曹方方，劉靜，彭沖，張娜娜

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266003)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

免疫分型在慢性粒單核細(xì)胞白血病診斷及鑒別中的應(yīng)用

曹方方，劉靜，彭沖，張娜娜

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266003)

目的 分析慢性粒單核細(xì)胞白血病(CMML)的免疫表型，并探討其在CMML診斷及鑒別中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析22例CMML患者、16例健康人、18例反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者及35例急性單核細(xì)胞白血病(AML-M5b)患者骨髓標(biāo)本的免疫表型特點(diǎn)。結(jié)果 AML-M5b患者骨髓幼稚細(xì)胞群明顯高于CMML患者、反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者及健康人(P均<0.01)。CMML患者單核細(xì)胞比例明顯高于AML-M5b、反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者及健康人(P均<0.05)。CMML同時(shí)伴有2個(gè)或多個(gè)抗原異常的比例亦明顯高于反應(yīng)性單核細(xì)胞增多及AML-M5b患者(P<0.05)。此外，CMML與反應(yīng)性單核細(xì)胞增多、AML-M5b患者比較，其骨髓單核細(xì)胞CD56、CD2異常表達(dá)，HLA-DR減弱，CD15表達(dá)減弱及CD14拖尾等差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)免疫分型可用于CMML、反應(yīng)性單核細(xì)胞增多及AML-M5b的鑒別診斷。

流式細(xì)胞術(shù)；免疫分型；反應(yīng)性單核細(xì)胞增多；慢性粒單核細(xì)胞白血??；急性單核細(xì)胞白血病

多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)已廣泛應(yīng)用于急性白血病及淋巴瘤的診斷[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫表型分析在骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes, MDS)診斷及預(yù)后評估方面具有重要作用，故而臨床上多推薦采用免疫表型分析診斷MDS[3]。慢性粒單核細(xì)胞白血病(chronic myelomonocytic leukemia, CMML)是一種克隆性造血髓系腫瘤，具有MDS和骨髓增生性腫瘤(MPD)的雙重特征的異質(zhì)性疾病[4]。另有研究認(rèn)為，CMML的免疫表型特點(diǎn)更傾向于MDS，而不是MPD[5]。目前國內(nèi)關(guān)于免疫表型在CMML診斷及其鑒別的研究少見。本研究對在我院確診的22例CMML患者、18例反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者、35例AML-M5b患者及16例健康人骨髓的免疫表型特點(diǎn)進(jìn)行回顧性分析，為多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在CMML、反應(yīng)性單核細(xì)胞增多、AML-M5b的鑒別診斷提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 收集2012年6月至2017年1月在我院住院的CMML患者22例，男9例，女13例，年齡23～78歲，中位年齡55歲；同期住院的35例AML-M5b患者35例，男18例，女17例，年齡19～67歲，中位年齡49歲；均根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第3版[6]明確診斷。18例反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者，男12例，女6例，年齡18～62歲，中位年齡42歲，其中上呼吸道病毒感染7例、感染性心內(nèi)膜炎8例、結(jié)核3例。以16例骨髓移植捐獻(xiàn)的健康人作為健康人對照，男11例，女5例，年齡10～56歲，中位年齡36歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 標(biāo)本采集 由各專科的臨床醫(yī)師采集各研究對象治療前的骨髓標(biāo)本2～3 mL，肝素鈉抗凝，標(biāo)本置于室溫保存。24 h內(nèi)完成試驗(yàn)。

1.3 儀器及試劑 Cytomics FC500多參數(shù)流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)。標(biāo)記的熒光素包括FITC(異硫氰酸熒光素)，PE(藻紅蛋白熒光素)，熒光素(PE-Cy5，PC5)，熒光素(PE-TexasRed，ECD)，鼠抗人IgG1，CD45，CD7，CD33，CD19，CD4，CD14，CD64，CD34，CD117，HLA-DR，CD11b，CD13，CD16，CD15，CD56，CD2，CD5單克隆抗體及溶血素均購自Beckman Coulter公司。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測 試管中分別加入各研究對象的骨髓標(biāo)本50～60 μL，并分別加入1.3中的相應(yīng)抗體各10 μL，混勻后室溫避光反應(yīng)15 min。加入500 μL溶血素，混勻后室溫靜置10 min， PBS洗滌1次，1 000 r/min離心5 min后棄上清。加入500 μL PBS重懸并上機(jī)檢測，用CXP軟件獲取細(xì)胞100 000個(gè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用CD45/SSC雙參數(shù)設(shè)門，計(jì)算淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、幼稚細(xì)胞、有核紅細(xì)胞各群比例，并進(jìn)一步分析異常細(xì)胞群的免疫表型特點(diǎn)。骨髓單核細(xì)胞各分期依據(jù)Loken等[7]判定標(biāo)準(zhǔn)?？乖磉_(dá)減弱的界定標(biāo)準(zhǔn)：分析細(xì)胞群中至少20%的細(xì)胞抗原表達(dá)低于健康人骨髓標(biāo)本中該抗原表達(dá)強(qiáng)度的0.5個(gè)log以上。

2 結(jié)果

2.1 骨髓細(xì)胞比例分析結(jié)果 AML-M5b患者骨髓幼稚細(xì)胞群明顯高于CMML患者、反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者及健康人(P<0.01)。反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者及CMML患者骨髓成熟單核細(xì)胞比例亦明顯高于健康人骨髓及AML-M5b患者(P<0.05)，且CMML患者成熟單核細(xì)胞比例明顯高于反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者(P<0.01)。見表1。

2.2 骨髓單核細(xì)胞群免疫表型分析結(jié)果 異?？乖磉_(dá)頻數(shù)分析結(jié)果表明，CMML與反應(yīng)性單核細(xì)胞增多、AML-M5b患者比較，其骨髓單核細(xì)胞CD56、CD2異常表達(dá)、HLA-DR減弱、CD15表達(dá)減弱及CD14拖尾等差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

見表2。此外，22例CMML患者均檢測到至少1種抗原異常，明顯高于的反應(yīng)性單核細(xì)胞增多及AML-M5b患者(P<0.05)，而后兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CMML存在2種及以上抗原表達(dá)異常率明顯高于反應(yīng)性單核細(xì)胞增多及AML-M5b患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而后兩者間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組骨髓幼稚細(xì)胞及成熟單核細(xì)胞比例±s),%]

注：*，與健康人對照組比較，P<0.05；#，與反應(yīng)性單核細(xì)胞增多組比較,P<0.05；$，與AML-M5b組比較，P<0.05；&，與CMML組比較，P<0.05。

表2 CMML、反應(yīng)性單核細(xì)胞增多、AML-M5b患者單核細(xì)胞異常抗原表達(dá)[n(%)]

3 討論

免疫表型分析可揭示MDS患者骨髓細(xì)胞高頻率的異常表達(dá)模式，包括CD45和散射光側(cè)向角(side scatter, SSC)減弱、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞群跨系抗原表達(dá)及CD15，CD33，CD13，HLA-DR表達(dá)減弱、粒細(xì)胞群CD11b-CD16、CD13-CD16關(guān)系異常等，因此，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在MDS診斷中具有重要的作用[8-9]。本研究通過分析免疫表型在CMML診斷及鑒別中的臨床價(jià)值，發(fā)現(xiàn)AML-M5b患者骨髓幼稚單核細(xì)胞比例較CMML及反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者及健康人均明顯升高。CMML患者骨髓成熟單核細(xì)胞比例明亦明顯高于反應(yīng)性單核細(xì)胞增多、AML-M5b患者及健康人，結(jié)果與臨床常規(guī)檢測時(shí)CMML患者外周血單核細(xì)胞絕對值明顯升高較為一致。

既往在MPD及MDS的研究中多采用健康人骨髓標(biāo)本作為對照，為了確定觀察到的抗原異常是否為惡性髓性疾病所特有的，本研究增加了反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者為疾病對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者骨髓中成熟單核細(xì)胞也可表現(xiàn)出異常的免疫表型，包括CD56、CD2跨系表達(dá)及CD13及HLA-DR表達(dá)減弱等。但由于病例資料限制，且本研究未加入MDS病例進(jìn)行比較，結(jié)論尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示，CMML患者成熟單核中細(xì)胞CD2及CD56異常表達(dá)率明顯高于反應(yīng)性單核細(xì)胞增多及AML-M5b患者，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果較為一致[10]。但另有研究證實(shí)，CD2和CD56異常表達(dá)并不能作為CMML診斷的特異性標(biāo)志物，因反應(yīng)性單核細(xì)胞增多及急性白血病也存在CD2及CD56的異常表達(dá)[11]。因此，必須同時(shí)結(jié)合其他抗原表達(dá)異常的改變(如CD13、CD15和HLA-DR表達(dá)減弱等)。本研究發(fā)現(xiàn)，HLA-DR減弱在反應(yīng)性單核細(xì)胞增多及CMML患者骨髓中均可檢測到，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因可能與納入的標(biāo)本例數(shù)不足有關(guān)；另外，還發(fā)現(xiàn)CMML患者HLA-DR表達(dá)減弱率明顯高于AML-M5b。文獻(xiàn)報(bào)道，AML-M5b也可出現(xiàn)HLA-DR減弱或缺失，極易被漏診或誤診[12]，與本研究結(jié)果較為類似。分析原因可能為細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)障礙造成HLA-DR表達(dá)減弱[13]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)健康人及反應(yīng)性單核細(xì)胞增多患者也可存在CD14拖尾的單核細(xì)胞，但其比例均低于單核細(xì)胞群(20%)，可能作為區(qū)別CMML及反應(yīng)性單核細(xì)胞增多的重要指標(biāo)之一。AML-M5b患者可出現(xiàn)抗原表達(dá)不同步現(xiàn)象而導(dǎo)致CD14不同程度的非同步表達(dá)現(xiàn)象，但本研究在分析成熟單核細(xì)胞CD14抗原表達(dá)時(shí)未進(jìn)一步分析比較。

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(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.09

曹方方，1987年生，女，主管技師，碩士，主要從事血液病診斷工作。

張娜娜，主管技師，碩士，E-mail：nana7812@163.com。

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2017-01-04)