用CRISPR/Cas9對(duì)人類(lèi)三核受精卵引入CCR5 23基因突變，以期建立受試樣本對(duì)HIV的免疫力。結(jié)果表明，26個(gè)胚胎中的4個(gè)成功獲得改造，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。Zhu等［14］利用配對(duì)導(dǎo)向RNA（Paired-guided RNA，pgRNA）和CRISPR/Cas9，在全基因組范圍內(nèi)對(duì)人源肝癌細(xì)胞中的近700個(gè)疾病相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）進(jìn)行基因敲除研究。Lu等首次將CRISPR/Cas9用于臨床人體試驗(yàn)，研究人員利用CRISPR/Cas9對(duì)從肺癌患者血液中分離出的免疫細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，靶向失活其PD-1蛋白，隨后又將編輯過(guò)的免疫細(xì)胞重新注入患者體內(nèi)用來(lái)觀察人體對(duì)免疫細(xì)胞的反應(yīng)［15］。目前該研究尚處于初步階段，后續(xù)的研究還將陸續(xù)展開(kāi)。

2 CRISPR/Cpf1

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)無(wú)疑為整個(gè)基因編輯領(lǐng)域帶來(lái)了一場(chǎng)技術(shù)革命，然而張鋒團(tuán)隊(duì)并不滿(mǎn)足于CRISPR/Cas9系統(tǒng)尚不完美的現(xiàn)狀，繼續(xù)在CRISPR家族內(nèi)尋找更加完善的基因編輯工具酶，最終發(fā)現(xiàn)了基因編輯效率較高的Cpf1蛋白，它屬于CRISPR/Cas蛋白家族的Ⅴ型［16］。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中的Cpf1蛋白為三角形單體［17］，具有結(jié)合crRNA和切割靶序列的能力。與CRISPR/Cas9系統(tǒng)不同，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中crRNA的形成不需要tracrRNA和RNaseⅢ核酸酶的參與。成熟的crRNA一部分形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合于Cpf1蛋白的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，發(fā)卡結(jié)構(gòu)對(duì)于靶序列的切割過(guò)程具有重要意義；另一部分通過(guò)堿基互補(bǔ)的方式結(jié)合靶序列從而引導(dǎo)Cpf1到達(dá)靶序列并進(jìn)行切割。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)識(shí)別靶序列DNA的過(guò)程同樣需要PAM序列的存在，切割靶序列后留下長(zhǎng)度為5 nt的黏性末端，最終通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)［16］（圖1-B）。

CRISPR/Cpf1系統(tǒng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)的差別主要體現(xiàn)在：（1）天然的CRISPR/ Cpf1系統(tǒng)在組成上更加簡(jiǎn)單，僅僅包含一條42 nt的crRNA，另外Cpf1蛋白比Cas9蛋白要小，使其更易于被設(shè)計(jì)和輸送至細(xì)胞內(nèi)；（2）CRISPR/Cpf1系統(tǒng)以一種不同的方式切割靶DNA。CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割靶DNA雙鏈后留下的“平末端”在修復(fù)時(shí)容易發(fā)生突變，因此嚴(yán)格來(lái)講，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)靶基因?qū)嵭械氖瞧茐亩皇蔷庉?，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)則在切割靶DNA后留下“黏性末端”，這可能有助于外源DNA片段的精確整合，從而實(shí)現(xiàn)真正意義上的基因組編輯；（3）與CRISPR/Cas9系統(tǒng)類(lèi)似，CRISPR/ Cpf1系統(tǒng)對(duì)靶DNA的識(shí)別同樣依賴(lài)PAM序列的存在［18］，不過(guò)Cas9系統(tǒng)識(shí)別的是前間隔序列3'端的NGG PAM序列，而Cpf1系統(tǒng)識(shí)別前間隔序列5'端TTN PAM序列；（4）CRISPR/ Cpf1系統(tǒng)會(huì)在距離識(shí)別位點(diǎn)較遠(yuǎn)的位置進(jìn)行切割，這為研究人員提供了更多的編輯位點(diǎn)。同時(shí)，已有研究證明CRISPR/ Cpf1系統(tǒng)的脫靶率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CRISPR/ Cas9系統(tǒng)［19］。

圖1 CRISPR/Cas9［8］、CRISPR/Cpf1［16］、Ago/gDNA［24，25］和SGN［37］作用原理

3 Ago/gDNA

Argonaute（Ago）是一個(gè)高度保守的蛋白家族，廣泛存在于幾乎所有物種體內(nèi)，作為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silenceing complex，RISC）的主要成分，在如RNA干擾、microRNA及piRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后沉默等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［20-22］。研究發(fā)現(xiàn)，某些原核生物Ago，如 TtAgo和PfAgo［20-25］，可以通過(guò)小干擾核酸gDNA介導(dǎo)外源基因（外源性質(zhì)?；蚴删w）的表達(dá)抑制。TtAgo以長(zhǎng)度13-25 nt，5'P-gDNA為向?qū)?，靶向切割外源性單鏈DNA或雙鏈DNA；PfAgo通過(guò)結(jié)合長(zhǎng)度15-31 nt，5'P-gDNA引起外源性基因靶向突變（圖1-C）。但無(wú)論TtAgo還是PfAgo都只在65℃才能進(jìn)行反應(yīng)，無(wú)法在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮作用［24，25］。

Gao等［26］發(fā) 現(xiàn) Natronobacterium gregoryi 中的Ago蛋白（NgAgo）與TtAgo和PfAgo同源性較高，并用實(shí)驗(yàn)證明NgAg/gDNA能夠在人類(lèi)細(xì)胞中發(fā)揮DNA編輯功能。不過(guò)，Qi等［27］研究表明，利用NgAgo/gDNA技術(shù)的確能夠降低靶基因fabp11a表達(dá)水平，進(jìn)而影響斑馬魚(yú)眼睛的正常發(fā)育。但測(cè)序結(jié)果表明，fabp11a基因并未發(fā)生改變，而只是其mRNA的表達(dá)量下降。同樣，對(duì)斑馬魚(yú)的ta、kdrl、lamal和flt1等基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NgAgo/gDNA帶來(lái)的表型改變均與基因編輯無(wú)關(guān)?；谝陨蠑?shù)據(jù)，研究人員推測(cè)NgAgo/gDNA可能通過(guò)基因敲減而非基因編輯發(fā)揮其調(diào)控作用。與此同時(shí)，Burgess等［28］20余名科學(xué)家聯(lián)名發(fā)文聲稱(chēng)，按照Gao等論文中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，未能發(fā)現(xiàn)NgAgo的基因編輯作用。Lee 等［29］3個(gè)研究團(tuán)隊(duì)也同樣表示，無(wú)法在Hela、HEK293T及U20S等人類(lèi)細(xì)胞系中檢測(cè)到NgAgo/gDNA的基因編輯現(xiàn)象。

4 SGN

在過(guò)去幾年中，以ZFN和TALEN為代表的序列特異性核酸酶技術(shù)以其能夠高效率地進(jìn)行定點(diǎn)基因組編輯，在基礎(chǔ)研究、遺傳改良和基因治療等方面展示出巨大的潛力。不過(guò)，由于鄰近序列效應(yīng)的存在［30-32］，導(dǎo)致ZFN技術(shù)脫靶現(xiàn)象較為嚴(yán)重；而TALEN技術(shù)中類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物與堿基一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系在一定程度上降低了脫靶率，但由于TALEN的組裝與模塊化設(shè)計(jì)過(guò)程繁瑣，極大的限制了其推廣應(yīng)用。ZFN與TALEN都依賴(lài)FokⅠ核酸內(nèi)切酶的存在，F(xiàn)okⅠ是一種存在于細(xì)菌Flavobacterium okeanokoites體內(nèi)的ⅡS型限制性核酸內(nèi)切酶，含有一個(gè)DNA結(jié)合區(qū)和一個(gè)DNA切割區(qū)。其中ZFN技術(shù)利用鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）可以通過(guò)DNA-蛋白質(zhì)的原理特異性識(shí)別DNA序列的特點(diǎn)，研究人員將鋅指DNA結(jié)合區(qū)與限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割區(qū)進(jìn)行融合，鋅指DNA結(jié)合區(qū)負(fù)責(zé)特異性識(shí)別靶序列，F(xiàn)okⅠ則負(fù)責(zé)對(duì)靶序列進(jìn)行切割；在TALEN技術(shù)中，負(fù)責(zé)切割靶序列DNA的功能元件仍是FokⅠ核酸酶的切割區(qū)，只不過(guò)將特異性識(shí)別靶序列的定位元件替換成了一段人造的TALE［9，33］。片狀核酸內(nèi)切酶1（Flap endonulease Ⅰ，F(xiàn)ENⅠ）是擁有5'片狀核酸內(nèi)切酶、缺口依賴(lài)性核酸內(nèi)切酶及核酸外切酶三種酶切活性，可以對(duì)DNA復(fù)制和修復(fù)途徑中的多種中間產(chǎn)物進(jìn)行加工，在岡崎片段成熟長(zhǎng)片段堿基切除修復(fù)和端粒維持中發(fā)揮重要作用［34-36］。

最近，研究人員通過(guò)連接子將FokⅠ和FENⅠ進(jìn)行組裝，設(shè)計(jì)出了一種新型的基因組DNA編輯工具SGN，并成功將其應(yīng)用于斑馬魚(yú)的基因組DNA編輯［37］。SGN的作用原理如下：設(shè)計(jì)gDNA與靶序列DNA鏈雜化并形成3'片瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)，隨后SGN的靶向部分FENⅠ特異性識(shí)別這一特殊結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)SGN與靶序列的切割位點(diǎn)（距離gDNA 3'端9-10 nt）結(jié)合進(jìn)而對(duì)靶序列實(shí)施切割，最后通過(guò)DNA修復(fù)機(jī)制對(duì)斷裂的雙鏈進(jìn)行修復(fù)（圖1-D）。研究人員利用SGN成功突變了斑馬魚(yú)的Znf703和Cyp26b1 基因，其中Znf703的突變率為1.04%，被切割的片段為754 bp，另外下游序列還有11 bp被刪除；Cyp26b1的突變率為10.3%，被刪除的堿基片段則多達(dá)2 610 bp。與上述幾種基因編輯技術(shù)顯著不同，SGN對(duì)靶序列的切割是大段的，原因可能是：SGN識(shí)別切割靶DNA序列后產(chǎn)生缺口，而SGN中的FENⅠ能夠識(shí)別缺口結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)SGN對(duì)含有缺口結(jié)構(gòu)的DNA鏈進(jìn)行持續(xù)切割，最終產(chǎn)生大片段的序列缺失。

5 展望

表1 CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf、Ago/sgDNA和SGN的比較［38］

表1匯總比較了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf、Ago/gDNA和SGN等4種技術(shù)的特點(diǎn)。CRISPR/Cas9作為基因編輯工具，一經(jīng)問(wèn)世便受到了基因編輯領(lǐng)域科研工作者的追捧，短短幾年時(shí)間就已經(jīng)發(fā)展得相當(dāng)成熟，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到多個(gè)物種體內(nèi)并取得了相當(dāng)可觀的成就，而且人類(lèi)已經(jīng)邁出了將CRISPR/ Cas9應(yīng)用于臨床治療的第一步。為了克服脫靶效應(yīng)獲得更高的基因編輯效率，科研人員對(duì)CRISPR/Cas9的研究和改進(jìn)工作仍在進(jìn)行中。CRISPR/Cpf1被認(rèn)為是CRISPR/Cas9的升級(jí)版，在結(jié)構(gòu)組成上及切割方式上的優(yōu)勢(shì)使其具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。SGN沿用了第一、二代基因編輯技術(shù)的功能元件FokⅠ，但在靶向元件設(shè)計(jì)方面獨(dú)具匠心，選用了識(shí)別特異性結(jié)構(gòu)的FENⅠ。不過(guò)就目前的研究來(lái)看，SGN的基因編輯效率較低，而且其裂解靶序列后留下的大片段缺失會(huì)造成后續(xù)DNA修復(fù)困難，脫靶效應(yīng)是否存在還有待考證。目前的研究表明，Ago/gDNA系統(tǒng)還無(wú)法用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因編輯，建議繼續(xù)進(jìn)行以下嘗試：可以對(duì)TtAgo和PfAgo的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使其可以在37℃下工作。另外，可以繼續(xù)從非嗜熱菌中發(fā)掘可以進(jìn)行基因編輯的Ago蛋白?；蚓庉嫾夹g(shù)極大地推動(dòng)了整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究。隨著對(duì)各種基因編輯工具的不斷改進(jìn)，人們對(duì)生命奧秘的研究也更加深入，不過(guò)想要真正將其應(yīng)用于臨床治療造福人類(lèi)還需做出更多的努力。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progresses in Gene Editing Techniques

LIU Yu-biao XU Xin CAO Shan-hu SUN Shao-guang
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，Basic Medicine College，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017）

Gene editing is a powerful set of techniques for site-directed modification and knockout or insertion of the genes on genome or its transcripts. Recently，gene editing techniques have been greatly developed，which not only significantly promotes the process of gene function investigation，but also shows the potential applications for human genetic disease treatments. Here，we summarized the principles，advantages，disadvantages，and applications of gene editing methods including CRISPR/Cas9，CRISPR/Cpf1，Ago/gDNA and SGN in order to provide necessary informations on gene editing for the relevant scientific research.

Gene editing；CRISPR/Cas9；CRISPR/Cpf1；Ago/gDNA；Structure-guided Nuclease

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-1168

2016-12-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81670273，81200215），河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究?jī)?yōu)秀青年基金項(xiàng)目（YQ2013023），河北省高層次人才資助項(xiàng)目（A2016002073），河北醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（USIP2016026）

劉玉彪，男，學(xué)士，研究方向：臨床醫(yī)學(xué)；E-mail：937380903@qq.com

孫紹光，男，博士，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：sunshaoguang00@163.com