李石清宋潔，2張春椿張水利張婷#許健

1 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

2 復旦大學 上海 200433

實驗研究

參附注射液對慢性心衰大鼠心功能及心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響*

李石清1宋潔1，2張春椿1張水利1張婷1#許健1

1 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

2 復旦大學 上海 200433

參附注射液 慢性心衰 鈣離子 心功能 實驗研究

本實驗主要研究參附注射液對慢性心衰大鼠心功能及心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，探討參附注射液改善心衰的機制，以期為臨床應用提供更有力的實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料：雄性SD大鼠30只，體重200±20g[寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心，動物批號：SVXK(寧)2011-0001]；參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字Z20043117，批號：140106050）；0.9%氯化鈉注射液（第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院）；Ca2+熒光試劑Fluo-3/ AM、咖啡因（Sigma，美國）；II型膠原酶（Worthington，美國）；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器：ALC-V8動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司），UC-6超薄切片機（德國Leica公司），1/10000精密電子分析天平、Delta 320-S型PH計（Mettler Toledo公司），JB-90-1型磁力攪拌器（上海天平儀器廠），H-7650透射電子顯微鏡（日本HITACHI公司），Acuson sequoia 512高頻超聲診斷儀（德國西門子公司），LeicaTCSSP2激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica公司），HL-2型恒流泵（上海滬西分析儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 慢性心衰大鼠模型制備及分組：采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立大鼠慢性心衰模型[1]。成年雄性SD大鼠采用氣體麻醉機麻醉，沿胸骨左緣第3、4肋間開胸，暴露心臟打開心包，在左心耳和肺動脈圓錐之間用5/0無損傷縫合針結(jié)扎左冠脈前降支，進針深度控制在0.1cm，注意避免心肌撕裂。肉眼可見左心室前壁顏色變白，標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高，即為結(jié)扎成功，立即將心臟送回胸腔，排盡胸腔空氣，再對胸腔逐層縫合，閉合胸腔，自然清醒后飼養(yǎng)。將造模成功大鼠隨機分為心力衰竭組（CHF）和參附注射液（SFI）處理組，每組10只。另設假手術(shù)組（Sham組），10只，除只穿線不結(jié)扎冠脈外，其余步驟一致。參附注射液處理組用6ml/kg參附注射液腹腔注射給藥，假手術(shù)組和心力衰竭組給予同等劑量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 超聲心動指標測定：采用Acuson sequoia 512高頻超聲診斷儀，探頭頻率8.5MHZ，掃描速度100mm/s。氣體麻醉機麻醉大鼠，連續(xù)測3個心動周期的左室前壁舒張末期厚度（LVAWd）、左室前壁收縮末期厚度（LVAWs）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、左室后壁收縮末期厚度（LVPWs）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室射血分數(shù)（LVEF），取其平均值。

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察：按照常規(guī)透射電鏡樣品制備技術(shù)制樣[2]，取心臟部分心肌組織，經(jīng)前固定、漂洗、后固定、脫水、浸透、包埋、修片、切片及染色后，置于透射電子顯微鏡下觀察，拍照記錄其超微結(jié)構(gòu)。

2.4 單個心室肌細胞的分離：采用標準酶解分離技術(shù)得到心力衰竭組和假手術(shù)組單個心室肌細胞[3]，雄性SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，迅速開胸取出心臟掛于Langendorff逆行性灌流系統(tǒng)，游離主動脈行主動脈插管，分別用無鈣臺式液和含72mmol/L Ca2+、0.6mg/mlⅡ型膠原酶和2mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)的臺式液逆向灌流，消化終點以心臟變軟等現(xiàn)象為標準；剪下心室組織，在37℃Kraft-Bruhe（KB）液中將其剪碎，并用廣口吸管吹打1min，200目尼龍網(wǎng)過濾后，室溫沉淀10min，棄上清液，KB液重懸，室溫靜置1～2h后備用。

2.5 熒光染色及分組給藥：將靜置后的心肌單細胞先與鈣熒光指示劑Fluo-3/AM(10μmol/L)室溫避光孵育30min，然后用KB液漂洗3次，每次10min。室溫放置30min后置于含細胞外液的細胞池中，胞外灌流10min。參附注射液（SFI）隨胞外灌流液作用于心肌細胞，分別按0、1.25%SFI、2.5%SFI、5%SFI和10%SFI與細胞外液混合，每組重復6次。

2.6 大鼠心肌細胞鈣釋放峰值實驗：采用Leica TCSSP2激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)光采用5%的低能量，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長505nm。掃描頻率為400Hz，每條線包含1024個像素，采樣速率為2ms/線。物鏡為40倍油鏡，數(shù)值孔徑值（NA）為1.25。選擇合適的心肌細胞（橫紋清晰，桿狀，表面干凈平整，無自發(fā)收縮等），掃描線與細胞縱軸平行且位于垂直切面中間，掃描5秒后，給予咖啡因刺激測得肌漿網(wǎng)（SR）內(nèi)可釋放的鈣容量。圖像處理采用自編的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像處理軟件。鈣瞬變（ACT）的強弱以標準熒光強度的凈變化即#F/F0=(F-F0)/F0表示，其中F表示某一時間點的熒光強度，F(xiàn)0表示本底熒光強度[4]。

2.7 統(tǒng)計學方法：采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件包進行分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 心衰模型相關(guān)心功能指標的測定：雄性成年SD大鼠行冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)后，肉眼可見左心室前壁顏色變白，標準肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖顯示術(shù)后心電圖ST段抬高，造模成功。4周后，高頻超聲診斷儀測定心功能相關(guān)指標。見表1。

表1 大鼠心功能指標的測定（±s，n=10）

注：與Sham組比較，**P＜0.01；與CHF組比較，##P＜0.01。

組別Sham組CHF組SFI組LVAWd(mm) 1.98±0.24 1.48±0.24**1.89±0.19##LVAWs(mm) 3.41±0.39 2.00±0.29**2.72±0.37##LVPWd(mm) 2.01±0.29 1.70±0.19**1.95±0.21##LVPWs(mm) 3.56±0.35 2.25±0.39**2.81±0.20##LVIDd(mm) 7.34±0.40 9.20±0.65**4.89±0.72##LVIDs(mm) 3.80±0.25 6.70±0.78**4.89±0.72##LVFS(%) 84.13±0.94 57.75±7.11**72.93±1.07##LVEF(%) 48.11±1.07 27.12±4.45**37.48±0.86##

3.2 參附注射液對慢性心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響：各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，Sham組大鼠心肌肌纖維整齊排列，肌絲之間的線粒體結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部嵴清晰可見，未見腫脹或破裂（圖1a）。CHF組大鼠心肌出現(xiàn)大面積肌絲溶解、斷裂、松散，大部分肌絲排列疏松并且有出現(xiàn)錯位，線粒體電子密度增大，一部分線粒體的嵴結(jié)構(gòu)模糊不清，且出現(xiàn)溶解現(xiàn)象（圖1b）。SFI組大鼠心肌肌絲結(jié)構(gòu)排列整齊，可見輕度溶解，線粒體結(jié)構(gòu)完整，大部分嵴結(jié)構(gòu)完整可見（圖1c）。

3.3 單個心室肌細胞的分離：本實驗中，剛分離下的心肌細胞存活率達80%左右，在顯微鏡下觀察，細胞呈長桿狀，Z線清晰，橫紋分明。見圖2。

3.4 參附注射液對心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響：靜息狀態(tài)下肌漿網(wǎng)（SR）內(nèi)鈣容量可通過咖啡因誘發(fā)的鈣瞬變（CCT）來衡量[3]。心肌細胞經(jīng)Fluo-3/AM孵育處理，以噴射咖啡因前作為本底熒光對照，采用激光掃描共聚焦顯微鏡線掃描模式記錄單個心肌細胞SR內(nèi)的鈣容量。重復6次取平均值，得到表2。結(jié)果顯示，CHF組較Sham組熒光強度及熒光強度變化的平均值（ΔF/F0）均明顯降低（P＜0.01）（圖3b）。SFI組各濃度處理后的CHF大鼠與不處理（0 SFI組）相比，大鼠心肌細胞的熒光強度及平均值（ΔF/F0）均顯著增加（P＜0.01，P＜0.05），且呈濃度依賴性（圖3b）；但5%和10%SFI處理組間未見顯著差異（圖3b）。Sham組大鼠心肌細胞給予不同濃度的SFI（1.25%，2.5%，5%，10%）處理后，熒光強度隨濃度增加而增大（P＜0.05），5%與10%濃度SFI處理組間未見顯著差異（圖3a）。圖3c顯示，不同濃度SFI處理CHF組后，熒光強度變化的整體趨勢均低于SFI相應濃度處理后的假手術(shù)組。這些結(jié)果表明，參附注射液可增大心肌細胞內(nèi)肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣容量。

圖1 參附注射液對慢性心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響（bar=500nm）

圖2 分離得到的單個心室肌細胞（bar=20μm）

表2 各組大鼠心肌細胞鈣釋放含量的測定（±s，n=6）

表2 各組大鼠心肌細胞鈣釋放含量的測定（±s，n=6）

注：與Sham組0 SFI處理后比較，**P＜0.01；與CHF組0 SFI處理后比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組Sham組CHF組正常細胞外液+參附注射液處理10%SFI 33.40±2.73**7.73±0.86##0 SFI 12.60±2.31 2.28±0.59 1.25%SFI 18.55±1.86**4.89±0.18#2.5%SFI 24.18±1.53**5.23±0.23#5%SFI 31.10±1.27**7.02±0.57##

圖3 參附注射液對心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

4 討論

心力衰竭（簡稱心衰）是一種復雜的臨床綜合征，主要是由于神經(jīng)-體液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)改變等多因素導致的心臟結(jié)構(gòu)或功能異常，導致心臟射血或舒張功能障礙，從而產(chǎn)生以活動耐量受限、肺瘀血以及外周水腫為主要臨床表現(xiàn)的一系列病理生理改變[5-6]。參附注射液由紅參和附子兩味藥構(gòu)成，源自《濟生方》中的參附湯。中醫(yī)學認為人參益氣固脫、大補元氣，附子回陽救逆、補火助陽。靜脈滴注參附注射液，有益氣活血、回陽救脫、強心生脈之效[7]。現(xiàn)代藥理研究表明，人參與附子均具有強心和抗心肌缺血的藥理作用。

本實驗采用氣體麻醉對大鼠行左前降支結(jié)扎術(shù)建立大鼠心力衰竭模型，無需開胸、插管，手術(shù)快、創(chuàng)口小、動物出血少，避免了氣管插管對呼吸道的損傷，減少手術(shù)創(chuàng)傷，提高了模型的存活率，本模型是低心輸出量型心衰模型[1]，經(jīng)歷了從心肌梗死、代償性心肌肥厚到心衰等過程，較好地模擬了充血性心力衰竭的生理病理演變過程。

實驗研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)較假手術(shù)組發(fā)生明顯改變，肌絲排列錯位紊亂或斷裂溶解，線粒體聚集或無規(guī)律零散分布，線粒體發(fā)生腫脹、融合、嵴消失或變短，在線粒體周邊可見較多糖原聚集，提示存在心肌細胞代謝及能量利用障礙。而參附注射液（6ml/kg）按腹腔給藥，每日1次，持續(xù)4周，透射電鏡結(jié)果顯示其可明顯改善心力衰竭大鼠的上述癥狀，提示心肌細胞能量代謝功能改善，可為心肌細胞收縮提供ATP[2，4]，這很可能是其整體心臟功能改善的結(jié)構(gòu)基礎。另一方面，參附注射液處理后的心衰大鼠心功能指標與心衰組相比有明顯改善，LVPWd/LVPWs，LVAWd/LVAWs，LVIDd/LVIDs均明顯減小，而LVEF、LVFS則明顯增大，這一結(jié)果顯示了參附注射液可以有效減輕代償性心肌肥大，從而恢復和改善慢性心衰大鼠的心臟舒張收縮功能。大鼠心肌細胞鈣釋放峰值實驗顯示，心力衰竭組大鼠心肌細胞內(nèi)咖啡因觸發(fā)熒光強度的峰值明顯低于假手術(shù)組，說明心力衰竭組大鼠肌漿網(wǎng)鈣儲量明顯降低，導致收縮期鈣釋放減小，影響心肌的收縮力。經(jīng)一定濃度（1.25%、2.5%、5%、10%）的參附注射液處理后，發(fā)現(xiàn)咖啡因觸發(fā)的鈣釋放熒光強度增強，且呈濃度依賴性，提示參附注射液可能改善心衰心肌細胞的肌漿網(wǎng)鈣儲量，增加收縮期鈣瞬變的幅度，從而增強心肌收縮力，有助于心衰大鼠心功能的恢復。

綜上所述，本實驗從整體動物、細胞以及超微結(jié)構(gòu)等水平都證實了參附注射液可以改善心力衰竭大鼠的心功能，其機制可能是增加肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣含量，減少心衰時心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)損傷，從而達到改善心衰、保護心臟的作用。本研究結(jié)果為參附注射液用于臨床治療心力衰竭提供了新的理論依據(jù)。

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2017-03-24

國家自然科學基金資助項目基于心肌保護蛋白及離子通道的參附藥對“扶陽固脫”改善心衰的配伍機制研究，編號：81373991

#通訊作者：張婷，E-mail：elaine.zt@gmail.com